單眼形覺剝奪性弱視大鼠視皮層突觸密度及功能的研究

李 謙，畢愛玲，張秀艷，張莉唯，路致遠(yuǎn)，王興榮，畢宏生

?KEYWORDS:monocular deprivation; visual cortex; synaptic density; synaptophysin; visual function

0引言

弱視是與視皮層突觸發(fā)育可塑性相關(guān)的一種兒童常見臨床眼病，可以造成多種視功能損害，據(jù)統(tǒng)計我國弱視的發(fā)病率可高達(dá)2%～4%[1]，主要原因是視覺發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)由于單眼斜視、屈光參差、高度屈光不正以及形覺剝奪等異常視覺經(jīng)驗引起的單眼或雙眼最佳矯正視力低于相應(yīng)年齡正常兒童，且眼部檢查無器質(zhì)性病變[2]。若治療錯過視覺發(fā)育敏感期，則療效較差，嚴(yán)重者將造成不可逆的視功能損害，甚至可能造成患兒視力喪失[3]。因此深入研究弱視的發(fā)病機制對于疾病的治療有著重要意義。已有研究證明，學(xué)習(xí)記憶過程中大腦皮層存在突觸可塑性的改變[4-5],而視皮層發(fā)育過程與學(xué)習(xí)記憶過程具有相似的分子生物學(xué)機制，需要突觸可塑性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在視覺發(fā)育過程中存在著大量的神經(jīng)元突觸聯(lián)系，弱視的發(fā)生發(fā)展與視皮層突觸結(jié)構(gòu)的功能性密切相關(guān)，其中結(jié)構(gòu)的可塑性主要表現(xiàn)在視皮層突觸密度超微形態(tài)變化上，要了解神經(jīng)元回路如何調(diào)控大腦視皮層突觸功能可塑性，需要對神經(jīng)元突觸進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析。突觸素(synaptophysin，SYN)是最豐富的突觸囊泡膜蛋白，在突觸形成修飾、信息傳遞、生長發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶等方面發(fā)揮著重要調(diào)控作用，常用于突觸前終末端的標(biāo)記[6]。目前,借助免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)，SYN突觸蛋白已在動物及人類中被廣泛用于評估突觸數(shù)量及神經(jīng)終末密度,可以客觀地呈現(xiàn)突觸數(shù)或突觸前終末密度的變化。已有研究發(fā)現(xiàn)在視皮層早期發(fā)育和成熟中SYN突觸蛋白發(fā)揮著重要作用，并可能參與視覺發(fā)育敏感期視皮層突觸可塑性的調(diào)控[7]。但突觸素影響視皮層突觸可塑性的機制尚不明確。本研究在建立單眼剝奪性弱視模型Long Evans大鼠的基礎(chǔ)上，重點探討視覺發(fā)育關(guān)鍵期形覺剝奪對大鼠視皮層突觸密度和超微形態(tài)結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的影響，以及SYN在視皮層的表達(dá)及意義，研究弱視大鼠視皮層突觸密度及功能與突觸可塑性的關(guān)系，為弱視治療的分子機制探索提供新的思路。

1材料和方法

1.1材料將成年的SPF級Long Evans大鼠進(jìn)行合籠，約30d娩出幼鼠，常規(guī)檢查雙眼，排除眼部器質(zhì)性疾病。隨機選取剛出生的幼鼠50只。成年動物均購自北京維通利華動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)溫度保持25℃左右，控制12h/12h的晝夜光照規(guī)律，食物水源充足，自由飲食。實驗動物的飼養(yǎng)過程得到山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗室動物管理和使用委員會的批準(zhǔn)，且實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》和山東中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會的標(biāo)準(zhǔn)。主要儀器及試劑：手術(shù)器械，冰凍切片機(德國SLEE)，熒光顯微鏡(日本Olympus)，激光共聚焦顯微鏡(Zeiss)，透射電子顯微鏡(JEM-1200，日本)；英國OPTOPROBE電生理儀；數(shù)碼相機(OSIS，德國)；腦切片模具(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)等。一抗SYN抗體[YE269] (ab32127，Abcam,英國)，二抗Alexa Fluor488(Invitrogen，美國)，紅霉素眼膏(北京雙吉制藥有限公司)；氧氟沙星滴眼液[辰欣偉都藥業(yè)(汶上)有限公司]等。

