加拿大紫荊種子硬實性解除及其吸水特性研究

張 琪，錢 滕，王 歡，朱銘瑋，李淑嫻*

(1. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2. 安徽林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 合肥 230031)

加拿大紫荊(Cerciscanadensis)為蘇木科紫荊屬小喬木，原產(chǎn)加拿大南部、美國東部和墨西哥北部[1]，其花色多樣、顏色艷麗，葉片色彩隨季節(jié)多變，是集觀花、觀葉于一體的園林造景樹種，具有良好的觀賞價值[2]。加拿大紫荊以種子繁育為主，然而由于種皮致密堅硬，導(dǎo)致成熟種子很難吸水萌發(fā)，這給種子質(zhì)量檢測、田間播種繁殖等工作帶來很多不便。因此，有必要對解除種皮硬實性的條件以及種子吸水特性開展研究。關(guān)于種子硬實性的解除方法通常有化學(xué)處理、物理處理、生物處理3種[3]，熱水處理最為常用[4-5]。在種子吸水特性方面，針對豆目植物種子的研究較多，并認為種脊(lens)、種臍(hilum)、種孔(micropyle)均可能成為種子的初始吸水位點。密封法和染色法是研究種子吸水途徑的常用方法[6-8]。已有學(xué)者對加拿大紫荊播種繁育技術(shù)進行了研究[2,9-10]，但關(guān)于種皮結(jié)構(gòu)、吸水對破除種子休眠的影響鮮見報道。本研究以一定溫度梯度的熱水處理加拿大紫荊種子，探究解除種子硬實性的最適條件，采用苯胺藍染色法確定種子的吸水點位和吸水后水分在種子內(nèi)部的遷移情況，結(jié)合凡士林密封法，定量分析種子不同部位吸水量的差異。同時通過種皮結(jié)構(gòu)的顯微觀察，分析種皮結(jié)構(gòu)對吸水的影響，以期了解種子生物學(xué)特性，并用于指導(dǎo)加拿大紫荊的育苗生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

加拿大紫荊種子于2016年10月下旬采集于美國密蘇里州Elsberry市。2017年2月在南京林業(yè)大學(xué)種子中心采用水選法除去空粒、癟粒、蟲害粒，陰干后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 種子硬實性確定

為探究種皮的透水性，分別取加拿大紫荊完整種子和切除子葉末端(機械損傷)的種子各50粒，重復(fù)3次，用1/1 000天平稱取其質(zhì)量(g)，然后將種子分別放入裝有熱水的燒杯中，20 ℃室溫下吸水。分別在浸種6、12、18、24、36、48、60 h時取出種子，擦干種子表面水分后再次稱量，按公式：吸水率=(浸種后的質(zhì)量-浸種前的質(zhì)量)/浸種前的質(zhì)量×100%計算吸水率并繪制吸水曲線，比較完整種子、機械損傷種子吸水率的差異。

1.3 種皮硬實性的解除試驗

取若干加拿大紫荊種子，設(shè)3個處理組，分別以溫度為70、80、90 ℃的熱水處理5 min，置于25 ℃恒溫箱中使其自然冷卻，浸種24 h后統(tǒng)計各處理種子的吸脹率。對照用清水處理相同時間，每組設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)100粒。隨機取以上各處理的種子，參照林木種子檢驗規(guī)程(GB 2772—1999)[11]，用四唑染色法測定各處理種子的生活力。未吸脹的種子，染色前需用單面刀片切除子葉末端以使其吸水。

1.4 種皮結(jié)構(gòu)掃描電鏡觀察

選取飽滿的加拿大紫荊種子，分為對照組和處理組，對照組未經(jīng)任何處理，處理組采用種皮硬實性解除試驗中的最佳條件解除種子的硬實性。借助掃描電鏡(SEM)，分別對兩組種子的種皮表面、縱切面的細胞結(jié)構(gòu)進行微觀形態(tài)觀察。樣品均按照SEM生物樣品制備中臨界點干燥方法[12]進行處理。

