電活性生物膜通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)骨再生修復(fù)的體外研究

朱培君 賴春花 程鳴威 何逸恒 徐淑蘭

南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院種植中心（廣州510300）

口腔種植是牙頜系統(tǒng)重建的首選修復(fù)方案［1］。種植術(shù)區(qū)充足的骨量是實(shí)現(xiàn)骨整合的必要條件［2］，而炎癥、外傷等原因造成的牙列缺損常伴骨組織缺損。臨床上常應(yīng)用引導(dǎo)骨組織再生術(shù)（guided bone regeneration，GBR）修復(fù)骨缺損，該術(shù)式創(chuàng)傷小且操作方便，規(guī)避了植骨手術(shù)高并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)［3］。然而，臨床常用的GBR 屏障膜缺乏成骨誘導(dǎo)性能，對(duì)于嚴(yán)重骨缺損的修復(fù)效果不佳，具備成骨誘導(dǎo)性能的屏障膜是解決GBR 術(shù)弊端的核心［4］。關(guān)于材料成骨誘導(dǎo)性能的研發(fā)，目前的研究熱點(diǎn)集中于生物材料調(diào)控骨缺損區(qū)的免疫環(huán)境向有利于骨再生的方向發(fā)展，招募更多的骨原細(xì)胞，并促進(jìn)骨礦化及重建［5］。此理念源自于骨免疫學(xué)說(shuō)，生物材料植入機(jī)體后，將不可避免地引發(fā)免疫反應(yīng)，巨噬細(xì)胞作為首先接觸生物材料的免疫細(xì)胞之一，在生物材料植入后將轉(zhuǎn)換為M1 促炎分型以行使“清道夫”的功能，而M2 抗炎型巨噬細(xì)胞分泌的抗炎因子和成骨因子在后期的骨愈合過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［6-8］。巨噬細(xì)胞M1/M2 表型的轉(zhuǎn)換決定了骨缺損修復(fù)生物材料周圍的炎癥程度及其骨修復(fù)效果，所以利用具備免疫調(diào)節(jié)性能的生物材料調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M2 極化，營(yíng)造有利于成骨分化的免疫環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)骨組織再生的研究思路是生物材料研發(fā)的創(chuàng)新導(dǎo)向，學(xué)者們將此性能稱之為生物材料的骨免疫調(diào)節(jié)性能［9-10］。

研究表明，表面電荷可以調(diào)控巨噬細(xì)胞M2 極化［11］、減低巨噬細(xì)炎癥反應(yīng)而應(yīng)用于腎臟再灌注損傷的治療［12］，基于表面電荷對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用，本課題以研發(fā)一種能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞M2 極化的屏障膜為目的，已知P（VDF?TrFE）膜是一種適用于組織再生的電活性材料，利用其高壓極化后表面帶電的鐵電性能［13］，本研究制備帶電的P（VDF?TrFE）膜，以不帶電的P（VDF?TrFE）膜為對(duì)照組，明確帶電P（VDF?TrFE）膜對(duì)巨噬細(xì)胞M2 極化的影響，并構(gòu)建多細(xì)胞共培養(yǎng)體系，進(jìn)一步探究帶電P（VDF?TrFE）膜介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞環(huán)境下，BM?SCs 的成骨活性改變。為骨免疫調(diào)節(jié)性的新型生物材料的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 帶電P（VDF?TrFE）膜的制備及材料學(xué)表征P（VDF?TrFE）聚合物粉末溶于N，N?二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，攪拌至粉末完全溶解。溶液在鈦片成膜后放置于馬弗爐中，升溫后退火結(jié)晶，冷卻至室溫，即獲得P（VDF?TrFE）薄膜。將P（VDF?TrFE）膜放置于銅槽中，浸在二甲基硅油中，采用油浴極化的方法，在6 kV/cm、120 ℃條件下極化1 h，清洗、干燥備用。實(shí)驗(yàn)分組：P（VDF?TrFE）膜經(jīng)高壓極化后可形成帶電表面，分為帶電P（VDF?TrFE）膜（charged P（VDF?TrFE）membrane，CF）和不帶電P（VDF?TrFE）膜（uncharged P（VDF?TrFE）membrane，UF）兩組。

采用掃描電子顯微鏡觀察并分析P（VDF?TrFE）膜的表面形貌和微觀尺寸；采用準(zhǔn)靜態(tài)D33 測(cè)量?jī)x檢測(cè)P（VDF?TrFE）膜的壓電常數(shù)D33。采用Zeta電位檢測(cè)儀測(cè)量P（VDF?TrFE）膜的表面電勢(shì)。