1.2方法

1.2.1大鼠單眼剝奪性弱視模型的建立參照文獻(xiàn)[8-9]建立單眼形覺剝奪(MD)經(jīng)典弱視模型,在大鼠出生后13d，眼睛未睜開時，將大鼠進(jìn)行麻醉固定，并對右眼進(jìn)行表面麻醉，用顯微剪剪去眼瞼處的毛發(fā)，并用生理鹽水和乙醇清洗消毒眼瞼周圍皮膚，剪去距離上下眼瞼緣約0.8～1.2mm處的皮膚和組織后，用眼科縫合線對右側(cè)眼瞼進(jìn)行2～4針的間斷縫合。術(shù)后7d內(nèi)，每日早中晚各一次使用氧氟沙星滴眼液及紅霉素眼膏，并及時對創(chuàng)口愈合情況進(jìn)行檢查。若出現(xiàn)脫線、漏光、眼內(nèi)感染的動物，將予以剔除，不再納入后續(xù)實驗。最終納入實驗大鼠共32只，每組16只。兩組大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)至21d，然后剪開縫合的眼瞼，1mo后行閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)檢測。

1.2.2 F-VEP檢查檢查參照ISCEV標(biāo)準(zhǔn)，將大鼠提前置于暗室內(nèi)，使其暗適應(yīng)12h后給予1%戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉。電極位置: 正極為大腦枕葉對應(yīng)皮下,負(fù)極為臉頰,接地為尾部皮下, 隨后按照電生理儀操作系統(tǒng)進(jìn)行操作。用閃爍光作為刺激光，刺激頻率1Hz，通頻帶寬0.5～85.0Hz，分析時間250ms，疊加60次，連續(xù)測量至少3次，記錄P2波振幅和潛伏期。

1.2.3電鏡檢測大鼠視皮層神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)F-VEP檢測結(jié)束后取材，將兩組Long Evans大鼠快速斷頭，取腦并放在腦切片模具中，采用前囟標(biāo)記法(以確保每只動物取材位置相同)，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜[10]切取雙側(cè)視皮層腦組織，垂直該冠狀面切取V1M區(qū)(單眼投射區(qū))內(nèi)長3mm,橫截面約1.5mm2長條(含初級視皮層的全層)，放于盛有戊二醛溶液的EP管中。經(jīng)前固定、洗凈、后固定、乙醇梯度脫水、氧化丙烯浸透、60%環(huán)氧樹脂氧化丙烯浸透、100%環(huán)氧樹脂包埋、組織切片、超薄切片，鉛鈾染色制成樣本。利用透射電鏡對兩組大鼠的初級視皮層V1M區(qū)第Ⅳ～Ⅵ層大錐體細(xì)胞周圍神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)隨機拍攝(1萬倍下每個樣本拍攝10張視野，每張視野都大于2500μm2，且每張視野都不重復(fù))。利用Image J軟件進(jìn)行突觸的標(biāo)記測量。并通過經(jīng)典突觸密度統(tǒng)計方法(NA/d法)計算突觸密度[11-12]。即突觸密度=NA/d。NA表示單位面積上的突觸數(shù)目；d為突觸橫斷面的長度。

1.2.4免疫熒光檢測大鼠視皮層中SYN的表達(dá)F-VEP檢測結(jié)束后取材，常規(guī)使用戊巴比妥鈉溶液麻醉動物，將兩組大鼠灌流取腦，4%多聚甲醛后固定，30%蔗糖脫水沉底。將沉底后的大鼠腦組織從蔗糖溶液中取出，-20℃的環(huán)境中進(jìn)行冰凍包埋，做連續(xù)的冠狀位切片，厚度為40μm。在冠狀位切片時注意邊切片邊觀察，依據(jù)視皮層出現(xiàn)的解剖學(xué)位置(可以在胼胝體分開后)開始收片。將切好的腦片放至裝有防凍液的EP管中，放入冰箱-20℃保存。利用漂染法對視皮層冰凍切片進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)染色，將腦片從EP管中取出放到TBS溶液中靜置10min恢復(fù)室溫，再用TBS溶液清洗3～5次，每次10min,主要洗去黏著在腦片的防凍液。用0.3% triton-X100,10%山羊血清作為封閉液，室溫封閉1h，封閉非特異性抗原。按濃度為1∶1000加入一抗SYN抗體室溫孵育1h后，再放入4℃過夜再孵育。用相同濃度的PBS溶液代替一抗作為陰性對照，可以排除非特異染色的影響。第2d取出用TBS溶液清洗3～5次，每次15min。再加入與一抗相對應(yīng)的二抗Alexa Fluor488室溫下避光孵育2h。清洗，晾干，貼片，滴加防熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片，指甲油封片，晾干，在激光共聚焦顯微鏡及熒光顯微鏡下進(jìn)行定位觀察和定量統(tǒng)計分析。此外，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》[10]選取左側(cè)視皮層組織區(qū)域在熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照,免疫熒光染色的每張切片在高倍鏡下隨機選取3個不重復(fù)視野,通過尼康NIS-Elements AR圖像處理軟件系統(tǒng)計算每張切片SYN陽性區(qū)域面積的強度值。

