辣木凝乳酶水解酪蛋白位點(diǎn)及其酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽

施婭楠，張家艷，黃艾祥

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

凝乳酶是奶酪加工的必需酶制劑。隨著全球奶酪產(chǎn)量的增加，越來越多的植物凝乳酶被研究。從番木瓜、菠蘿、姜根莖和洋薊花中提取的幾種植物凝乳酶已成功地應(yīng)用到奶酪的生產(chǎn)中[1]。在云南少數(shù)民族地區(qū)，人們利用貫筋藤、青羊參等植物浸泡后產(chǎn)生的溶液，作為凝固劑制作乳餅、奶酪。然而，不同的植物提取凝乳酶也被證明含有特定的活性成分、不同的酶切位點(diǎn)和最佳應(yīng)用條件，利用特定酶切位點(diǎn)的凝乳酶切割酪蛋白會(huì)產(chǎn)生一些功能活性肽，如酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）、酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）、抗菌肽、抗氧化肽、抗血栓肽、免疫活性肽等[2-4]。

辣木葉（Moringa oleiferaLam. leaf），是一種經(jīng)中國衛(wèi)生部批準(zhǔn)的新食品原料。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)辣木基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、化學(xué)成分、功能活性成分、藥理活性、鈣的生物學(xué)價(jià)值及安全性開展了系列研究工作[5]。辣木葉富含蛋白質(zhì)（鮮葉約6%、干葉約27%），是飲食和動(dòng)物飼料中蛋白質(zhì)的重要來源[6-7]，當(dāng)前對(duì)辣木葉蛋白的研究主要集中在蛋白酶抑制劑、糖蛋白及凝乳特性等方面[8]。研究表明，辣木花、葉、籽均具有酪蛋白水解活力和凝乳活力，其中辣木花凝乳成分是天冬氨酸、半胱氨酸、絲氨酸和Ca2+依賴性蛋白酶的混合物[9]；從辣木籽中分離得到的主要凝乳成分是一種天冬氨酸凝乳酶[10]。辣木葉中分離鑒定了一種絲氨酸內(nèi)肽酶，凝乳活力與水解活力比可達(dá)126.76，分子質(zhì)量56.146 kDa，等電點(diǎn)5.27，在65 ℃時(shí)達(dá)到最大凝乳活力，在溫度35～75 ℃之間活力穩(wěn)定。辣木凝乳酶的最適反應(yīng)pH值為8.0，酶活力在pH值4.0～9.0之間穩(wěn)定[11]，因此，辣木凝乳酶是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ闹参镄湍槊浮?/p>

凝乳酶首先水解位于酪蛋白表面的κ-酪蛋白（κ-CN），使包裹在里面的α-酪蛋白（α-CN）、β-酪蛋白（β-CN）暴露，進(jìn)而與Ca2+結(jié)合形成沉淀，導(dǎo)致凝乳[12]。小牛皺胃酶是一種經(jīng)典的凝乳酶，在牛乳凝固過程中特異性水解κ-CN的Phel05-Metl06肽鍵[13]。從豆蔻中純化的天冬氨酸蛋白酶，酶切Phe105-Met106、Lys116-Thr117導(dǎo)致凝乳[14]。江米酒中分離得到的分子質(zhì)量36 kDa凝乳酶，通過飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)其在κ-CN中的水解位點(diǎn)為Thr94-Met95[15]。Egito等[16]報(bào)道了合歡和葵花籽凝乳酶的酶切位點(diǎn)分別為L(zhǎng)ys116-Thr117和Phe105-Met106。Huang等[17]從新鮮生姜中分離并提取31 kDa蛋白酶，能水解α-CN、κ-CN和β-CN，其中對(duì)α-CN的水解能力最強(qiáng)，對(duì)κ-CN的水解位點(diǎn)為Ala90-Glu91和His102-Leu103。云南當(dāng)?shù)氐? 種野生植物貫筋藤和青羊參，是制作乳餅的乳凝乳劑，該凝乳酶的酶切位點(diǎn)分別是Ala90-Gln91和Ser132-Thr133[18-19]。

