室內(nèi)飼養(yǎng)松墨天牛幼蟲不同腸段細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及功能分析

陳宏健，郝德君*，田 敏，周 楊，夏小洪，趙欣怡，喬 恒，談家金

(1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.上海市松江區(qū)林業(yè)站，上海 201600)

昆蟲是目前已知動物中種類最多、分布最廣、生物量最大的類群[1]，在長期進(jìn)化過程中，與多種微生物包括病毒、細(xì)菌、真菌、原生動物、線蟲等相互選擇、相互適應(yīng)，形成了密切的共生關(guān)系[2-3]。昆蟲腸道微生物影響共生微生物與宿主關(guān)系的各個方面，例如病原、偏利共生、共棲和互惠共生等[4-5]。昆蟲的腸道作為食物消化、營養(yǎng)吸收和代謝的重要場所，棲居著大量的微生物，由于前、中、后腸不同腸段的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、微生態(tài)環(huán)境或功能存在差異，因而會影響腸道微生物的生長、群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而不同程度地影響宿主昆蟲的生長發(fā)育、生理代謝、生殖和免疫等生命活動[6-9]。因此，研究昆蟲腸道微生物在昆蟲與共生微生物相互適應(yīng)、協(xié)同進(jìn)化，以及共生微生物與宿主免疫和代謝機(jī)制等方面具有理論價值，對闡明農(nóng)林重要害蟲的致病機(jī)理，發(fā)掘和利用腸道微生物潛在的功能具有重要意義。

天牛和小蠹等蛀干害蟲大部分時間生活于樹體內(nèi)，從寄主植物中獲取生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)。然而，樹木中的葡萄糖以纖維素、半纖維素、葡聚糖和果膠等復(fù)雜的多糖聚合物存在，氮素含量相對不足，植物細(xì)胞壁蛋白質(zhì)與木質(zhì)素和纖維素形成結(jié)合蛋白難以利用[10]。蛀干昆蟲往往通過利用腸道共生細(xì)菌產(chǎn)生纖維素或半纖維素酶[11]，或者提高宿主昆蟲體內(nèi)相關(guān)消化酶活性進(jìn)而分解木質(zhì)纖維素獲得所需的葡萄糖[12]。同時，萜類化合物是松屬植物重要的組成性和誘導(dǎo)性化學(xué)防御物質(zhì)[13]，蛀干害蟲可以利用腸道細(xì)菌降解針葉樹萜類物質(zhì)[14-15]，以提高昆蟲對寄主適應(yīng)性。

松墨天牛(Monochamusalternatus)在我國是危害針葉樹的重要蛀干害蟲，也是松材線蟲病擴(kuò)散的主要媒介[16-18]。松墨天牛幼蟲主要鉆蛀取食生長衰弱木的韌皮部和木質(zhì)部，成蟲取食1～2年生枝條[19]。雖然已有關(guān)于食料、幼蟲不同發(fā)育階段和蟲態(tài)影響松墨天牛腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究[20-21]，但是關(guān)于松墨天牛不同腸段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其在不同理化條件下的功能研究鮮見報道。筆者在松墨天牛幼蟲不同腸段細(xì)菌群落及野外種群相關(guān)研究[22]的基礎(chǔ)上，以室內(nèi)飼養(yǎng)的松墨天牛4齡幼蟲為對象，對前、中和后腸各腸段的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其潛在功能進(jìn)行分析，為深入揭示腸道細(xì)菌在松墨天牛獲取營養(yǎng)、克服寄主植物化學(xué)防御的機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

松墨天牛成蟲采自江蘇省鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)感染松材線蟲病的馬尾松林，帶回南京林業(yè)大學(xué)昆蟲生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室后，喂食健康的1～2年生馬尾松枝條供其補(bǔ)充營養(yǎng)。待雌雄成蟲交配后，以馬尾松木段供其產(chǎn)卵，定期收集卵粒并轉(zhuǎn)移至半人工飼料(配方：馬尾松木屑100 g、瓊脂40 g、蔗糖20 g、酵母粉12.5 g、安息香酸鈉2 g、山梨酸鉀1 g、0.5 mol/L的硫酸10 mL、麥胚粉25 g、膽固醇1.5 g、抗壞血酸4 g、酪蛋白20 g、氯化膽堿1 g、無菌水800 mL)，參考陳瑞旭等[23]方法進(jìn)行人工飼養(yǎng)。選取人工飼養(yǎng)獲得的4齡幼蟲作為供試?yán)ハx。

