5,6,7,8-四氫苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮類查爾酮的設(shè)計、合成及體外抗腫瘤活性

王 璇, 李 慧, 韓 瀟*, 毛 婷, 陳慧瓊

(1. 武漢城市學院 醫(yī)學部，湖北 武漢 430083； 2. 長江職業(yè)學院 醫(yī)藥護理學院，湖北 武漢 430074； 3. 武漢愛民制藥股份有限公司，湖北 鄂州 436070)

氮雜環(huán)化合物因具有良好的生物活性現(xiàn)已在農(nóng)藥和醫(yī)藥等領(lǐng)域?qū)θ祟惖慕】蛋l(fā)揮著重要的作用[1]。四氫苯并噻吩并嘧啶類衍生物作為一類重要的氮雜環(huán)化合物，近年來被發(fā)現(xiàn)具有抗炎[2]、抗菌[3]、抗結(jié)核[4]、抗病毒[5]等廣泛生物活性。尤其是，近年來四氫苯并噻吩并嘧啶骨架常用于抗腫瘤藥物的設(shè)計，目前已經(jīng)有數(shù)十個不同的衍生物被報道出來，具有良好的抗腫瘤活性[6-8](Chart 1)。通過Wittig 反應(yīng)合成的一系列四氫苯并噻吩并嘧啶衍生物對乳腺癌細胞展現(xiàn)出了有效的抑制活性[9]。近期還有其他幾個課題組也報道了四氫苯并噻吩并嘧啶類化合物具有良好的抗乳腺癌活性[10-11]。

Chart 1

Scheme 1

查爾酮是一類具有1,3-二苯基丙烯骨架的重要天然產(chǎn)物，廣泛的分布在自然界多種植物中[12]。由于其結(jié)構(gòu)中具有α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)，該官能團具有較好的柔性，能與細胞中的多種酶相互作用，近年來被發(fā)現(xiàn)具有抗菌[13]、抗炎[14]、抗瘧疾[15]、抗腫瘤[16]等廣泛生物活性，尤其是最近來其抗腫瘤活性被廣泛的研究[17-19]。此外，查爾酮是植物體內(nèi)黃酮的合成前體，毒性較低，同時其α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)可修飾性強。因此，查爾酮也常常被作為抗腫瘤的藥效團引入到其他活性結(jié)構(gòu)中來提高母體藥物的抗腫瘤活性[20]。

乳腺癌是女性最?；嫉膼盒阅[瘤，發(fā)病率和致死率在女性患的所有癌癥中排第一位，而近年來發(fā)病率呈逐年增加并更趨年青化[21]。鑒于四氫苯并噻吩并嘧啶和查爾酮均為具有潛在抗腫瘤活性的藥效團，在本研究根據(jù)活性亞結(jié)構(gòu)拼接原理，合成了18個四氫苯并噻吩并嘧啶并查爾酮類雜合物(Scheme 1)，并測試了其體外抗乳腺的癌活性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

XT4型顯微熔點測定儀(溫度未校正)；Bruker AM-400 MHz型核磁共振儀(CDCl3或DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標)；Agilent- 6120型液質(zhì)聯(lián)用儀；ELx800型酶標儀。

環(huán)己酮、氰乙酸乙酯、嗎啉、硫粉、甲酰胺、4-甲?；脚鹚?、醋酸銅、1,2-二氯乙烷、芳香酮，均購自北京伊諾凱科技有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 2-氨基-4,5,6,7-四氫苯并[4,5]噻吩-3-甲酸乙酯(2)的合成

將環(huán)己酮2.462 g(25 mmol)、氰乙酸乙酯2.828 g(25 mmol)和硫粉0.8 g(25 mmol)溶解于60 mL乙醇中，滴加4 mL嗎啉，60 ℃反應(yīng)16 h。減壓除去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=石油醚/乙酸乙酯=4/1,V/V)純化得淡黃色固體(2) 4.889 g，產(chǎn)率86.8%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 6.01(s, 2H), 4.22(q,J=7.2 Hz, 2H), 2.68～2.65(m, 2H), 2.47～2.44(m, 2H), 1.76～1.65(m, 4H), 1.32(t,J=7.5 Hz, 3H)。