本研究旨在分析辣木凝乳酶的酶切位點(diǎn)及其對(duì)酪蛋白的水解特性，對(duì)酶切產(chǎn)生的酪蛋白磷酸肽和酪蛋白糖巨肽進(jìn)行研究。以期為辣木凝乳酶在奶酪、乳餅加工，及其定向水解乳蛋白獲得特定功能性水解產(chǎn)物，功能性乳制品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：辣木凝乳酶為本實(shí)驗(yàn)室篩選、純化，其凝乳活力為253.27 SU/mL，最適溫度65 ℃，最適pH 8.0。蛋白Marker、酪蛋白、α-CN、β-CN和κ-CN 美國Sigma-Aldrich公司；木瓜蛋白酶（酶活力為8×105U/g） 上海源葉生物科技有限公司；小牛皺胃酶（酶活力為3×105U/g） 生工生物工程（上海）股份有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（5×） 中國Biosharp生物公司；SDS-PAGE凝膠速配試劑盒 美國GenScript公司；唾液酸測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL20M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；電泳儀、電泳自動(dòng)成像儀 美國Bio-Rad公司；Orion Star T900自動(dòng)電位滴定儀、Q Exactive四極桿質(zhì)譜儀、Easy-nLC1000液相色譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白水解分析

根據(jù)Huang等[17]的研究測(cè)定酪蛋白水解程度。將辣木凝乳酶、α-CN、β-CN和κ-CN（各50 mg）分別溶于10 mL的10 mmol/L檸檬酸磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）中制備。辣木凝乳酶以1∶10（V/V）的比例與κ-CN在65 ℃反應(yīng)4 h，并以小牛皺胃酶作為對(duì)照；辣木凝乳酶以1∶10（V/V）的比例分別與α-CN、β-CN作用，在65 ℃反應(yīng)15、30、60 min。同樣，辣木凝乳酶與κ-CN在65 ℃反應(yīng)5、10、15、30、45、60、120 min，利用SDS-PAGE（上樣量5 μL）分析酪蛋白水解程度。蛋白上樣量為15 μL，利用SDS-PAGE和ImageJ軟件分析3 種酪蛋白組分的水解程度。

1.3.2 蛋白酶對(duì)κ-CN裂解位點(diǎn)的分析

根據(jù)Luo Jie等[19]的研究進(jìn)行一定修改。將κ-CN溶解于濃度為10 mmol/L檸檬酸磷酸鹽緩沖液（pH 6.5），并調(diào)節(jié)溶液濃度為5 mg/mL。分別將辣木凝乳酶和小牛皺胃酶與κ-CN以1∶110的比例混合，然后在65 ℃反應(yīng)40 min，以完全確保乳蛋白凝固。將混合物與載樣液在95 ℃處理5 min，然后利用SDS-PAGE進(jìn)行分離。從凝膠中切下目標(biāo)蛋白條帶進(jìn)行納升級(jí)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Q exactive nano-liquid chromatograph-mass spectrometry，nano-LCQE-MS/MS）分析。具體操作步驟如下：

1）供試品酶解：供試品經(jīng)過還原和烷基化處理后，加入Trypsin（質(zhì)量比1∶50），在37 ℃酶解20 h。酶解產(chǎn)物脫鹽后凍干，復(fù)溶于體積分?jǐn)?shù)為0.1%的氟乙酸溶液中，-20 ℃保存待用。

2）色譜分析：A液為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸溶液，B液為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈溶液（乙腈體積分?jǐn)?shù)為84%）。色譜柱以體積分?jǐn)?shù)95%的A液平衡后，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣至Trap柱。0.5 H梯度。

3）色譜數(shù)據(jù)采集：多肽和多肽碎片的質(zhì)荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集20 個(gè)碎片圖譜（MS2 scan）。

4）數(shù)據(jù)分析：質(zhì)譜測(cè)試原始文件用Mascot2.2軟件檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。搜庫參數(shù)如下：酶：胰蛋白酶；數(shù)據(jù)庫：uniprot_Bos_taurus_46721_20191014；漏切點(diǎn)：2；肽質(zhì)量誤差范圍：20×10-6；碎片質(zhì)量誤差范圍：0.1 Da。