1.2 松墨天牛幼蟲腸道分離

取健康的松墨天牛4齡幼蟲15頭，先用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇表面消毒1 min，再用無菌水沖洗2次，消除殘留乙醇。在無菌條件下，用解剖剪刀和尖鑷剪開幼蟲體表，取出完整腸道，分離前腸、中腸、后腸。3個腸段分別置于裝有0.5 mL PBS緩沖液的1.5 mL滅菌離心管中，每管5頭幼蟲為1個重復(fù)，每個腸段3管(3個重復(fù))。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

使用CTAB法提取腸道細(xì)菌總DNA[24-25]，利用Nanodrop 2000C (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)評估DNA濃度，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度。以提取的細(xì)菌總DNA為模板，采用16S rDNA的V3-V4區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為341F (5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3)和806R (5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3)。PCR反應(yīng)體系(30 μL)：2×Phusion Master Mix 15 μL，2 μmol/L上下游引物各1.5 μL，DNA模板10 ng，ddH2O 2 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃ 預(yù)變性1 min，98 ℃ 變性10 s，50 ℃ 退火30 s，72 ℃ 復(fù)性30 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，PCR儀采用Bio-rad T100 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。

1.4 文庫構(gòu)建和高通量測序

采用NEB Next? UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, Ipswich, MA, USA)試劑盒完成文庫的構(gòu)建，具體步驟：①連接“Y”字形接頭；②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；③利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集；④氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。經(jīng)過 Qubit 定量和文庫檢測合格后，利用 Illumina HiSeq 2500平臺進(jìn)行雙端測序。

1.5 序列數(shù)據(jù)分析

使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，F(xiàn)LASH軟件拼接[26]：①設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端所有序列，之后再去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列；②根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將兩端序列進(jìn)行拼接，拼接時overlap之間的最大錯配率為0.2，長度需大于10 bp。去除無法拼接的序列。③根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物將序列區(qū)分樣本，調(diào)整序列方向，barcode需精確匹配，引物允許2個堿基的錯配，去除存在模糊堿基的序列。

使用USEARCH 7.1軟件(http://drive5.com/uparse/)對序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)聚類[27]：①對優(yōu)化序列提取非重復(fù)序列，便于降低分析中間過程冗余計(jì)算量；②去除沒有重復(fù)的單序列；③按照97%相似性對非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列；④將所有優(yōu)化序列映射至OTU代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 對每條序列進(jìn)行物種分類注釋[28]，比對Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123)，設(shè)置比對閾值70%，最后利用R 3.5.1軟件分別在門和屬分類水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成及物種豐度情況，同時繪制Venn圖統(tǒng)計(jì)樣本的OTU組成相似性及重疊情況。

采用Alpha多樣性分析反映微生物群落的豐富度和多樣性，用Mothur 1.30.1(http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)指數(shù)分析[29]計(jì)算各樣本的菌群豐富度(Ace和Chao指數(shù))以及菌群多樣性(Shannon和Simpson指數(shù))，并根據(jù)Shannon指數(shù)繪制稀釋性曲線。采用Beta多樣性分析研究不同樣本菌群結(jié)構(gòu)的相似性或差異關(guān)系，用Qiime計(jì)算Beta多樣性距離矩陣，根據(jù)距離矩陣進(jìn)行層級聚類分析，使用UPGMA算法和R 3.5.1 軟件構(gòu)建樣本層級聚類樹。

