水酶法提取山蒼子核仁油工藝的研究

賴鵬英 黎繼烈 肖志紅 唐 娟 張愛華,

(中南林業(yè)科技大學(xué)1，長沙 410004)(湖南省林業(yè)科學(xué)院2，長沙 410004)

山蒼子Litseacubeba(Lour) Pers又名山雞椒、木姜子，是樟科木姜子屬落葉小喬木，主要分布在我國湖南、廣西、福建等地，是一種重要木本油料植物[1]。山蒼子果實應(yīng)用價值高，常被用來提取山蒼子精油。在提取山蒼子精油過程中會產(chǎn)生大量的核仁殘留物，全國每年約有20萬t山蒼子核仁殘留物被直接被丟棄，造成資源的巨大浪費[2, 3]。山蒼子核仁來源豐富，油脂含量高達(dá)40%，其脂肪酸成分與椰子油相似，在一定程度上可替代椰子油，具有較高經(jīng)濟(jì)價值，但由于缺乏技術(shù)的指導(dǎo)和資金投入，一直沒有得到良好開發(fā)[4]。

工業(yè)提取植物油一般采用溶劑萃取法，若需考慮無化學(xué)污染的提取方法則選擇物理壓榨法[5]。壓榨法通過機(jī)械擠壓油料提取油脂，是最常用的方法，但存在出油率低、出油速度慢等缺點。溶劑萃取法是利用油脂可溶于有機(jī)溶劑的特性萃取油脂，出油率較高，但需要脫溶劑過程[6]。超臨界CO2萃取能顯著提高出油率，但技術(shù)和設(shè)備要求較高，不易放大生產(chǎn)[7]。隨著我國對環(huán)境保護(hù)的重視及人民健康意識的提升，水酶法提取油脂因其安全性佳、設(shè)備簡單、條件溫和、能耗低、效率高的顯著優(yōu)勢被業(yè)界廣泛認(rèn)可[8]。前期研究證明水酶法在提取無患子籽仁油[9]、牡丹籽油[10]、紅樹莓籽油[11]、大豆油[12]、葵花籽油[13]、蓖麻籽油[14]、櫻桃種子油[15]上均有良好效果，然而利用水酶法提取山蒼子核仁油鮮有報道。本研究以山蒼子核仁為原料,探究不同實驗條件復(fù)合酶對山蒼子核仁油提取率的影響，并對水酶法提山蒼子核仁油工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為該工藝的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山蒼子核仁、纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶；氫氧化鈉、鹽酸為分析純；乙腈、丙酮為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

SY-2230恒溫水浴搖床，F(xiàn)A1204B電子分析天平，AZC-02多功能粉碎機(jī)，DF-101s集熱式恒溫磁力攪拌器，TDL5M臺式低速離心機(jī)，SZF-06A粗脂肪測定儀，F(xiàn)E20實驗室pH計，IS5型傅里葉紅外光譜儀，Scion-SQ型單四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀。

1.3 方法

1.3.1 水酶法提取山蒼子核仁油

將150 ℃烘烤3 h后的山蒼子核仁用多功能粉碎機(jī)粉碎90 s，準(zhǔn)確稱重20 g后調(diào)制合適液料比(水與山蒼子核仁體積質(zhì)量比，下同)，待溫度上升至實驗設(shè)計溫度時用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH，加入一定比例的酶(以山蒼子核仁質(zhì)量計，下同)，反應(yīng)結(jié)束后100 ℃水浴滅酶10 min，將酶解產(chǎn)物冷卻至室溫，置于離心機(jī)中5 000 r/min離心20 min，離心結(jié)束取上層清油，計算提取率。

(1)

1.3.2 山蒼子核仁含油率的測定方法

山蒼子核仁含油率的測定方法參考GB/T 14488.1—2008《植物油料含油量測定》。

1.3.3 復(fù)合酶制劑篩選實驗

研究以酶的種類(纖維素酶、果膠酶、α淀粉酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶)、酶的復(fù)配(1∶1、2∶1、3∶1、1∶2、1∶3) 、酶的用量(1%、2%、3%、4%、5%)為影響因素進(jìn)行復(fù)合酶制劑篩選實驗，先篩選出2種效果最佳的酶，再固定其復(fù)配及用量。