1.3.3 辣木凝乳酶作用下的κ-CN動(dòng)力學(xué)分析

根據(jù)Nafiet等[20]的研究進(jìn)行了一些修改。將5 mg/mL的κ-CN儲(chǔ)備溶液溶解于10 mmol/L檸檬酸磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）中，然后用緩沖液稀釋至質(zhì)量濃度0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL。首先將稀釋溶液在65 ℃孵育5 min，然后按酶與底物比1∶10（V/V）的比例添加辣木凝乳酶。反應(yīng)10 min后，立即加入相同體積的5%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。動(dòng)力學(xué)參數(shù)Michaelis常數(shù)（Km）、最大反應(yīng)速率Vm使用Line-weaver-Burk圖計(jì)算。

1.3.4 水解酪蛋白制備CPPs

配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL的酪蛋白溶液，利用0.1 mol/L NaOH溶液在磁力攪拌器下使其完全溶解，分別加入辣木凝乳酶，小牛皺胃酶和木瓜蛋白酶，酶與底物的質(zhì)量比為1∶70，于65 ℃恒溫水解2 h，93 ℃熱處理10 min以終止反應(yīng)。CPPs提取采用鋇-乙醇沉淀法[21]，另取不加蛋白酶的酪蛋白溶液測(cè)定酪蛋白內(nèi)源CPPs的含量。

1.3.5 CPPs持鈣能力測(cè)定

采用pH-stat法測(cè)定CPPs的持鈣能力[22]。稱取CPPs凍干粉0.10 g，加100 mL 0.016 mol/L的NaH2PO4溶液將其溶解，并置于37 ℃水浴中反應(yīng)，加入濃度為0.016 mol/L的CaCl2100 mL，立即用0.1 mol/L NaOH溶液將反應(yīng)體系調(diào)至pH 7.2，并不斷滴加NaOH使反應(yīng)液pH值保持恒定。從調(diào)節(jié)pH值開始計(jì)時(shí)，在2 min內(nèi)將反應(yīng)體系調(diào)至pH 7.2，從2 min開始連續(xù)記錄0.1 mol/L NaOH的消耗量。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，0.1 mol/L NaOH溶液的消耗量為縱坐標(biāo)，得到持鈣能力曲線。以不加CPPs為對(duì)照。

1.3.6 水牛乳酶解液中CGMP的檢測(cè)[23]

1.3.6.1 乳清中唾液酸含量的測(cè)定

κ-CN是酪蛋白中唯一含糖的蛋白質(zhì)，唾液酸通過糖苷鍵與糖蛋白的糖鏈相連接并集中在酪蛋白糖巨肽上，因此唾液酸的含量可以表征CGMP。辣木凝乳酶，木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶與脫脂水牛乳（4 ℃、3 000×g離心10 min），酶的添加量（以脫脂水牛乳體積的7%）反應(yīng)40 min使其形成穩(wěn)定凝團(tuán)，離心除去乳清中殘留的大顆粒酪蛋白凝塊（4 ℃、9 000×g離心10 min）。然后，通過三氯乙酸沉淀法進(jìn)一步除雜，上清截流于分子質(zhì)量1 000 U透析袋，冷凍干燥（5～10 MPa，-50 ℃）。采用唾液酸測(cè)定試劑盒測(cè)定唾液酸含量。

1.3.6.2 水解度測(cè)定

采用pH-stat法，水解度的計(jì)算公式為：

式中：h為單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵的量/（mmol/L）；htot為單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中肽鍵的總量/（mmol/L），乳酪蛋白的htot為8.2 mmol/L；B為水解過程中的耗堿量/mL；Nb為堿液濃度/（mol/L）；MP為水解液中蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；a為校正系數(shù)（設(shè)辣木凝乳酶=1）。

1.3.6.3 CGMP的糖基化度

CGMP片段中唾液酸含量與蛋白質(zhì)含量的比值越大，則糖基化度越大。糖基化度為間苯二酚-鹽酸法測(cè)定唾液酸在580 nm波長(zhǎng)處的吸光度與水解液中蛋白含量的比值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均做3 次平行實(shí)驗(yàn)，使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，處理結(jié)果以表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木凝乳酶對(duì)κ-CN的酶切位點(diǎn)