1.5 種皮不同部位吸水率差異測定

取加拿大紫荊種子若干，采用種皮硬實性解除試驗中的最佳條件解除其硬實性后，以凡士林密封法測定種子不同部位的吸水情況。參照Rodrigues-Junior等[13]的方法將種子劃分為3等份：種臍端(包括種臍、種孔等)、中間部位和子葉末端。用凡士林分別對種子作5個處理(標記為處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、CK)：Ⅰ，種臍端未用凡士林密封；Ⅱ，子葉末端未密封；Ⅲ，種子的中間部位未密封；Ⅳ，用凡士林密封整粒種子；CK則不用凡士林密封種子。每個處理設(shè)50?！?重復(fù)。按上述方法密封種子后分別置于裝有熱水的燒杯中，浸種3、6、9、12、15、18、21、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h后取出種子，用吸水紙擦除種子表面的凡士林及其水分后稱量。用凡士林再次密封種子第1次密封的部位、浸種、稱量，直至對照組種子達到吸水平衡。計算各處理的吸水率，繪制吸水曲線，比較種子各部位吸水率的差異。

1.6 種子初始吸水位點及吸水后水分移動路徑的觀察

隨機取若干粒加拿大紫荊種子，采用前期試驗中最佳條件解除其硬實性后，將種子浸泡在質(zhì)量分數(shù)為1%的苯胺藍溶液中，置于35 ℃黑暗培養(yǎng)箱，分別在浸種1、2、3、4、5、6、9、12、24、36 h后隨機取出若干種子，用單面刀片將種子從中間部位縱切，置于OLYMPUS SZX16體視顯微鏡下觀察種子的染色情況。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理和制圖，SPSS 17.0對各測定指標進行數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 加拿大紫荊種皮的透水性

加拿大紫荊完整種子和機械損傷種子的吸水曲線見圖1。

圖1 加拿大紫荊種子的吸水曲線Fig.1 The curves of water absorption of Cercis canadensis seeds

由圖1可知，機械損傷種子的吸水率遠遠高于完整種子。吸水至24 h時，完整種子的吸水率為3.1%；繼續(xù)浸種，種子吸水率上升仍比較緩慢，至60 h時，完整種子吸水率僅為10.4%。而機械損傷種子24 h時的吸水率已達到99.5%，隨后種子的吸水速率趨于平緩。其中，處理組和完整種子吸水率的差異，說明透水性差是造成加拿大紫荊種子休眠的一個重要原因。

2.2 種子硬實性的解除方法

加拿大紫荊種子具有很強的硬實性，經(jīng)不同溫度的熱水處理后，種子的吸脹率和生活力結(jié)果見表1。由表1可知，浸種24 h后，對照組的吸脹率只有4.3%，隨著處理熱水溫度的上升，吸脹率也隨之提高，采用90 ℃的熱水處理5 min時，吸脹率達98.7%；采用溫度為80 ℃的熱水處理相同時間，吸脹率達到97.3%，二者差異不顯著。表1中，對照組種子的生活力非常高，可達100%，各處理組中，只有溫度為90 ℃處理的種子生活力顯著下降，而其他處理的種子生活力與對照組均無顯著差異。綜合考慮種子吸脹率和生活力2個指標，80 ℃熱水處理5 min對解除加拿大紫荊種子硬實性的效果最好，種子吸脹率高，并且生活力也能維持較高的水平。

表1 不同溫度的熱水處理后加拿大紫荊種子的吸脹率和生活力

2.3 加拿大紫荊種子的種皮結(jié)構(gòu)

1) 種皮表面微觀結(jié)構(gòu)。加拿大紫荊種皮表面光滑，呈扁橢圓形(圖2A)，種臍處有兩條明顯的窄裂縫(圖2B)。種子的裂縫中覆蓋有大量膠狀物(圖2C)，熱水處理后膠狀物質(zhì)消失，裂縫也更為明顯(圖2D)。子葉末端區(qū)域在熱水處理后，種皮表面的裂縫稍有增多(圖2E、2F)，其他并無明顯變化。

