豆渣可溶酸性多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)解析

王思琪，胡彥波，翟麗媛，石曾卉，趙 珺

（長(zhǎng)春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022）

多糖是一類具有抗氧化、降血糖[1]、降血脂[2]、增強(qiáng)免疫和延緩衰老[3]等功能的高分子化合物，是食品中的主要功能因子之一。水溶性大豆多糖（soluble soybean polysaccharides，SSPS）是一種從大豆種皮、子葉和豆渣中提取的可溶性多糖。研究表明：豆渣的膳食纖維部分主要含有30%的水溶性多糖，是具有潛在價(jià)值的巨大資源[4]。從大豆種皮中提取的酸性多糖主要由半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I（rhamnogalacturonan，RG-I）組成，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是以鼠李半乳糖醛酸和高聚半乳糖為主鏈、半乳聚糖和阿拉伯糖為側(cè)鏈形成的近似球狀體結(jié)構(gòu)[5]。從大豆子葉中提取的酸性多糖主要由D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸和L-鼠李糖組成。其化學(xué)結(jié)構(gòu)是由→4)-α-D-GalpA-(1→4)-α-D-GalpA-單元和→4)-α-D-GalpA-(1→2)-α-L-Rhap-單元構(gòu)成主鏈的基本骨架，側(cè)鏈部分包含β-1,4-Galp和α-1,5-Araf[6]。目前，對(duì)于從豆渣中提取的酸性多糖的基本結(jié)構(gòu)特征研究尚不深入，限制了其在食品中的應(yīng)用。

SSPS是一種酸性多糖，與其他生物多糖相比，其黏度較低，可制成高濃度低黏的水溶液，溶液黏度幾乎不受鹽類影響，對(duì)溫度的熱穩(wěn)定性也優(yōu)于其他糖類[7-9]。SSPS具有高溶解性、抗氧化性、乳化性和穩(wěn)定性好等優(yōu)良特性，可有效改善食品的食用品質(zhì)、加工特性和外觀特征[10-12]，是一種具有潛在價(jià)值的食品添加劑。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)豆渣可溶酸性多糖進(jìn)行分離純化，并對(duì)純化后電荷和分子質(zhì)量均一的部分進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。研究結(jié)果將為豆渣可溶酸性多糖產(chǎn)品的深入研究提供理論依據(jù)，使?fàn)I養(yǎng)成分得以全面開發(fā)，同時(shí)解決廢棄豆渣所造成的環(huán)境污染，為豆渣的開發(fā)利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆渣由榆樹市榆鄉(xiāng)豆制品有限公司提供；苯酚、硫酸（均為分析純） 北京化工廠有限責(zé)任公司；DEAE纖維素 上海源葉生物科技有限公司；鼠李糖（rhamnose，Rha）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）、甘露糖（mannose，Man）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖 （galactose，Gal）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、木糖（xylose，Xyl）、巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）標(biāo)準(zhǔn)品 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇、氯化鈉（均為色譜純） 安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1901紫外-可見分光光度計(jì) 億鑫儀器設(shè)備有限公司；Nicolet is5傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；3K15臺(tái)式高速離心機(jī)、BM312-B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LC-20AT高效液相色譜儀（配有CTO-20A泵和SPD-20AVD紫外光檢測(cè)器） 日本島津公司；AV 600 MHz核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）儀 德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 豆渣多糖的制備

稱取豆渣4 kg，在料液比1∶25（g/mL）、提取時(shí)間4 h、加酶量2%、酶解溫度50 ℃條件下提取豆渣。首先調(diào)節(jié)pH值為4，加入2%的纖維素酶酶解2 h，再加入2%的酸性蛋白酶酶解2 h。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將多糖溶液濃縮至原體積的1/3，并利用70%乙醇溶液進(jìn)行過(guò)夜醇沉后，4 000 r/min離心20 min棄去上清液得到沉淀，60 ℃水浴不停地?cái)嚢韬娓?，除去乙醇后，加dH2O溶解，冷凍干燥得到豆渣粗多糖（SSPS）。