小牛皺胃酶對(duì)κ-CN的高度特異性和穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于奶酪加工，所產(chǎn)奶酪質(zhì)地均勻，具有良好的風(fēng)味。因此，本研究以小牛皺胃酶為陽性對(duì)照，研究辣木凝乳酶對(duì)κ-CN的酶切位點(diǎn)及水解特性。在所有酪蛋白組分中，κ-CN在穩(wěn)定酪蛋白膠束方面起著關(guān)鍵作用，凝乳過程中親水性的部分被凝乳酶切斷，而N端疏水性的部分保留在蛋白膠束上。由圖1所示，凝乳酶與κ-CN反應(yīng)4 h后，κ-CN條帶顏色變淺，在分子質(zhì)量10～15 kDa之間（約13 kDa）形成明顯的蛋白條帶。同時(shí)，經(jīng)典的小牛皺胃酶水解κ-CN，形成的蛋白條帶同樣位于分子質(zhì)量10～15 kDa之間。

圖1 辣木凝乳酶與κ-CN反應(yīng)4 h的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of κ-CN hydrolyzed with milk-clotting protease for 4 h

辣木凝乳酶與κ- CN反應(yīng)4 h后，通過SDS-PAGE獲得該分子質(zhì)量的電泳條帶，從凝膠中切割κ-CN條帶，采用還原烷基化和胰蛋白酶消化后，利用nanoLC-QEMS/MS進(jìn)行肽段序列鑒定，從而獲得κ-CN膠內(nèi)酶解肽序列。根據(jù)肽段Score值，一般情況下肽段篩選的最低分為20，分值越高說明肽段二級(jí)圖譜的匹配程度越好，表明對(duì)κ-CN的酶切位點(diǎn)進(jìn)行了有效鑒定。從49 條肽段中得到4 條得分值最高的肽段，且均來自于κ-CN，分別為：DERFFSDKIA（分子質(zhì)量：1 229.11 Da；Score值：56.99）、YIPIQYVLSRY（1 251.71 Da；49.52）、RSPAQILQWQVLSNTVPA（1 980.09 Da，64.19）、SCQAQPTTMAR（1 266.56 Da，51.54）（圖2）。

根據(jù)胰蛋白酶優(yōu)先在Arg和Lys處裂解[24]，通過對(duì)胰蛋白酶和重疊肽的去除，可以得出結(jié)論：通過查找數(shù)據(jù)庫比對(duì)κ-CN整個(gè)氨基酸序列確定辣木凝乳酶對(duì)κ-CN的酶切位點(diǎn)為R-H，即Arg 93-His 94。將κ-CN水解成分子質(zhì)量為13 127.38 Da的副κ-CN（f1-93）和分子質(zhì)量為7 616.49 Da的κ-CN（f94-169）片段。質(zhì)譜結(jié)果與電泳結(jié)果觀察到的分子質(zhì)量一致（約13 kDa，圖1）。部分肽序列的缺失可能是由于κ-CN進(jìn)一步水解成小肽而引起的，小分子肽無法被質(zhì)量分析器檢測(cè)。辣木凝乳酶的切割位點(diǎn)不同于其他已報(bào)道的動(dòng)物、植物或微生物凝乳酶，酶切位點(diǎn)的不同，使得奶酪加工工藝、干酪風(fēng)味形成以及生物活性肽功能各不相同，如不同于κ-CN氨基酸切位點(diǎn)Phel05-Metl06的小牛凝乳酶，分析κ-CN的水解位點(diǎn)是揭示其凝乳機(jī)制重要手段。

圖2 辣木凝乳酶對(duì)κ-CN酶切產(chǎn)物的basepeak圖及酶切位點(diǎn)Fig.2 Basepeak plot and cleavage site of M. oleifera milk-clotting protease toward κ-CN