1.3.4 單因素實驗

研究分別以酶解pH(3、4、5、6、7)、液料比(1、3、5、7、9 mL/g)、酶解溫度(35、40、45、50、55 ℃)、酶解時間 (1、3、5、7、9 h)為影響因素進(jìn)行單因素實驗，研究各因素對山蒼子核仁油提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化

采用Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計方案，在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取對酶解反應(yīng)影響較大的3個因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計，建立山蒼子核仁油提取率的回歸方程，優(yōu)化山蒼子核仁油提取工藝參數(shù)。

1.3.6 山蒼子核仁油的傅里葉紅外分析

利用傅里葉紅外(FT-IR)檢測水酶法最佳工藝條件下提取的山蒼子核仁油的化學(xué)結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)組成。

FT-IR檢測條件[16]：檢測器為中紅外DTGS檢測器，分辨率為4.0 cm-1，采集空氣為背景，采集次數(shù)設(shè)為16次，波數(shù)掃描范圍為400.0～4 000.0 cm-1。

1.3.7 山蒼子核仁油的脂肪酸成分分析

采用氣象色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)測定山蒼子核仁油的脂肪酸組成成分。

樣品預(yù)處理：對樣品進(jìn)行甲酯化處理，參考GB 5009.168—2016方法。山蒼子核仁油GC-MS檢測條件[17]：色譜柱為HP-5彈性石英毛細(xì)管柱30 mm×0.25 mm×0.25 μm，載氣為He，流量2.0 mL/min；正己烷為溶劑；進(jìn)樣口溫度280 ℃，分流比10∶1；傳輸線溫度280 ℃，EI離子源，電離電壓70 eV，電子倍增電壓980 V，溶劑延遲10 min，離子源溫度250 ℃，質(zhì)荷比范圍50～550，5次/s全掃描。

2 結(jié)果及分析

2.1 復(fù)合酶制劑篩選實驗

2.1.1 酶種類的初步篩選

在料液比為2 mL/g，酶解反應(yīng)時間7 h，加酶量4%條件下，考察纖維素酶(50 ℃，pH4.8)、果膠酶(50 ℃，pH3.0) 、α-淀粉酶(60 ℃，pH6.0) 、中性蛋白酶(40 ℃，pH7.0) 、堿性蛋白(50 ℃，pH8.0)對山蒼子核仁油提取率的影響。由圖1可知，每種酶在適當(dāng)條件下都能促進(jìn)核仁油的提取，而蛋白酶對山蒼子核仁油提取有明顯作用，如中性蛋白酶可使核仁油提取率提高20%左右，其次為纖維素酶。這可能是因為纖維素酶能降解、軟化細(xì)胞壁，而蛋白酶可以降解細(xì)胞中的蛋白，增加油脂流動性，使油脂更容易從細(xì)胞中游離出來[18]。綜合考慮，選擇中性蛋白酶與纖維素酶的復(fù)配。

注：1.纖維素酶；2.果膠酶；3.α-淀粉酶；4.中性蛋白酶；5.堿性蛋白酶；6.木瓜蛋白酶；7.對照。圖1 單一酶對山蒼子核仁油提取率的影響

2.1.2 酶的復(fù)配對提取率的影響

由圖2可知在料液比2 mL/g，酶解反應(yīng)時間7 h，加酶量4%，pH6.0，酶解溫度45 ℃的條件下，中性蛋白酶與纖維素酶質(zhì)量比1∶1核仁油的提取率最高，表明該質(zhì)量配比的復(fù)合酶能夠有效地降解山蒼子核仁的細(xì)胞壁，從而使包埋在細(xì)胞內(nèi)的油脂最大程度地被釋放到水中[19]。因此，復(fù)合酶選擇質(zhì)量比1∶1。