A.種皮表面seed coat surface(20×)；B.種臍端hilar region(50×)；C. 對照組種臍端hilar region in the control seed(150×)；D.處理組種臍端hilar region of seed treated by hot water(150×)；E. 對照組子葉末端bottom of cotyledon in the control seed(500×)；F.處理組子葉末端bottom of cotyledon of seed treated by hot water(500×)。圖2 加拿大紫荊種子種皮表面形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 The surface micro-morphological characters of Cercis canadensis seeds

2) 種皮縱切面超微結(jié)構(gòu)。對加拿大紫荊種子縱切面的種臍區(qū)域(the hilar region)、種臍的對面(away from the hilar region)、中間部位、子葉末端部位種皮的超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)(圖3)：大多數(shù)部位的種皮由3層結(jié)構(gòu)組成，最外側(cè)為致密并覆有蠟質(zhì)的角質(zhì)層(cutile layer)，與角質(zhì)層緊挨著的是由單層長柱狀大石細胞緊密排列而成的柵欄層(palisade layer)(圖3A、3B)。柵欄層內(nèi)側(cè)為厚壁細胞層(sclerenchyma layer)，該層細胞形狀不規(guī)則，種臍區(qū)域組織疏松，種臍的對面組織排列較緊密(圖3B)。種臍區(qū)域的種皮，除了這3層結(jié)構(gòu)，在柵欄層外側(cè)與角質(zhì)層之間有一條平行于種皮表面的連續(xù)的線，稱為明線(light line)(圖3B)，明線與角質(zhì)層之間有一層反柵欄層(counter-palisade layer)(圖3C)。種臍區(qū)域還有一層特殊的螺紋狀維管束(vascular bundle)，維管束將厚壁細胞層分成兩部分(圖3C、3D)，始自種臍區(qū)域，并沿種皮向子葉末端延伸。

熱水處理前后加拿大紫荊種子種臍區(qū)域細胞結(jié)構(gòu)變化明顯。處理前，種臍部位的種皮緊密貼合(圖3A)；處理后，種臍處裂縫開口增大，近種孔處種皮的柵欄層與厚壁細胞層分離，形成一個凸起(bulge)(圖3E)。熱水處理前，種臍與厚壁細胞和維管束的相接處有大量膠狀物質(zhì)存在(圖3C)；處理后，這些膠狀物質(zhì)也隨之溶解(圖3F)。

A.對照組種臍區(qū)域縱切面the longitudinal section near hilar region of the control seed(50×)；B. 柵欄層結(jié)構(gòu)palisade layer(500×)；C.維管束結(jié)構(gòu)vascular bundle(500×)；D. 對照組種臍區(qū)域縱切面放大hilar region of CK(150×)； E. 處理組種臍區(qū)域縱切面hilar region of the seed treated by hot water(50×)；F. 處理組種臍區(qū)域縱切面放大hilar region of the seed treated by hot water(100×)。BU. 凸起bulge; CPL. 反柵欄層counter-palisade layer； CU. 角質(zhì)層cuticle layer；HI. 種臍hilum；LL. 明線light line；MI. 種孔micropyle； PL. 柵欄層palisade layer；SC. 厚壁細胞sclerenchyma cells；VB. 維管束vascular bundle。圖3 加拿大紫荊種子縱切面的掃描電鏡結(jié)構(gòu)觀察Fig.3 The longitudinal section structure of Cercis canadensis seed coat revealed by scanning electron microscopy (SEM)