1.2 P（VDF?TrFE）膜上的巨噬細(xì)胞的M2表型檢測(cè)

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組將小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7（來(lái)源：ATCC 細(xì)胞庫(kù)）培養(yǎng)于10%胎牛血清（FBS）和1%青/鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，并置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合至80%，胰蛋白酶消化，在P（VDF?TrFE）膜上以5×104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度進(jìn)行細(xì)胞接種，分組同材料分組。

1.2.2 細(xì)胞增殖無(wú)菌消毒處理后的P（VDF?TrFE）膜置于12孔板中，將巨噬細(xì)胞接種至P（VDF?TrFE）膜表面，3、5 d 后終止培養(yǎng)，將P（VDF?TrFE）膜用無(wú)菌鑷子取出放置于新的12 孔板中，PBS 漂洗，加入含10%細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)試劑盒?8（cell counting kit?8，CCK?8）試劑，孵育2 h，取上清液于96 孔板中，采用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 波長(zhǎng)下的吸光度。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)將巨噬細(xì)胞接種至P（VDF?TrFE）膜表面，在培養(yǎng)3、5 d后，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，洗滌，透化。加入染料4，6?聯(lián)脒?2?苯基吲哚及熒光素異硫氰酸酯，對(duì)細(xì)胞核及骨架進(jìn)行染色。避光孵育40 min 后，將膜轉(zhuǎn)至載玻片上，封片，觀察并采集圖像。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的M2 極化分型將細(xì)胞細(xì)胞接種至P（VDF?TrFE）膜表面，培養(yǎng)3、5 d 后，重懸洗滌，以每流式管1 × 106個(gè)細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)，100 μL 含0.1%BSA 的PBS 重懸；向各管細(xì)胞中依次加入2 μL PE 標(biāo)記的小鼠CD206（M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物）抗體，采用Cytoflex 流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT?PCR）檢測(cè)M2表型相關(guān)基因?qū)⒓?xì)胞接種至P（VDF?TrFE）膜表面，培養(yǎng)3、5 d 后提取RNA 并逆轉(zhuǎn)錄，采用熒光定量PCR 儀進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增，檢測(cè)M2 型巨噬細(xì)胞的相關(guān)基因精氨酸酶?1（arginase?1，Arg?1）、白介素?10（interleukin?10，IL?10）的mRNA 表達(dá)水平（引物序列見表1）。采用相對(duì)定量法分析結(jié)果。

表1 qRT?PCR 引物Tab.1 Primers for qRT?PCR

1.3 條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)對(duì)rBMSCs的成骨活性的影響

1.3.1 條件培養(yǎng)基的配制為了構(gòu)建P（VDF?TrFE）膜、巨噬細(xì)胞、BMSCs的間接共培養(yǎng)體系，將巨噬細(xì)胞按上述方式接種于P（VDF?TrFE）膜上，收集培養(yǎng)體系的上清液，1 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄沉淀，上清液與DMEM/F12 完全培養(yǎng)基以1∶1 的比例混合配制，即獲得P（VDF?TrFE）膜?巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM），-80 ℃保存待用。

1.3.2 rBMSCs 的培養(yǎng)將rBMSCs（來(lái)源：ATCC細(xì)胞庫(kù)）培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。取3 ～6 代的rBMSCs 以1 × 105的細(xì)胞密度接種于六孔板中，待細(xì)胞穩(wěn)定后，將完全培養(yǎng)基替換為P（VDF?TrFE）膜?巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基，根據(jù)材料分組，分為帶電P（VDF?TrFE）膜（CF）和不帶電P（VDF?TrFE）膜（UF）兩組。

1.3.3 ALP 染色條件培養(yǎng)基刺激誘導(dǎo)rBMSCs的第7 天，終止培養(yǎng)，PBS 洗滌，4%多聚甲醛固定后洗滌，加入染色劑，搖床上孵育1 h，雙蒸水終止染色后，顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 茜素紅定性染色及定量檢測(cè)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)刺激rBMSCs 的第14 天，終止培養(yǎng)，雙蒸水洗滌后固定細(xì)胞，加入茜素紅染色劑，搖床上孵育30 min，洗滌，顯微鏡觀察并拍照，最后于六孔板中加入1 mL 的10%十六烷基吡啶溶液/孔，酶標(biāo)儀檢測(cè)562 nm 波長(zhǎng)下的吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0記錄并分析，正態(tài)分布資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P（VDF?TrFE）膜的材料學(xué)檢測(cè)表面形貌結(jié)果（圖1A）顯示本實(shí)驗(yàn)所制備的P（VDF?TrFE）膜表面均勻且致密，存在少量微孔隙，兩組表面形貌無(wú)明顯差異；為了表征材料的電學(xué)性能，檢測(cè)P（VDF?TrFE）膜的壓電常數(shù)D33，帶電、不帶電P（VDF?TrFE）膜壓電常數(shù)D33 分別為（-10 ±0.06）pC/N、（0±0.02）pC/N；Zeta 電位檢測(cè)表征材料表面電荷，結(jié)果見圖1B。