辣木凝乳酶屬于絲氨酸蛋白酶家族，酶切κ-CN精氨酸與組氨酸之間的肽鍵形成凝乳，使之在奶酪加工中具有一定的潛力。胰蛋白酶也是絲氨酸蛋白酶家族的成員之一，水解精氨酸或賴氨酸羧基所構(gòu)成的肽鏈（除非這兩個(gè)氨基酸之后有脯氨酸直接相連）[25]，該酶目前是質(zhì)譜技術(shù)中常用的蛋白水解酶。馮穎杰[26]純化的米曲霉蛋白酶PA能識(shí)別酪蛋白中-Cys-Gly-、-Glu-Ala-、-Arg-Gly-組成的肽鍵并選擇性酶切，可制備功能性CPPs和抗氧化活性肽。大多數(shù)酪蛋白的酶解物可表現(xiàn)出較強(qiáng)的ACE抑制活性，且C末端具有帶正電荷的精氨酸和賴氨酸能提高ACE抑制活性。親水性氨基酸如精氨酸、賴氨酸、谷氨酸及天冬氨酸等氨基酸殘基與活性肽的過敏性有關(guān)，采用專一水解此類氨基酸殘基的蛋白酶制備活性肽可以降低其過敏性[27]。此外，在獲得凝乳酶一級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，也可實(shí)現(xiàn)虛擬酶解，結(jié)合現(xiàn)有的生物活性肽數(shù)據(jù)庫，如BIOPEP、EROP-Moscow，揭示酶解肽片段潛在的生物活性。

2.2 辣木凝乳酶作用下κ-CN的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

凝乳酶對(duì)κ-CN的水解效率越高，酪蛋白膠束的聚集速度越快[28]。因此，通過對(duì)κ-CN酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的評(píng)價(jià)，可以更好地了解其凝乳行為。

圖3 以κ-CN為底物的辣木凝乳酶動(dòng)力學(xué)分析Fig.3 Kinetic analysis of κ-CN hydrolysis by milk-clotting protease

辣木凝乳酶水解κ-CN的1/V與1/[S]曲線圖如圖3所示。Km是產(chǎn)生最大速度值50%所需的基質(zhì)濃度。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，較低的Km表示對(duì)底物的酶親和力較高[29]，反映了凝乳酶對(duì)κ-CN的蛋白水解效率，有利于κ-CN疏水性N端部分的快速產(chǎn)生，形成穩(wěn)定的蛋白膠束。κ-CN對(duì)辣木凝乳酶的Km和Vmax值分別為0.49 mg/mL和45.2 U/min。在65 ℃下，辣木凝乳酶的Km值大于生姜蛋白酶的Km值（0.237～0.359 mg/mL）[17]，而與淀粉樣芽孢桿菌D4中純化的一種金屬蛋白酶（Km值為0.471 mg/mL）接近[29]，辣木凝乳酶對(duì)酪蛋白的親和力高于毛霉屬的天冬氨酸凝乳酶（Km值為3.88 mg/mL）。

2.3 辣木凝乳酶對(duì)α-、β-、κ-CN的水解能力分析

辣木凝乳酶處理乳蛋白，可在40 min內(nèi)形成穩(wěn)定、質(zhì)地均勻的凝團(tuán)。為了進(jìn)一步研究辣木凝乳酶的蛋白水解特性，利用SDS-PAGE分析了酪蛋白組分在0～60 min過程的水解情況，如圖4～6所示。酪蛋白水解的蛋白產(chǎn)物可以通過凝膠掃描定量，進(jìn)行密度測(cè)定[30]。

圖4 辣木凝乳酶與α-CN不同反應(yīng)時(shí)間的SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of α-CN hydrolyzed with milk-clotting protease for different timeframe

由圖4可知，α-CN在15 min的反應(yīng)時(shí)間即可發(fā)生較大程度的水解，形成分子質(zhì)量低于15 kDa的蛋白產(chǎn)物，說明辣木凝乳酶對(duì)α-CN敏感，能在短時(shí)間破壞其空間結(jié)構(gòu)。反應(yīng)60 min，蛋白條帶明顯變淺或消失。Jiang等[15]的研究表明，江米酒凝乳酶是另一種制作宮廷奶酪的酶制劑，同樣的，相較于β-CN，該酶對(duì)α-CN和κ-CN表現(xiàn)出更高的水解能力，在反應(yīng)5～30 min發(fā)生大規(guī)模水解。辣木凝乳酶水解60 min時(shí)，α-CN的條帶顏色變淺，說明蛋白被水解為分子質(zhì)量小于25 kDa的蛋白質(zhì)或多肽。Hayaloglu等[31]小牛皺胃酶和米黑根莖凝乳酶是制作Malatya干酪的酶制劑，具有較強(qiáng)的α-CN水解程度，表現(xiàn)為質(zhì)地較軟和融化性較好。De Jong等[32]通過單軸壓縮實(shí)驗(yàn)表明，切達(dá)干酪的壓縮百分比和斷裂力的降低與成熟過程中α-CN的快速水解有關(guān)，與成熟期間的軟化程度呈正相關(guān)。