2.4 加拿大紫荊種子吸水特性

2.4.1 種皮不同部位吸水速率的差異

解除硬實性的種子，采用凡士林密封不同部位后，各處理的吸水情況見圖4。由圖4可知，完全密封的種子(處理IV)，在吸水120 h后，吸水率僅為0. 6%，說明用凡士林密封種皮不同部位來研究種子吸水特性的方法是可行的。加拿大紫荊種子的吸水速度呈慢—快—慢的變化趨勢，各吸水階段，對照組種子的吸水速率明顯快于密封種子不同部位的3個處理。在密封種子不同部位的3個處理中，它們的吸水速率也不相同：吸水12 h時，處理Ⅰ的吸水率為10.8%，顯著高于處理Ⅱ和處理Ⅲ，此時Ⅱ、Ⅲ兩個處理基本沒有吸水，其吸水率分別為0.2%、0.5%，因此浸種12 h時只有種臍端吸水；吸水96 h時，處理Ⅰ的吸水率達88.6%，仍然顯著高于處理Ⅱ和處理Ⅲ，此時處理Ⅲ的吸水率為5.0%，較之前略有上升，因此中間部位開始有吸水的跡象，但與處理Ⅱ差異仍不顯著；吸水120 h時，處理Ⅲ的吸水率為12.0%，仍然遠低于處理Ⅰ(91.4%)，但已顯著高于處理Ⅱ。本研究結(jié)果說明，加拿大紫荊種子剛吸水時，種臍端吸水較多，直至后期(96 h)種子中間部位才略有吸水，浸種120 h時，子葉末端的吸水率仍是很低。

圖4 加拿大紫荊種子不同部位吸水曲線Fig.4 The curves of water absorption by blocking different parts of Cercis canadensis seeds

2.4.2 染色法確定加拿大紫荊種子吸水途徑

從種子的縱切面可以發(fā)現(xiàn)，子葉占加拿大紫荊種子結(jié)構(gòu)的絕大部分，胚的外面包裹著一層膠狀胚乳殘余組織，且胚根端的殘余組織較厚。從該縱切面還可以看到，胚根端的種皮較其他部位更厚(圖5A)。熱水處理解除硬實性的種子，1 h時種皮未能染色(圖5A)；2 h時(圖5B)，厚壁細胞層與柵欄層分離，形成一個凸起(BU)，染液由種孔進入該分離處，致使種孔部位最先染色，說明此時該部位有水分進入；3 h時(圖5C)，種臍裂縫處的種皮開始著色；4 h時(圖5 D)，厚壁細胞層與柵欄層的分離區(qū)域進一步擴大，角質(zhì)層和柵欄層著色面積也隨之?dāng)U大，并且染色區(qū)域大于種臍處；9 h時(圖5E)，種臍一側(cè)的厚壁細胞層與柵欄層的分離區(qū)域和染色區(qū)域進一步擴大。從圖中還可以發(fā)現(xiàn)，染液由裂縫處沿著維管束通道向子葉末端擴散，但厚壁細胞沒有染色，說明水分不能進入厚壁細胞中；種臍對面區(qū)域也是僅在角質(zhì)層和柵欄層有著色。染色36 h時(圖5F)，整個種皮充滿了苯胺藍染液，并且厚壁細胞層也被著色。

A.染色1 h；B.染色2 h；C.染色3 h；D.染色4 h； E.染色9 h；F.染色36 h。Dyed in aniline blue for 1 h (A),2 h (B),3 h (C),4 h (D),9 h (E),36 h (F). HI.種臍hilum；MI.種孔micropyle；VB.維管束vascular bundle；BU.近種孔端的凸起bulge。圖5 加拿大紫荊種子苯胺藍染色結(jié)果Fig.5 Water entry sites in Cercis canadensis seeds displayed using aniline blue dye

3 討 論

3.1 種子硬實性的解除

解除種子硬實性的方法有多種，最常見的有酸蝕處理、機械處理和熱水處理。酸蝕處理不如機械處理和熱水處理法經(jīng)濟、環(huán)保，但機械處理方法操作比較復(fù)雜，不適用于大規(guī)模的種苗生產(chǎn)[14]。熱水處理可使種皮得以軟化、適當(dāng)開裂，還可去除種皮表層的油脂和蠟質(zhì)，改善種皮透性，解除種子硬實性進而促進萌發(fā)[15]。結(jié)合熱水處理后加拿大紫荊種子吸脹率和生活力的結(jié)果，最終確定解除該種子硬實性的最佳條件為：始溫80 ℃ 熱水處理5 min。