1.6 腸道菌群功能分析

采用PICRUSt軟件預(yù)測松墨天牛幼蟲腸道菌群功能[30]。首先，對OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，去除16S marker gene在物種基因組中拷貝數(shù)目的影響；通過每個OTU 對應(yīng)的greengene ID，對OTU進(jìn)行KEGG功能注釋，獲得OTU在KEGG各功能水平的注釋信息及各功能在不同樣本中的豐度。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

Alpha多樣性指數(shù)和KEGG功能通路豐度采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，使用Tukey HSD或Tamhane’s T2進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 松墨天牛幼蟲各腸段細(xì)菌16S rDNA序列拼接和組裝分析

從松墨天牛幼蟲3個腸段的9個樣本中共獲得797 952條細(xì)菌16S rDNA原始序列讀數(shù)，經(jīng)過質(zhì)量過濾和去除嵌合體后，得到643 404條高質(zhì)量序列，每條序列平均長度為416.2 bp。按照最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的1 614個OTUs，總共注釋到35門、63綱、137目、250科、554屬和844種。

2.2 松墨天牛幼蟲各腸段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

各腸段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析見圖1。

LF.前腸foregut；LM.中腸midgut；LH.后腸hindgut。下同。The same below.圖1 松墨天牛幼蟲前、中、后腸細(xì)菌OTUs的韋恩圖Fig.1 A venn diagram of OTUs of bacteria in the foregut, midgut, hindgut of larvae of M. alternatus

由圖1可知，松墨天牛幼蟲腸道的OTU數(shù)量從前腸到后腸依次遞增，前腸最少，僅有818個OTUs；中腸有951個OTUs；后腸最多，有1 031個OTUs。3個腸段共有的OTUs為360個，其中前腸和中腸共有的OTUs為76個，前腸和后腸共有的OTUs為88個，中腸和后腸共有的OTUs為302個，表明各腸段的細(xì)菌群落組成之間存在相似性，并且在組成上具有連續(xù)性。前、中、后腸各自特有的OTUs分別為294、213和281個，表明各腸段在細(xì)菌群落的組成上存在差異。

各腸段細(xì)菌優(yōu)勢門和屬的相對豐度見圖2。

圖2 松墨天牛幼蟲前、中、后腸細(xì)菌優(yōu)勢門(A)和 屬(B)的相對豐度Fig.2 Relative abundances of dominant phyla (A) and genera (B) of bacteria in the foregut, midgut, hindgut of larvae of M. alternatus

在門水平上(圖2A)，3個腸段中細(xì)菌豐度排序?yàn)樽冃尉T、厚壁菌門、未分類門、擬桿菌門和藍(lán)細(xì)菌門，豐度占松墨天牛幼蟲腸道細(xì)菌的98%。這些優(yōu)勢門在前、中、后腸中所占比例不同，變形菌門在3個腸段分別為81.01%、86.27%、82.63%，為絕對優(yōu)勢類群；其次為厚壁菌門，占比分別為6.60%、7.38%、5.81%，未分類門分別為11.02%、3.07%、5.41%，擬桿菌門占比分別為0.36%、1.56%、2.60%，藍(lán)細(xì)菌門占比分別為0.06%、0.81%、2.04%，在所有腸段中占比較少，其他細(xì)菌分別為0.94%、0.90%、1.51%。

在屬水平上(圖2B)，豐度排序前10名的各優(yōu)勢屬在前、中、后腸中所占比例分別為沙雷氏菌屬(7.73%、53.77%、26.72%)，葡糖桿菌屬(47.44%、6.55%、22.83%)，未分類屬(4.30%、18.40%、2.61%)，未分類(11.02%、3.07%、5.41%)，醋酸桿菌屬(9.98%、1.03%、5.07%)，產(chǎn)堿桿菌屬(0.001%、1.57%、8.30%)，腸桿菌屬(6.66%、0.50%、0.45%)，芽孢桿菌屬(4.47%、0.75%、0.43%)，假單胞菌屬(0.61%、0.80%、3.39%)和黃單胞菌屬(0.002%、0.003%、3.59%)。各腸段中主要優(yōu)勢屬的種類雖然相同，但其豐度所占比例有較大差異。