1.3.2 豆渣可溶酸性多糖的分離純化

1.3.2.1 豆渣可溶酸性多糖的離子交換色譜

準(zhǔn)確稱取豆渣粗多糖（SSPS）粉末2 g，用100 mL的dH2O將其溶解，離心后取上清液緩慢加到DEAECellulose色譜柱中，待樣品完全進(jìn)入纖維素柱后，用dH2O壓樣2 次，保證樣品完全進(jìn)入纖維素柱，用dH2O洗去中性糖，再用0～0.5 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速1.5 mL/min，4 min收集一管，用自動(dòng)收集器收集洗脫液。利用苯酚-硫酸法[13]在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定收集液的吸光度，繪制洗脫曲線圖，確定豆渣可溶酸性糖梯度洗脫的鹽離子濃度，根據(jù)洗脫曲線圖收集電荷均一的對(duì)稱峰，透析濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，獲得電荷均一組分。

1.3.2.2 豆渣可溶酸性多糖的凝膠過(guò)濾色譜

稱取豆渣酸性多糖SSPS-A1 100 mg，溶于2 mL的dH2O中，離心去除沉淀，然后將上清液上樣于平衡好的Sepharose CL-6B凝膠色譜柱，洗脫液為0.15 mol/L NaCl溶液，流速0.15 mL/min，每管收集液體體積3 mL。利用苯酚-硫酸法[13]測(cè)定SSPS-A1洗脫液中的糖含量分布。根據(jù)SSPS-A1的糖含量分布曲線，收集合適的洗脫峰，透析濃縮凍干，獲得分子質(zhì)量均一組分。

1.3.3 豆渣可溶酸性多糖的糖含量、糖醛酸含量和蛋白含量的測(cè)定

1.3.3.1 糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[13]以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品；配制不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中總糖含量的測(cè)定：將樣品配制成0.1 mg/mL的多糖溶液，取樣600 μL，加400 μL的dH2O，其余步驟按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟進(jìn)行，做3 組平行實(shí)驗(yàn)，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的糖含量。

1.3.3.2 糖醛酸含量的測(cè)定

采用間羥基聯(lián)苯法[14]以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品；配制不同質(zhì)量濃度的半乳糖醛酸溶液，在波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定吸光度。以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中糖醛酸含量的測(cè)定：將樣品配制成0.1 mg/mL多糖溶液，取樣400 μL，其余步驟按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟進(jìn)行，做3 組平行實(shí)驗(yàn)，在波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的糖醛酸含量。

1.3.3.3 蛋白含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[15]以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品；配制不同質(zhì)量濃度的牛血清蛋白溶液，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度。以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中蛋白含量的測(cè)定：將樣品配制成1 mg/mL多糖溶液，取樣400 μL，其余步驟按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟進(jìn)行，做3 組平行實(shí)驗(yàn)，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的蛋白含量。

1.3.4 豆渣可溶酸性多糖的單糖組成分析

稱取1 mg多糖樣品置于酸水解小瓶中，加入1 mL的2 mol/L鹽酸-甲醇溶液，充N2密封后，置于80 ℃金屬浴中水解10 h后用空氣泵吹干，再加入1 mL的2 mol/L三氟乙酸溶液，于120 ℃金屬浴中水解1 h，用空氣泵吹干除去三氟乙酸[16]。稱取100 μL 1 mg/mL的Man、GlcA、Rha、GalA、Glc、Gal、Xyl、Ara和Fuc標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)品混合液，置于酸水解小瓶中備用。

向完全酸水解后得到的干燥樣品和標(biāo)樣中加入500 μL的0.3 mol/L NaOH溶液，使樣品充分溶解，再加入500 μL的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液，使其混合，取出200 μL混合液于1.5 mL EP管中。將樣品和標(biāo)樣在70 ℃條件下水浴反應(yīng)0.5 h，分別加入100 μL的0.3 mol/L HCl溶液，充分混勻后加入700 μL CH3Cl，充分振蕩后，萃取得到剩余的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇試劑，棄去CH3Cl層，保留水層，重復(fù)操作萃取3 次。0.22 μm濾膜過(guò)濾，然后進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)[17-18]。