圖1 不帶電、帶電P（VDF?TrFE）膜的材料表征Fig.1 Characterization of uncharged and charged P（VDF?TrFE）membrane

2.2 P（VDF?TrFE）膜上巨噬細(xì)胞的行為改變

2.2.1 細(xì)胞增殖P（VDF?TrFE）膜上巨噬細(xì)胞的CCK?8 檢測(cè)結(jié)果見圖2A，培養(yǎng)第3 天，帶電、不帶電P（VDF?TrFE）膜的細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而到培養(yǎng)的第5 天，帶電P（VDF?TrFE）膜組的巨噬細(xì)胞增殖情況優(yōu)于不帶電組（P＜0.05）。

2.2.2 細(xì)胞形態(tài)圖2B 為巨噬細(xì)胞在帶電、不帶電P（VDF?TrFE）膜上的形態(tài)圖，巨噬細(xì)胞在刺激培養(yǎng)的第3 天，在P（VDF?TrFE）膜上表現(xiàn)為圓形的正常形態(tài)，帶電膜表面的巨噬細(xì)胞偶見伸長(zhǎng)的形態(tài)；在細(xì)胞培養(yǎng)的第5 天，不帶電膜表面的細(xì)胞仍保持圓形形態(tài)，而帶電P（VDF?TrFE）膜上的細(xì)胞胞體向兩級(jí)伸長(zhǎng)。

2.2.3 巨噬細(xì)胞的M2 極化分型巨噬細(xì)胞在不帶電、帶電P（VDF?TrFE）膜上的M2 表型檢測(cè)結(jié)果如圖3A，圖中陰性對(duì)照組（negative control）是未加入抗體的細(xì)胞空白對(duì)照組，培養(yǎng)第3 天，CD206 陽(yáng)性細(xì)胞率分別為2.28%和2.31%。培養(yǎng)第5 天，相比于不帶電P（VDF?TrFE）膜（2.4%），帶電P（VDF?TrFE）膜上的M2 型巨噬細(xì)胞（32.7%）占多數(shù)。

2.2.4 巨噬細(xì)胞M2表型相關(guān)基因的表達(dá)水平巨噬細(xì)胞在P（VDF?TrFE）膜上的基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果（圖3B）顯示，P（VDF?TrFE）膜刺激巨噬細(xì)胞第3 天后，兩組基因表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在培養(yǎng)的第5 天，相比于不帶電膜，帶電P（VDF?TrFE）膜上的巨噬細(xì)胞較高地表達(dá)Arg?1、IL?10 等M2 表型相關(guān)基因（P＜0.05）。

2.3 條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)對(duì)rBMSCs 成骨活性的影響

圖2 巨噬細(xì)胞在不帶電、帶電P（VDF?TrFE）膜上的行為改變Fig.2 Behavioral changes of macrophage on uncharged and charged P（VDF?TrFE）membrane

2.3.1 ALP染色分別用帶電、不帶電P（VDF?TrFE）膜?巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)rBMSCs，7 d 后ALP染色的結(jié)果如圖4A，相比于不帶電組組，帶電P（VDF?TrFE）膜條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)下的rBMSCs 周圍可見更多的藍(lán)染物質(zhì)，顏色較對(duì)照組深。

2.3.2 茜素紅染色及定量分析結(jié)果結(jié)果如圖4B，相比于不帶電組，帶電組條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的rBMSCs 周圍可見大量紅褐色結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)體積較大且分布廣泛，茜素紅染色的半定量檢測(cè)結(jié)果與染色結(jié)果一致（P＜0.05）。