2.3 松墨天牛幼蟲各腸段細(xì)菌多樣性分析

松墨天牛幼蟲各腸段3個重復(fù)樣本的細(xì)菌多樣性分析見圖3。由圖3可知，基于Shannon指數(shù)的稀釋性曲線趨于平緩，增加數(shù)據(jù)量產(chǎn)生的新 OTU很少，說明測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度足夠。

圖3 松墨天牛幼蟲前、中、后腸細(xì)菌Shannon指數(shù)稀釋曲線Fig.3 The rarefaction curve of Shannon indexes of bacteria in the foregut, midgut, hindgut of larvae of M. alternatus

通過比較松墨天牛幼蟲前、中、后腸中細(xì)菌Alpha多樣性的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)(表1)，發(fā)現(xiàn)各腸段在菌群豐度上存在差異，在菌群多樣性上無差異。前腸的Ace與Chao指數(shù)均低于中腸和后腸，說明中、后腸的菌群豐富度高于前腸，而中、后腸之間無顯著差異。各腸段之間的Simpson指數(shù)沒有差異，前腸與中腸、后腸之間Shannon指數(shù)均沒有顯著差異，僅后腸的Shannon指數(shù)顯著高于中腸，表明3個腸段的菌群多樣性相似。

表1 松墨天牛幼蟲前、中、后腸細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)

通過構(gòu)建Beta多樣性的樣本層級聚類樹，探索不同分組樣本間菌群組成的相似性或差異性。采用Bray-Curtis的加權(quán)距離算法，同時考慮物種有無和物種豐度對聚類產(chǎn)生的影響。研究結(jié)果如圖4所示，可知前、中、后腸分別聚成3簇，相互之間無交叉，說明3個腸段的細(xì)菌群落組成存在差異。此外，前腸成為獨(dú)立于中腸和后腸之外的一簇，表明前腸的菌群組成與中后腸差異較大，而中腸與后腸的菌群組成較相近。比較3個腸段的優(yōu)勢OTU發(fā)現(xiàn)，OTU223為前腸的核心種，占絕大多數(shù)；在中腸段，OTU1539占極優(yōu)勢地位；后腸段OTU223和OTU1539同為優(yōu)勢種，且兩者豐度相近。

圖4 松墨天牛幼蟲前、中、后腸細(xì)菌層級聚類樹Fig.4 The hierarchical clustering tree of bacteria in the foregut, midgut, hindgut of larvae of M. alternatus

2.4 松墨天牛幼蟲各腸段菌群功能分析

為探究松墨天牛幼蟲腸道細(xì)菌的潛在功能，通過PICRUSt預(yù)測各腸段菌群在KEGG第一、二級通路水平上的豐度，結(jié)果見表2。由表2可知，松墨天牛幼蟲各個腸段的細(xì)菌群落均注釋到6種KEGG一級功能通路，分別為代謝(46.58%)、遺傳信息處理(16.69%)、環(huán)境信息處理(15.52%)、細(xì)胞過程(3.92%)、人類疾病(1.14%)和組織系統(tǒng)(0.59%)。其中代謝功能通路的豐度幾乎占所有一級通路豐度的一半，說明松墨天牛幼蟲腸道菌群主要行使代謝各種物質(zhì)的功能。除此以外，代謝功能在松墨天牛幼蟲的3個腸段中表現(xiàn)出顯著性差異，后腸中的豐度顯著高于前腸和中腸，中腸菌群的豐度也顯著高于前腸。說明松墨天牛幼蟲腸道菌群的代謝以中腸和后腸為主要場所，并且后腸菌群發(fā)揮更重要的作用。