圖5 辣木凝乳酶與β-CN不同反應(yīng)時(shí)間的SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE analysis of β-CN hydrolyzed with milk-clotting protease for different timeframe

由圖5可知，在反應(yīng)時(shí)間為15 min時(shí)，β-CN水解為分子質(zhì)量10～15 kDa的蛋白質(zhì)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，β-CN逐漸水解為分子質(zhì)量更低的小分子蛋白。辣木凝乳酶對(duì)β-CN水解速度比α-CN慢，β-CN作為酪蛋白疏水性最強(qiáng)的蛋白質(zhì)，在水解過程中，疏水性氨基酸殘基在多肽鏈中易形成空間位阻，阻礙酶解反應(yīng)[33]。Cavalli等[30]對(duì)水飛薊提取物水解α-CN和β-CN酪蛋白的動(dòng)力學(xué)分析表明，α-CN比β-CN酶解更迅速，且水解產(chǎn)物更加廣泛。微生物凝乳酶除了能水解κ-CN外，也容易水解α-和β-CN中的某些肽鍵，但對(duì)α-和β-CN的磷酰胺鍵水解較為緩慢。干酪成熟過程中的流變學(xué)特征變化復(fù)雜，主要受α-CN、β-CN影響，α-CN的水解程度與干酪硬度成負(fù)相關(guān)，而β-CN的水解則與干酪融化性呈負(fù)相關(guān)，與硬度呈正相關(guān)[34]。干酪成熟過程中蛋白質(zhì)水解對(duì)風(fēng)味特性也有著極其重要的影響。早期研究，植物源凝乳酶過度水解α-CN、β-CN后會(huì)產(chǎn)生苦味肽，使得其被限制使用，但不同的植物凝乳酶酶切形成的肽段大不相同，使得從植物中提取新型凝乳酶的探索仍然在繼續(xù)。

圖6 辣木凝乳酶對(duì)κ-CN不同反應(yīng)時(shí)間的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE analysis of κ-CN hydrolyzed with milk-clotting protease for different timeframe

乳蛋白中，κ-CN的水解是導(dǎo)致凝乳的核心因素。辣木凝乳酶與κ-CN之間的反應(yīng)如圖6所示，反應(yīng)5 min時(shí)，副κ-CN立即產(chǎn)生，這對(duì)于凝乳效果、酪蛋白膠束的聚集極為重要。反應(yīng)10～45 min內(nèi)，代表了在早期反應(yīng)階段形成的產(chǎn)物，該過程水解較為緩慢，蛋白分子質(zhì)量均分布于10～15 kDa之間。有研究表明，只有當(dāng)足夠的κ-CN被水解時(shí)，通常水解度要達(dá)到80%～90%時(shí)凝乳狀態(tài)最好，此時(shí)大量的副產(chǎn)物發(fā)生聚集形成三維網(wǎng)狀凝膠[32]。水解至60 min時(shí)，除副κ-CN外，其余蛋白條帶被水解。

2.4 辣木凝乳酶水解酪蛋白生成CPPs及其持鈣能力

經(jīng)測(cè)定，酪蛋白內(nèi)源性CPPs含量為3.71%；酪蛋白經(jīng)辣木凝乳酶水解后，CPPs含量為19.58%，凈產(chǎn)率為15.87%。在相同的條件下，利用小牛皺胃酶獲得的CPPs 產(chǎn)率為29.17%，凈產(chǎn)率25.46%；利用木瓜蛋白酶獲得的CPPs 產(chǎn)率為21.55%，凈產(chǎn)率17.84%。