3 討論

口腔頜面部的大面積骨缺損嚴(yán)重影響患者的語(yǔ)音、吞咽及咀嚼功能，成為口腔頜面臨床修復(fù)亟待解決的難題［14］。引導(dǎo)骨組織再生術(shù)作為臨床上最有效的骨增量方式之一，即是采用具備物理屏障作用的屏障膜覆蓋于骨缺損區(qū)上，阻擋軟組織細(xì)胞長(zhǎng)入缺損區(qū)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，為骨缺損區(qū)的修復(fù)再生創(chuàng)造穩(wěn)定而無(wú)干擾的空間［15］。由于大面積骨缺損缺乏自愈的潛力，臨床上對(duì)修復(fù)此類骨缺損的屏障膜提出更高的要求，即在發(fā)揮物理屏障作用的同時(shí)，兼具促進(jìn)骨再生的生物活性。為了研發(fā)新型骨缺損修復(fù)材料，并鑒于免疫細(xì)胞對(duì)骨再生的重要調(diào)控作用，學(xué)者們提出了生物材料通過(guò)改變免疫環(huán)境間接促進(jìn)成骨的性能即骨免疫調(diào)節(jié)性能［16-17］，并闡明了機(jī)體的成骨活動(dòng)是由多細(xì)胞、多系統(tǒng)共同參與的［18］，利用單細(xì)胞體外模型來(lái)驗(yàn)證生物材料的成骨效能的研究思路過(guò)于單一，生物材料通過(guò)介導(dǎo)免疫細(xì)胞行為變化調(diào)控成骨分化的思路才更符合體內(nèi)成骨過(guò)程。

圖3 不帶電、帶電P（VDF?TrFE）膜上巨噬細(xì)胞M2 極化表型檢測(cè)Fig.3 The deteetion of M2 phenotype macrophage on uncharged and charged P（VDF?TrFE）membrane

圖4 rBMSCs 成骨活性檢測(cè)Fig.4 Detection of osteogenic activity of rBMSCs

巨噬細(xì)胞是生物材料植入機(jī)體內(nèi)首先接觸的免疫細(xì)胞［19］。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了巨噬細(xì)胞對(duì)骨再生的體內(nèi)外調(diào)控作用［20-21］，生物材料誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 極化的功能在骨缺損修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，M2 型巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌抗炎因子IL?10、Arg?1 和成骨因子增強(qiáng)成骨活性［22］。誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 極化的生物材料設(shè)計(jì)理念被廣泛應(yīng)用于屏障膜、種植體表面處理等研究中［23-24］。其中巨噬細(xì)胞具備高度可塑性，表面電荷對(duì)巨噬細(xì)胞M2 極化發(fā)揮一定的調(diào)控作用［25］，本課題將表面電荷對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用引入屏障膜的設(shè)計(jì)研發(fā)中，制備攜帶表面電荷的P（VDF?TrFE）生物膜并檢測(cè)其對(duì)巨噬細(xì)胞極化及后繼成骨分化的影響。

本實(shí)驗(yàn)制備的膜材料具有均勻且致密的形貌，這符合臨床屏障作用的要求，并且膜上的微觀孔隙也是屏障膜傳輸營(yíng)養(yǎng)的通道，CCK?8 檢測(cè)結(jié)果也提示了帶電P（VDF?TrFE）膜的良好生物相容性，可知帶電P（VDF?TrFE）膜符合臨床屏障膜的基本要求。壓電常數(shù)D33 和Zeta 電位檢測(cè)結(jié)果提示著帶電P（VDF?TrFE）膜的成功制備。巨噬細(xì)胞在帶電P（VDF?TrFE）膜刺激下，細(xì)胞胞體向兩級(jí)伸長(zhǎng)，此形態(tài)與其M2 極化相關(guān)［26］。流式、PCR 結(jié)果表明了帶電P（VDF?TrFE）膜能有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2 極化，增加抗炎IL?10 基因的表達(dá)。利用上清液制取條件培養(yǎng)基的間接共培養(yǎng)模型被廣泛應(yīng)用于生物材料骨免疫調(diào)節(jié)性能的研究中［16］，本實(shí)驗(yàn)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)刺激rBMSCs 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，ALP 和茜素紅染色分別提示著帶電膜?巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基能有效增加rBMSCs 的早期和晚期成骨活性，闡明了帶電P（VDF?TrFE）膜通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)BMSCs 成骨分化的作用。

本實(shí)驗(yàn)以研發(fā)促進(jìn)成骨分化的屏障膜為目的，考慮到生物材料植入后的多細(xì)胞參與體系及免疫細(xì)胞在成骨活動(dòng)中的重要作用，以研究電活性生物膜的骨免疫調(diào)節(jié)性能為導(dǎo)向，構(gòu)建膜、巨噬細(xì)胞、BMSCs 的共培養(yǎng)體系，成功驗(yàn)證了帶電P（VDF?TrFE）膜對(duì)巨噬細(xì)胞M2極化的促進(jìn)作用，提示了帶電P（VDF?TrFE）膜介導(dǎo)的M2 極化對(duì)BMSC成骨分化的積極影響，這對(duì)于兼具免疫調(diào)節(jié)性能及促成骨性能生物材料的研發(fā)具有指導(dǎo)性意義，為屏障膜的優(yōu)化設(shè)計(jì)提供創(chuàng)新性思路。