高效液相色譜條件：DIKMA Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×150 mm）；流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L、pH 7.0）-乙腈（81∶19，V/V）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。

1.3.5 豆渣可溶酸性多糖的分子質(zhì)量測(cè)定

稱取2 mg多糖，溶解于400 μL 0.2 mol/L NaCl溶液中，利用LC-10ATvp高效液相色譜系統(tǒng)，RID-10A示差檢測(cè)器及TSK-gel G-3000 PWXL色譜柱測(cè)定分離純化后多糖的分子質(zhì)量分布情況[19]，TSK-gel G-3000 PWXL流速0.6 mL/min，流動(dòng)相為0.2 mol/L NaCl溶液，柱溫35 ℃。

1.3.6 豆渣可溶酸性多糖均一組分的紅外光譜分析

取干燥的多糖粉末樣品1 mg，與180 mg KBr一起研磨后制成透明壓片，使用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～500 cm-1的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描分析[20]。

1.3.7 豆渣可溶酸性多糖均一組分的核磁分析

稱取待測(cè)樣品15 mg，充分溶解于0.5 mL D2O中。采用AV 600 MHz NMR波譜儀檢測(cè)樣品的13C NMR譜，檢測(cè)頻率為150 MHz[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣可溶酸性多糖的離子交換色譜

圖1 豆渣可溶酸性多糖的梯度洗脫圖Fig.1 Gradient elution curves of acidic polysaccharides from soybean dregs

通過(guò)DEAE-Cellulose對(duì)豆渣可溶酸性多糖經(jīng)0～0.5 mol/L NaCl線性梯度進(jìn)行洗脫，結(jié)果如圖1所示。在DEAE-Cellulose離子交換色譜的吸附能力范圍內(nèi)，不帶電荷的中性多糖組分首先被dH2O洗脫下來(lái)，帶電荷的酸性多糖組分隨著NaCl濃度的增加而逐漸被洗脫下來(lái)，并在0.19 mol/L和0.34 mol/L的NaCl溶液處有2 個(gè)較為明顯的洗脫峰，分別命名為SSPS-A1和SSPS-A2，得率分別為45.5%和10.3%。收集樣品，濃縮透析，凍干。

2.2 豆渣可溶酸性多糖的化學(xué)組成和單糖組成分析

如表1所示，SSSP-A1和SSPS-A2的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為64.5%和52.6%。糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為31.1%和24.6%，而蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為1.3%和1.2%。對(duì)比大豆可溶性多糖提取的相關(guān)文獻(xiàn)[10]可知，本次提取的豆渣可溶酸性多糖的蛋白質(zhì)含量極低，因此本實(shí)驗(yàn)不需要對(duì)這2 個(gè)組分進(jìn)行除蛋白處理。同時(shí)2 個(gè)組分的總糖含量、糖醛酸含量和蛋白含量無(wú)顯著差異。進(jìn)一步對(duì)二者的單糖組成進(jìn)行分析，結(jié)果表明組成SSPS-A1和SSPS-A2的單糖存在一定差異。SSPS-A1主要由GalA、Gal和Ara組成，推測(cè)SSPS-A1可能由半乳糖醛酸聚糖（HG型）果膠（主要含有GalA）和阿拉伯糖半乳聚糖（AG型）果膠（主要含有Gal和Ara）組成。SSPS-A2主要由GalA、Rha、Gal和Ara組成，推測(cè)其可能由HG型果膠和RG-I型果膠（主要含有GalA、Rha、Gal和Ara，其中GalA∶Rha=1∶1）組成。研究表明，大豆中的可溶酸性多糖主要由HG和少量RG-I組成[22]。由于豆渣可溶酸性多糖的GalA含量明顯低于大豆可溶酸性糖[23]，說(shuō)明酸性多糖可能在大豆產(chǎn)品制備過(guò)程中損失，造成酸性多糖產(chǎn)率低。綜合上述結(jié)果可知SSPS-A1和SSPS-A2的結(jié)構(gòu)可能存在一定差異。