2結(jié)果

2.1兩組大鼠F-VEP檢查結(jié)果兩組大鼠F-VEP檢查結(jié)果示，與正常對照組相比，弱視模型組剝奪眼的P2潛伏期較正常眼明顯延長，P2波振幅較正常眼明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1，表1)，說明弱視造模成功。

圖1 兩組大鼠F-VEP檢查結(jié)果 A:正常對照組；B:弱視模型組。

表1 兩組大鼠F-VEP檢查結(jié)果

2.2兩組大鼠視皮層V1M區(qū)突觸密度的變化利用Image J軟件觀察并統(tǒng)計兩組大鼠雙側(cè)視皮層的突觸密度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對照組雙側(cè)視皮層相比，弱視模型組雙側(cè)視皮層的突觸密度顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中弱視眼對側(cè)視皮層下降更加明顯(表2，圖2)。

表2 兩組大鼠視皮層V1M區(qū)突觸密度的變化 個/μm3)

圖2 兩組大鼠雙側(cè)視皮層突觸電鏡圖 A：正常對照組右側(cè)視皮層；B：正常對照組左側(cè)視皮層；C：弱視模型組右側(cè)視皮層；D：弱視模型組左側(cè)視皮層。紅色箭頭所指即為突觸。

2.3兩組大鼠視皮層中SYN的表達(dá)情況本實驗根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》[10]選取左側(cè)視皮層(剝奪眼對側(cè))組織區(qū)域，利用熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡對視皮層切片進(jìn)行拍照處理。共聚焦顯微鏡下兩組大鼠視皮層區(qū)域組織結(jié)構(gòu)清晰、無皺褶，染色清晰，未見非特異性染色，均可見SYN陽性表達(dá)，與正常對照組相比，弱視模型組視皮層SYN陽性神經(jīng)元表達(dá)更弱。在熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照,統(tǒng)計每張切片SYN陽性區(qū)域面積的強度值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組左側(cè)視皮層(0.281±0.008)相比，弱視模型組剝奪眼對側(cè)視皮層(0.137±0.011)的SYN陽性神經(jīng)元表達(dá)強度值明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.494，P<0.01,圖3)。

圖3 共聚焦顯微鏡下兩組大鼠視皮層區(qū)域組織結(jié)構(gòu) A：正常對照組左側(cè)視皮層；B：弱視模型組剝奪眼對側(cè)視皮層。

3討論

F-VEP是一種檢測視網(wǎng)膜到視皮層傳導(dǎo)通路的客觀測量方法，它可以檢測視覺通路病變，評估視覺傳導(dǎo)功能，在弱視模型基礎(chǔ)研究中應(yīng)用廣泛[13-14]。李蘭等[15]在單眼形覺剝奪小鼠的基礎(chǔ)上同時研究小鼠F-VEP和初級視皮層V1區(qū)長時程增強(long-term potentiation，LTP)的變化，發(fā)現(xiàn)弱視小鼠的視皮層V1區(qū)LTP受損，正常組對應(yīng)的視皮層V1區(qū)可成功誘導(dǎo)LTP，說明形覺剝奪眼對應(yīng)的視皮層V1區(qū)LTP受損，突觸可塑性降低，從電生理角度促進(jìn)了弱視發(fā)生的視皮層突觸可塑性機制研究。哺乳動物皮層的興奮性突觸傳遞主要發(fā)生在樹突棘的頭部，而在視覺皮層中，約有95%的樹突棘形成突觸。本實驗以單眼形覺剝奪大鼠為弱視模型,采用電生理方法探討形覺剝奪后F-VEP的變化規(guī)律，對反映視皮層突觸強度的客觀視功能進(jìn)行評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，弱視模型組剝奪眼的P2波潛伏期較正常眼明顯延長，P2波振幅較正常眼明顯降低。根據(jù)之前相關(guān)研究推測，單眼剝奪可能導(dǎo)致了樹突棘形態(tài)和密度的改變[16-17]。在單眼剝奪后，剝奪眼接受的視覺刺激減弱，導(dǎo)致視覺通路突觸神經(jīng)元樹突棘形態(tài)和密度的變化，進(jìn)而引起突觸傳遞速度緩慢，最終在F-VEP上表現(xiàn)為P波潛伏期延長，振幅下降，從而可以作為驗證弱視造模成功的有效手段。