表2 松墨天牛幼蟲前、中、后腸細(xì)菌KEGG一級通路豐度

對松墨天牛幼蟲腸道菌群代謝通路里的二級通路進(jìn)行映射注釋，共發(fā)現(xiàn)12種二級代謝功能通路(表3)。這些二級通路對應(yīng)的功能及其在松墨天牛幼蟲整個腸道中的占比分別為糖類代謝(20.77%)、氨基酸代謝(19.98%)、能量代謝(10.88%)、輔助因子和維生素代謝(9.11%)、核苷酸代謝(7.38%)、脂質(zhì)代謝(7.09%)、外源化學(xué)物質(zhì)生物降解與代謝(6.01%)、聚糖生物合成與代謝(5.06%)、酶家族(4.33%)、其他氨基酸代謝(3.98%)、萜類和聚酮類化合物代謝(3.82%)及其他次生代謝產(chǎn)物生物合成(1.59%)。由此可知，松墨天牛幼蟲腸道菌群主要參與糖類和氨基酸的代謝，同時也有部分菌群具有降解外源化學(xué)物質(zhì)、萜類和聚酮類化合物的功能。這些功能集中在松墨天牛幼蟲的中腸和后腸，且以后腸為主。

表3 松墨天牛幼蟲前、中、后腸細(xì)菌KEGG二級通路(代謝通路)豐度

3 討 論

本研究通過Illumina HiSeq測序技術(shù)對室內(nèi)飼養(yǎng)的松墨天牛幼蟲的前、中、后腸中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及豐度進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明，變形菌門(Proteobacteria)為3個腸段中最優(yōu)勢門，葡糖桿菌屬(Gluconobacter)和沙雷氏菌屬(Serratia)為3個腸段中優(yōu)勢屬。Hu等[20]對我國松墨天牛野外種群不同齡期幼蟲的腸道菌組成進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)變形菌門在大多數(shù)樣本中占主導(dǎo)地位，與此次結(jié)果一致[22]。野外松墨天牛幼蟲腸道細(xì)菌的優(yōu)勢屬主要是腸桿菌屬和歐文氏菌屬(Erwinia)[20,22]，而本研究顯示室內(nèi)飼養(yǎng)的松墨天牛幼蟲腸道則以沙雷氏菌屬和葡糖桿菌屬為主，這種差別可能是由于食物的來源和組分不同所致。韓國學(xué)者鑒定了野外幼蟲種群中、后腸和室內(nèi)種群幼蟲后腸的細(xì)菌群落[21]，與本研究結(jié)果不同的是厚壁菌門在其所有樣本中占優(yōu)勢，可能是地理環(huán)境的差異影響了松墨天牛幼蟲腸道優(yōu)勢菌群的組成。本研究發(fā)現(xiàn)，前腸細(xì)菌的優(yōu)勢屬為葡糖桿菌屬，中腸細(xì)菌的優(yōu)勢屬為沙雷氏菌屬，這兩個屬同時為后腸中細(xì)菌的優(yōu)勢屬。Lemke等[31]測定了Pachnodaephippiata(鞘翅目：金龜子科)幼蟲腸道的pH，發(fā)現(xiàn)中腸堿性極高，后腸相對較低。Chapman等[32]也報道一些鱗翅目昆蟲的中腸呈堿性(pH 8～12)，其他腸段接近中性。葡糖桿菌屬細(xì)菌生長適宜的pH為5.5～6.0，沙雷氏菌屬細(xì)菌適宜的pH則為5～9[33]，可能是由于松墨天牛幼蟲不同腸段的酸堿性導(dǎo)致了細(xì)菌優(yōu)勢屬的差異，有待于后續(xù)研究確認(rèn)。此外，葡糖桿菌屬細(xì)菌多在富糖環(huán)境和發(fā)酵過程中被發(fā)現(xiàn)[33-34]，本研究提供的半人工飼料中含有較多的蔗糖和酵母粉，為葡糖桿菌屬細(xì)菌的富集提供了適宜環(huán)境。沙雷氏菌屬曾作為優(yōu)勢屬在松墨天牛的近緣種樟子松墨天牛(Monochamusgalloprovincialis)的胸部和腹部被發(fā)現(xiàn)[35]，同時也在其攜帶的松材線蟲上被分離鑒定[36]。