表1 豆渣可溶酸性多糖的化學(xué)組成和單糖組成分析Table 1 Chemical composition and monosaccharide composition of soluble acid polysaccharides from soybean dregs%

2.3 豆渣可溶酸性多糖SSPS-A1的凝膠過(guò)濾色譜

圖 2SSPS-A1在Sepharose CL-6B的洗脫結(jié)果Fig.2 Elution curve of SSPS-A1 on Sepharose CL-6B column

利用Sepharose CL-6B對(duì)SSPS-A1進(jìn)行分離純化，結(jié)果如圖2所示。SSPS-A1在Sepharose CL-6B上主要出現(xiàn)4 個(gè)洗脫峰，收集合適的洗脫峰。得到4 個(gè)組分SSPSA1-a（得率為8.0%）、SSPS-A1-b（得率為9.0%）、SSPS-A1-c（得率為20.8%）、SSPS-A1-d（得率為8.8%），其中SSPS-A1-c的得率最高。

2.4 豆渣可溶酸性多糖SSPS-A1不同組分的單糖組成分析

進(jìn)一步通過(guò)高效液相色譜測(cè)定4 個(gè)分子質(zhì)量組分的單糖組成，結(jié)果如表2所示。SSPS-A1-a的主要單糖組分間物質(zhì)的量比為GalA∶Gal∶Ara=10.8∶38.0∶12.1。SSPS-A1-b的主要單糖組分間物質(zhì)的量比為GalA∶Gal∶Ara=18.4∶27.7∶21.7。SSPS-A1-c的主要單糖組分間物質(zhì)的量比為GalA∶Gal∶Ara=17.3∶44.9∶19.1。SSPS-A1-d的主要單糖組分間物質(zhì)的量比為GalA∶Gal∶Ara=23.9∶26.2∶7.4。從單糖組成結(jié)果可知，SSPS-A1四個(gè)多糖組分的單糖組成存在一定差異，SSPSA1-a中的Glc略高于其他3 個(gè)組分，SSPS-A1-b和SSPSA1-c的組成較為相似，SSPS-A1-d中Ara的含量低于其他3 個(gè)組分。

表2 SSPS-A1四個(gè)組分的單糖組成Table 2 Monosaccharide compositions of four fractions of SSPS-A1

2.5 豆渣可溶酸性多糖SSPS-A1不同組分的分子質(zhì)量測(cè)定

圖 3SSPS-A1四個(gè)組分的高效凝膠滲透色譜洗脫圖Fig.3 HPGPC profiles of four fractions of SSPS-A1

分子質(zhì)量是多糖結(jié)構(gòu)解析中重要的參數(shù)[24]，影響多糖的理化和生物活性等性質(zhì)[25]。通過(guò)對(duì)SSPS-A1經(jīng)凝膠柱色譜分離純化后的多糖利用高效凝膠滲透色譜進(jìn)行分子質(zhì)量的測(cè)定，使用不同分子質(zhì)量的葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，得到線性回歸方程為lgmw=0.191 5x+0.952 3，R2=0.998 1，將各個(gè)組分的保留時(shí)間代入線性回歸方程，可以計(jì)算出樣品多糖的分子質(zhì)量，結(jié)果如圖3所示。SSPS-A1-a的分子質(zhì)量為161.1 kDa、SSPS-A1-b的分子質(zhì)量為71.7 kDa、SSPS-A1-c的分子質(zhì)量為31.6 kDa、SSPS-A1-d的分子質(zhì)量為13.9 kDa。SSPS-A1-c的峰相對(duì)狹窄，且相對(duì)對(duì)稱，說(shuō)明SSPS-A1-c的分子質(zhì)量分布相對(duì)均一，為SSPS-A1的均一組分。因此，后續(xù)將對(duì)電荷和分子質(zhì)量均一的SSPS-A1-c進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