圖2 中性蛋白酶與纖維素酶的質(zhì)量比對提取率的影響

2.1.3 復(fù)合酶的用量對提取率的影響

在料液比為2 mL/g，酶解反應(yīng)時間7 h，pH6.0，溫度45 ℃條件下，復(fù)合酶對核仁油提取率的影響如圖3所示。復(fù)合酶添加量未達(dá)3%以前，核仁油提取率隨復(fù)合酶用量的增加而上升；當(dāng)復(fù)合酶添加量達(dá)到3%以后，核仁油提取率達(dá)到最大并基本保持穩(wěn)定。為節(jié)約實驗成本，后續(xù)實驗復(fù)合酶的添加量固定為3%。

圖3 復(fù)合酶添加量對提取率的影響

2.2 單因素實驗

在蛋白酶與纖維素酶質(zhì)量比1∶1，復(fù)合酶用量3%條件下，酶解pH、液料比、酶解溫度、酶解時間對山蒼子核仁油提取率的影響如圖4所示。

圖4 單因素對山蒼子核仁油提取率的影響

2.2.1 酶解pH對提取率的影響

在液料比2 mL/g，酶解反應(yīng)時間7 h，溫度45 ℃條件下，酶解pH對提取率的影響如圖4所示。從圖4可以看出在山蒼子核仁油的提取率在pH3～pH6之間逐步增加，在pH6時提取率達(dá)到最高值，pH6以后提取率下降。這可能是因為復(fù)合酶存在最適pH，當(dāng)時pH過高或過低時會引起復(fù)合酶酶活性降低，從而影響核仁油提取率。

2.2.2 液料比對提取率的影響

溫度45 ℃， pH6.0，酶解反應(yīng)時間7 h考察液料比對核仁油提取率的影響，結(jié)果見圖4。液料比在3 mL/g時，核仁油提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增大液料比，核仁油提取率下降。這是因為液料比小時漿液黏度大，油脂不易分離；而液料比太大會造成酶與底物的濃度下降，影響酶的效率[20]。

2.2.3 酶解溫度對提取率的影響

酶解反應(yīng)pH6.0，料液比3 mL/g，酶解反應(yīng)時間7 h，酶解溫度對提取率的影響如圖4所示。當(dāng)溫度在35～45 ℃時，山蒼子核仁油的提取率隨著溫度的升高而增大；當(dāng)溫度上升到45 ℃時，核仁油提取率達(dá)到最高值(84.27±0.7)%；繼續(xù)升高溫度，復(fù)合酶的活力受到影響，核仁油提取率下降。

2.2.4 酶解時間對提取率的影響

考察酶解反應(yīng)pH6.0，溫度45 ℃，料液比為3 mL/g條件下，酶解時間對提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著酶解時間的增加山蒼子核仁油的提取率逐步上升，當(dāng)酶解時間達(dá)到7 h，提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)延長酶解時間，核仁油的提取率不再上升并基本保持穩(wěn)定。酶解7 h后，酶解反應(yīng)基本結(jié)束，繼續(xù)延長反應(yīng)時間蛋白質(zhì)及油脂可能會在水浴振蕩中乳化，因此綜合考慮，后續(xù)實驗固定酶解反應(yīng)時間7 h。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化水酶法提油工藝

2.3.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取對酶解反應(yīng)影響較大的3個因素酶解溫度 (A) 、酶解pH (B) 、液料比 (C) 進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析，對工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)計因素與水平編碼表如表1，響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

表1 Box-Behnken實驗因素水平

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

運用Design Expert8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到方差結(jié)果，如表3所示。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析