3.2 種皮結(jié)構(gòu)與吸水特性的關(guān)系

完整種子的吸水研究結(jié)果表明，加拿大紫荊種子具有較強的硬實性，即具有明顯的物理休眠特性，自然狀態(tài)下種子很難吸水萌發(fā)。種皮結(jié)構(gòu)及細胞排列方式的不同都會影響種皮的透性，進而對種子吸水特性有影響。加拿大紫荊的種皮表面(角質(zhì)層)覆有較厚的蠟質(zhì)，這是影響種子吸水的重要原因。有學(xué)者認為，種子的物理休眠與種皮中不透水的柵欄層有關(guān)[16]。杜鳳國等[17]認為紫椴(Tiliaamurensis)種子種皮中緊密排列的柱狀石細胞、種臍處增厚的角質(zhì)層以及種孔處的石細胞造成了種皮的不透性。De Souza等[18]認為明線是阻礙種子吸水的一道屏障。加拿大紫荊種子也具有角質(zhì)層、明線、柵欄層等結(jié)構(gòu)，它們可能是造成成熟(干)種子不能順利吸水的重要原因。本次苯胺藍染色9 h后，種臍一側(cè)的維管束被染色，而厚壁細胞開始未染色，36 h后才被染色，這說明熱水處理后,厚壁細胞在一定程度上仍會阻礙種子吸水的進行。

有學(xué)者認為，除了角質(zhì)層和柵欄層，成熟種子的種孔和種臍等部位呈關(guān)閉狀態(tài)，可以阻止外界水分進入種子體內(nèi)，這也可能是豆目植物種皮不透水的重要原因[19]。還有研究者認為，種臍部位常被種子分泌的一些不透水物質(zhì)所填充，從而使種子具有不透性[20]。對本研究中加拿大紫荊種子的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，成熟種子種臍裂縫和維管束連接處覆蓋著白色蠟質(zhì)物，熱水處理后蠟質(zhì)被溶解，縫隙變寬，從而使水分能夠進入種皮內(nèi)部，使種孔端柵欄層與厚壁細胞分離。熱水處理前后種皮結(jié)構(gòu)的變化表明，緊閉的種臍及其縫隙中的蠟質(zhì)是造成該種子難以吸水的原因之一，也是造成種子物理休眠的重要原因。

加拿大紫荊種子在夏末秋初成熟，如果它們在冬季來臨之前就已經(jīng)發(fā)芽，幼苗就不能正常越冬。上述種臍、種孔的特殊變化以及種臍所在一側(cè)種皮較厚、反柵欄層、明線等特殊結(jié)構(gòu)的存在，是種子在進化過程中形成的一個重要適應(yīng)性狀，為促使種子在最理想的環(huán)境條件下萌發(fā)提供了保障，但這些休眠特性對種子檢驗以及播種育苗生產(chǎn)也帶來了一些不利影響。

3.3 加拿大紫荊種子的初始吸水位點及吸水后水分的移動規(guī)律

密封法可以對種子不同部位的吸水情況進行量化分析，以此判斷種子的初始吸水區(qū)域。有學(xué)者用凡士林密封種子不同部位的方法，推測種臍是刺葉錦雞兒(Caraganaacanthophylla)和荒漠錦雞兒(C.roborovskyi)種子的主要吸水位點[21]，這與本研究結(jié)果類似。加拿大紫荊種子吸水12 h時，種臍區(qū)域的吸水率遠高于種子中間部位及子葉末端(后面兩個部位此時基本沒有吸水)，因此種臍區(qū)域是種子最初的吸水部位。

苯胺藍染色法能夠?qū)λ值倪w移路線進行示蹤，在種子吸水機理的研究中常被采用。本研究發(fā)現(xiàn)：水分最初由種孔進入種皮，隨后種臍的裂縫處也有水分進入，由于厚壁細胞層與柵欄層的分離，使水分能夠沿種皮向子葉末端方向延伸，同時水分還能夠沿維管束組織進行遷移，另外還發(fā)現(xiàn)吸水前期(9 h)厚壁細胞層對種子吸水仍有一定的影響。由于苯胺藍是大分子染料，不能進入種胚，因此該方法只適合于研究種皮早期的吸水過程。雖然苯胺藍能進入胚乳組織中，但本次并未觀察到不同吸水階段苯胺藍運動的變化規(guī)律，因此該方法也不能用來確定水分在胚乳組織中的遷移規(guī)律。