2.6 豆渣可溶酸性多糖均一組分的紅外光譜分析

圖 4SSPS-A1-c的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of SSPS-A1-c

如圖4所示，參照文獻(xiàn)[26-29]對(duì)比可知，在3 422 cm-1附近的吸收峰為多糖O—H伸縮振動(dòng)特征峰；在2 918 cm-1附近的吸收峰為多糖類物質(zhì)C—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，這是糖類物質(zhì)的2 個(gè)特征吸收峰；在1 724 cm-1附近存在明顯的O—CH3的特征吸收峰，說(shuō)明SSPS-A1-c存在一定程度的甲酯化或乙?；揎?。在1 654 cm-1附近的吸收峰顯示為糖醛酸的自由羧基中羥基的彎曲振動(dòng)峰；說(shuō)明該物質(zhì)可能含有糖醛酸；在1 411 cm-1附近顯示為C—H變形振動(dòng)吸收峰；在1 072 cm-1附近的特征吸收峰表明SSPS-A1-c組分中存在吡喃糖環(huán)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果與單糖組成分析吻合，進(jìn)一步說(shuō)明了SSPS-A1-c是含有較多GalpA的酸性多糖。綜合紅外光譜結(jié)果可知，SSPS-A1-c具有O—H、C—H和C＝O等酸性多糖的特征吸收峰，同時(shí)SSPS-A1-c還存在一定程度甲酯化或乙?；揎?。

2.7 豆渣可溶酸性多糖中均一組分的NMR

圖 5SSPS-A1-c的13C NMR圖譜Fig.5 13C NMR spectrum of SSPS-A1-c

如圖5所示，t-α-Araf、α-1,5-Araf和t-β-Araf異頭碳信號(hào)峰分別出現(xiàn)在δ109.22、δ107.01和δ103.94，為C-1位吸收峰；δ62.94為β-1,3-Galp或t-β-Galp中的C-6位吸收峰[28-29]，說(shuō)明SSPS-A1-c由主要含有β-Galp和α-Araf的AG型果膠組成[30-32]；此外，從圖5可以看到，α-1,4-GalpA的C-4位和C-2位吸收峰（δ79.14、δ68.79），在δ20.05附近還可以觀察到乙?；奈辗?，說(shuō)明SSPS-A1-c中含有部分乙酰化的HG型果膠。綜合上述核磁結(jié)果可推測(cè)SSPS-A1-c主要由AG型果膠和HG型果膠結(jié)構(gòu)域組成。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用DEAE-Cellulose離子交換柱色譜和Sepharose CL-6B凝膠柱色譜對(duì)豆渣可溶性多糖進(jìn)行分離純化，獲得了一種電荷和分子質(zhì)量均一的組分SSPSA1-c。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明：SSPS-A1-c分子質(zhì)量為31.6 kDa，主要由半乳糖醛酸（GalA）、半乳糖（Gal）和阿拉伯糖（Ara）組成，其物質(zhì)的量比為GalA∶Gal∶Ara=17.3∶44.9∶19.1，同時(shí)含有少量的鼠李糖（Rha）、葡萄糖（Glc）和木糖（Xyl）。紅外光譜分析表明SSPS-A1-c具有O—H、C—H和C＝O等酸性多糖的特征吸收峰，同時(shí)SSPS-A1-c還存在一定程度的甲酯化或乙?；揎?；核磁共振圖譜表明，SSPS-A1-c主要由AG型果膠和部分乙?；腍G型果膠組成，其結(jié)果與單糖組成和紅外色譜分析結(jié)果一致。研究結(jié)果將為豆渣可溶酸性多糖的應(yīng)用提供理論依據(jù)，對(duì)豆渣的綜合開發(fā)利用具有重要意義。