圖7 酪蛋白磷酸肽持鈣能力Fig.7 Calcium-binding ability of CPPs

持鈣能力是CPPs的功能性指標(biāo)，是檢測(cè)其品質(zhì)的有效手段，pH-stat法是測(cè)定CPPs持鈣能力普遍采用的方法。在弱堿性條件下，NaH2PO4與CaCl2形成Ca3(PO4)2會(huì)釋放H+，在維持體系pH值不變的同時(shí)，NaOH溶液的加入量與Ca3(PO4)2形成量一致。如圖7所示，未加CPPs時(shí)磷酸鈣沉淀迅速形成；加入辣木凝乳酶制備的CPPs后，CPPs與溶液中的鈣離子結(jié)合形成較穩(wěn)定的絡(luò)合物，在堿性條件緩慢形成沉淀，于23 min沉淀完全，CPPs推遲鈣離子沉淀的效果，有利于鈣離子被腸道有效吸收。在同等條件，木瓜蛋白酶與小牛皺胃酶分別為25 min和30 min（P＜0.05）。陳雪香等[22]研究了8 種商品所含CPPs的持鈣能力，其中7 種CPPs延緩鈣離子沉淀的時(shí)間在18～29 min之間，本研究從一定程度上反映出辣木凝乳酶水解獲得的CPPs具有較好的品質(zhì)。辣木凝乳酶具備較大的開發(fā)潛力，可以進(jìn)一步通過優(yōu)化酶解條件獲得更高產(chǎn)率和純度的酪蛋白磷酸肽。

2.5 酶解液的水解度、糖基化程度和CGMP的含量

如表1所示，辣木凝乳酶、木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶可以很好地水解水牛乳酪蛋白，而木瓜蛋白酶對(duì)酪蛋白水解作用最強(qiáng)（P＜0.05）。辣木凝乳酶制備CGMP的研究表明，在CGMP的含量及其糖基化度等方面均與商業(yè)化凝乳酶（木瓜蛋白酶、小牛皺胃酶）無顯著差異（P＞0.05）。到目前為止，有關(guān)CGMP的生理功能和對(duì)機(jī)體健康的生物學(xué)功效已有較多的報(bào)道[35]，CGMP的糖鏈含量十分豐富，使其在嬰兒食品、標(biāo)準(zhǔn)化食品中提供了一種功能因子，而且能增加乳、奶酪等乳制品的附加值。此外，水牛乳酪蛋白經(jīng)過辣木凝乳酶水解后，水解液經(jīng)進(jìn)一步純化所得肽段（命名為BCp08）對(duì)4 種食源性致病菌，特別是對(duì)5 種多重耐藥致病菌具有較強(qiáng)的抑制活性，分別是耐PEN（青霉素）、OXA（苯唑西林）、ERY（紅霉素）、CLI（克林霉素）、CFX（頭孢西?。┑慕瘘S色葡萄球菌，相關(guān)工作仍在研究中。

表1 酶解液的水解度、糖基化程度和CGMP含量Table 1 Degree of hydrolysis, degree of glycosylation and CGMP content of enzymatic hydrolysates

3 結(jié) 論

研究κ-CN的水解位點(diǎn)是揭示其凝乳機(jī)制的重要手段，辣木凝乳酶對(duì)κ-CN的酶切位點(diǎn)為Arg 93-His 94，具有明顯特異性。酶切酪蛋白可在較短時(shí)間內(nèi)生成分子質(zhì)量13 127.38 Da的副κ-CN，有效促進(jìn)酪蛋白膠束的聚集和凝乳。酶凝的過程中對(duì)α-CN、β-CN產(chǎn)生不同程度的水解，對(duì)α-CN的水解速度最快，表明在軟質(zhì)奶酪的加工具有較高的應(yīng)用前景。辣木凝乳酶水解酪蛋白產(chǎn)生豐富的酪蛋白糖巨肽和酪蛋白磷酸肽，增強(qiáng)了乳制品的生物學(xué)價(jià)值。研究為新型植物凝乳酶、及其定向水解乳蛋白獲得特定功能性水解產(chǎn)物，功能性乳制品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。