Y(核仁油提取率)=86.19+1.11A+1.11B-0.48C-0.55AB+2.30AC+2.32BC-3.43A2-2.86B2-3.21C2

模型方程式中各因素對應(yīng)項系數(shù)的絕對值是該因素對核仁油提取率的影響程度，由此可知影響程度：酶解pH(B)，酶解溫度 (A)>液料比 (C)。

由表3可知，A、B、A2、B2、C2對響應(yīng)值山蒼子核仁油提取率的影響高度顯著 (P<0.01) ，C不顯著的原因可能是響應(yīng)面考察液料比這個變量的范圍較小。失擬項P>0.05，表明模型的失擬度不顯著，回歸系數(shù)R2為0.978 1，RPred2為0.835 6表明預(yù)測值與實驗值具有良好的擬合性，校正后的復(fù)測相關(guān)系數(shù)Radj2為0.949 8，測試值與校正值較為接近，表明該模型擬程度良好[21]。

2.3.3 各因素交互作用

酶解pH(B)與液料比(C)，酶解溫度(A)與液料比(C)的交互作用較強(qiáng)，酶解溫度(A)與酶解pH(B)無交互作用。

2.3.4 回歸模型的驗證

根據(jù)二次回歸方程的數(shù)學(xué)模型分析，得到的最佳提油工藝條件：液料比為3.11 mL/g、pH6.40、溫度45.83 ℃，模型預(yù)測在此條件下山蒼子核仁油的提取率能達(dá)到86.38%。為了便于實驗實際操作，后期驗證模型可靠性時將最佳工藝修正為液料比為3 mL/g、pH為6.40、溫度46 ℃。在修正后的工藝條件下重復(fù)3次實驗，得到山蒼子核仁油提取率為 (86.10±0.68)%，與理論預(yù)測值相近，表明響應(yīng)面所建模型有效。

2.4 山蒼子核仁油的傅里葉紅外分析

對水酶法最佳工藝條件下提取的山蒼子核仁油進(jìn)行FT-IR檢測，每一個峰和肩峰在一定程度上代表分子結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)或脂質(zhì)組分信息，結(jié)果如圖5所示。

2.5 山蒼子核仁油的脂肪酸成分分析

GC-MS分析水酶法最佳工藝條件下提取的山蒼子核仁油的脂肪酸組成，GC-MS圖譜如圖6所示，共鑒定出11種脂肪酸，相應(yīng)的脂肪酸組成及含量見表4。

圖6 山蒼子核仁油總離子流色譜圖

表4 山蒼子核仁油的主要脂肪酸組成

11種脂肪酸中飽和脂肪酸5種，不飽和酸6種，與周軍[24]石油醚萃取的山蒼子核仁油脂肪酸組成一致。水酶法提取的山蒼子核仁油除不飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)30.73%高于李湘洲等[25]有機(jī)溶劑萃取的山蒼子核仁油25.70%外，月桂酸含量51.92%，碳數(shù)居于10～12之間的中碳鏈脂肪酸等脂肪酸組成成分均無顯著性差異。

3 結(jié)論

水酶法提山蒼子核仁油的提取設(shè)備簡單，提取效率高，對環(huán)境影響小。本研究以山蒼子核仁為原料優(yōu)化水酶法提油工藝，結(jié)果表明，水酶法提山蒼子核仁油的最佳工藝條件為中性蛋白酶與纖維素酶質(zhì)量比1∶1，復(fù)合酶添加量為3%，酶解時間7 h，液料比3 mL/g，pH6.40，溫度46 ℃，在此條件下山蒼子核仁油提取率可達(dá) (86.10±0.68)%，與預(yù)測值86.38%接近。

對最佳工藝條件下提取的山蒼子核仁油進(jìn)行FT-IR及GC-MS分析發(fā)現(xiàn)：山蒼子核仁油在FT-IR檢測出的結(jié)構(gòu)都能在GC-MS中找到對應(yīng)的脂肪酸。GC-MS分析脂肪酸成分發(fā)現(xiàn)月桂酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.92%，不飽和脂肪酸為30.73%，碳數(shù)居于10～12之間的中碳鏈脂肪酸占68.8%，不同提油工藝提取的山蒼子核仁油油脂脂肪酸成分沒有明顯差異，化學(xué)成分分析表明山蒼子核仁油是一種具有開發(fā)潛力的天然油脂資源。