哺乳動物在出生后的一段時期內(nèi),其視覺系統(tǒng)的視皮層神經(jīng)元聯(lián)系及突觸結(jié)構(gòu)會隨著視覺經(jīng)驗的變化而發(fā)生改變，表現(xiàn)出與改變相對應(yīng)的可塑性，稱為視皮層突觸可塑性，這段時期是視覺發(fā)育的關(guān)鍵期[18]。Hubel等[19]研究單眼形覺剝奪對貓視覺皮層功能的影響，發(fā)現(xiàn)了視皮層具有經(jīng)驗依賴可塑性。在視皮層發(fā)育關(guān)鍵期，視覺經(jīng)驗的改變可以造成視皮層突觸可塑性的變化，在微觀水平上則表現(xiàn)為視皮層神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變。突觸是神經(jīng)元之間信息傳遞的基本單位,是視皮層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能發(fā)育的重要基礎(chǔ)，也是視覺發(fā)育可塑性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。視覺發(fā)育關(guān)鍵期視皮層突觸結(jié)構(gòu)存在功能可塑性。弱視的發(fā)生、發(fā)展與視皮層發(fā)育及突觸可塑性密切相關(guān)。因此對視皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化的研究可以更好地揭示單眼形覺剝奪性弱視的發(fā)病機制。本實驗采取突觸結(jié)構(gòu)經(jīng)典的特征性參數(shù)突觸密度來觀察和研究視皮層突觸的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)弱視模型組雙側(cè)視皮層的突觸密度比正常對照組顯著降低，且弱視剝奪眼對側(cè)視皮層下降更加明顯。表明單眼剝奪可以阻斷視覺發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)視皮層神經(jīng)元之間的突觸傳遞及功能聯(lián)系，這可能是導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)改變的病理基礎(chǔ)。在視覺發(fā)育的關(guān)鍵期，視皮層存在著突觸修剪的過程[20-21]，有序的修剪使雙眼的投射纖維在視皮層的投射更加精準(zhǔn)。我們推測單眼剝奪可能導(dǎo)致突觸修剪紊亂，從而造成突觸密度的下降。

SYN突觸蛋白位于突觸前末梢，是一種重要的突觸標(biāo)志物，在促進(jìn)突觸發(fā)育和調(diào)節(jié)可塑性中具有重要作用[22-23]，參與了視覺發(fā)育過程中視皮層神經(jīng)元突觸可塑性的形成和成熟。本實驗以Long Evans大鼠為研究對象，建立MD弱視經(jīng)典模型。Long Evans大鼠視覺系統(tǒng)神經(jīng)元的雙眼視覺較好，視網(wǎng)膜色素上皮層更接近人的視網(wǎng)膜生理結(jié)構(gòu)，在視覺神經(jīng)科學(xué)方面的研究具有較好的優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于眼科學(xué)研究。在視覺傳導(dǎo)過程中，由于視覺神經(jīng)元在視交叉處存在交叉投射，大鼠視皮層接受的信號大多來源于對側(cè)眼，這就造成剝奪眼對側(cè)視中樞所產(chǎn)生的剝奪效應(yīng)遠(yuǎn)大于剝奪同側(cè)[24]。因此比較兩組大鼠左側(cè)視皮層SYN突觸蛋白表達(dá)變化意義更大。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組左側(cè)視皮層相比，弱視模型組左側(cè)視皮層的SYN陽性神經(jīng)元表達(dá)強度值明顯降低。本研究中突觸蛋白水平的下降可能與單眼形覺剝奪后突觸結(jié)構(gòu)和功能損傷有關(guān)，異常的視覺刺激誘發(fā)了視皮層可塑性的顯著變化。根據(jù)之前相關(guān)研究[25]及本實驗結(jié)果推測可能是單眼形覺剝奪導(dǎo)致神經(jīng)突觸前末梢軸突減少而導(dǎo)致SYN表達(dá)量減少。另一方面可能是異常的視覺經(jīng)驗影響了視網(wǎng)膜-外側(cè)膝狀體-初級視皮層視覺傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致突觸神經(jīng)元之間的聯(lián)系減少，從而引起視覺中樞視皮層SYN的表達(dá)量減少。

總之，采用F-VEP檢測成功驗證了弱視模型的建立，對反映視皮層突觸強度的客觀視功能進(jìn)行評估，從電生理學(xué)角度進(jìn)一步研究單眼剝奪對視皮層突觸功能的影響；利用透射電子顯微鏡，展示了視覺發(fā)育關(guān)鍵期突觸結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，即MD弱視可造成視皮層突觸密度的改變，從視皮層突觸密度超微形態(tài)結(jié)構(gòu)角度來解釋弱視的發(fā)病機制。此外，我們發(fā)現(xiàn)SYN突觸蛋白在視皮層突觸可塑性調(diào)控中的作用是必要的，推測SYN影響視覺發(fā)育關(guān)鍵期視皮層突觸結(jié)構(gòu)與功能，這可能是弱視發(fā)病的重要分子機制之一。對于單眼形覺剝奪是如何通過調(diào)控視皮層神經(jīng)元宏觀突觸功能與微觀突觸結(jié)構(gòu)變化來影響弱視的發(fā)生、發(fā)展，未來值得探索。