比較松墨天牛室內(nèi)幼蟲前、中、后腸細(xì)菌的OTUs組成和多樣性結(jié)果，可以看出各個腸段的群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，中、后腸的菌群豐度明顯高于前腸，后腸含有數(shù)量最多的細(xì)菌。這種現(xiàn)象是由于昆蟲每個腸段的理化條件存在差異以及消化的主要場所在中、后腸等原因所引起[7]。已有研究也表明一些昆蟲的后腸是棲居最大微生物數(shù)量的腸段[37]。另一方面，松墨天牛幼蟲前、中、后腸中也存在一些共享菌群。因?yàn)槔ハx的整個腸道連通，它們在取食的時候，腸道細(xì)菌會隨著食物從一個腸段進(jìn)入另一個腸段[32]，相比之下兩個相鄰腸段的共有細(xì)菌會更多，也證明了細(xì)菌群落在腸道內(nèi)的連續(xù)性。

昆蟲在適應(yīng)廣泛生態(tài)位的過程中，能夠在營養(yǎng)匱乏或難以降解食物的條件下正常生長發(fā)育，腸道微生物的營養(yǎng)共生作用就顯得異常重要[7]。植物在與植食性昆蟲協(xié)同進(jìn)化過程中，常常會利用次生代謝物質(zhì)來防御昆蟲的取食，許多昆蟲則通過腸道共生菌降解這些防御物質(zhì)[38]。本研究在參考有關(guān)松墨天牛幼蟲生物防控的基礎(chǔ)上[39]，利用PICRUSt預(yù)測室內(nèi)飼養(yǎng)的松墨天牛幼蟲前、中、后腸細(xì)菌的功能也主要體現(xiàn)在代謝功能上。中、后腸的細(xì)菌相比前腸發(fā)揮更重要的代謝作用，這與昆蟲的中腸和后腸進(jìn)行食物的消化和吸收的作用相關(guān)，而前腸通常用于食物的臨時儲存和初步消化[7,37]。糖類和氨基酸為室內(nèi)飼養(yǎng)的松墨天牛幼蟲腸道細(xì)菌最主要的代謝物質(zhì)，推測是因?yàn)榘肴斯わ暳系哪拘贾杏休^多的纖維素，同時提供了大量的蔗糖、酵母粉和酪蛋白。本研究還發(fā)現(xiàn)一些腸道細(xì)菌具有降解次生代謝物質(zhì)、萜類和聚酮類化合物的功能，松樹木屑中的木質(zhì)素和萜類物質(zhì)可能激發(fā)了這些腸道菌的代謝功能，參與了松墨天牛幼蟲對這些次生物質(zhì)的解毒過程。沙雷氏菌屬和假單胞菌屬細(xì)菌已被證實(shí)作為優(yōu)勢菌參與了纖維素、單萜或雙萜的降解[14-15,40-42]。本研究在室內(nèi)飼養(yǎng)的松墨天牛幼蟲中腸和后腸中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)堿桿菌屬細(xì)菌，并在后腸中豐度更高。產(chǎn)堿桿菌屬在以往的松墨天牛及其近緣的墨天牛的腸道菌研究中均未有報道，但該屬細(xì)菌可以利用有機(jī)酸鹽和酰胺產(chǎn)堿[33]，同時具有降解木質(zhì)纖維素的作用[43]。產(chǎn)堿桿菌屬可能輔助松墨天牛中腸和后腸營造堿性環(huán)境，從而使多種消化酶更有效地發(fā)揮作用。

本研究在分析室內(nèi)飼養(yǎng)的松墨天牛幼蟲前、中、后腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用 KEGG 數(shù)據(jù)庫預(yù)測了各個腸段細(xì)菌潛在的功能，有助于闡明松墨天牛幼蟲各腸段的菌群在組成結(jié)構(gòu)上的變化、優(yōu)勢菌群的種類以及腸道菌群與幼蟲營養(yǎng)共生中發(fā)揮的作用。后續(xù)研究將進(jìn)行松墨天牛腸道功能菌的篩選與驗(yàn)證，深入探究松墨天牛腸道細(xì)菌的功能。