(2) 5,6,7,8-四氫苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮(3)的合成

將24.715 g(21 mmol)溶解于30 mL甲酰胺中，加熱回流2 h，待反應(yīng)液冷卻至室溫后加入100 mL水，析出沉淀，過濾，濾餅用水洗(3× 30 mL)，真空干燥過夜得淡黃色固體(3) 3.141 g，產(chǎn)率72.5%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.95(s, 1H), 3.01～2.99(m, 2H), 2.79～2.74(m, 2H), 2.03～1.82(m, 4H)。

(3) 3-(4-甲?；交?-5,6,7,8-四氫苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮(4)的合成

將33.102 g(15 mmol)、4-甲?；脚鹚?.448 g(23 mmol)、醋酸銅2.725 g(15 mmol)和Et3N 4.2 mL(30 mmol)溶解于50 mL 1,2-二氯乙烷中，室溫反應(yīng)2 h，過濾，濃縮濾液，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=3/2,V/V)純化得白色固體(4) 3.804 g，產(chǎn)率81.7%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 10.12(s, 1H), 7.94(s, 1H), 3.02(t,J=6.4 Hz, 2H), 2.82～2.75(m, 2H), 2.00～1.81(m, 4H)。

(4) 5,6,7,8-四氫苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮類查爾酮(5a～5r)的合成

將4310 mg(1 mmol)和芳香酮(1 mmol)溶解于10 mL乙醇中，加入1 mL 10% NaOH溶液，室溫反應(yīng)8 h，加入60 mL水，析出沉淀，4 ℃下靜置過夜，過濾，濾餅用水洗(3× 20 mL)，真空干燥即得目標產(chǎn)物；若加水不能析出沉淀，則先用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH=5，用乙酸乙酯(3× 25 mL)萃取，飽和的NaHCO3溶液洗滌，無水Na2SO4干燥，減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=4/1～2/3,V/V)純化得目標化合物。

5a： 黃色固體，收率75.4%， m.p.196～198 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 8.02(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.97(s, 1H), 7.82(d,J=16.0 Hz, 1H), 7.56(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.52(d,J=16.0 Hz, 1H), 7.49～7.43(m, 3H), 7.39(d,J=8.0 Hz, 2H), 3.01(t,J=5.6 Hz, 2H), 2.81～2.76(m, 2H), 1.96～1.85(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 190.4, 162.0, 157.7, 143.8, 143.2, 136.5, 134.2, 132.7, 132.3, 130.1, 129.6, 129.3, 128.4, 125.3, 122.6, 121.9, 121.5, 25.7, 25.4, 22.8, 22.3; EI-MSm/z: 412 {[M]+}。

5b： 黃色固體，收率65.4%， m.p.196～198 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.95(s, 1H), 7.78(d,J=16.0 Hz, 1H), 7.57(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.41(d,J=16.0 Hz, 1H), 7.38(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.07(t,J=7.2 Hz, 1H), 7.04～7.00(m, 2H), 6.93～6.87(m, 1H), 3.06～3.02(m, 2H), 2.80(t,J=5.6 Hz, 2H), 2.21(s, 3H), 1.93～1.82(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 189.8, 162.1, 157.6, 143.2, 144.2, 140.1, 136.1, 134.5, 132.8, 131.0, 129.8, 129.5, 129.4, 128.6, 124.7, 122.6, 120.3, 25.7, 25.2, 22.9, 22.1, 18.9; EI-MSm/z: 426 {[M]+}。

5c： 黃色固體，收率70.6%， m.p.204～206 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.97(s, 1H), 7.79(d,J=16.4 Hz, 1H), 7.61(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.59(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.57(d,J=16.0 Hz, 1H), 7.48(s, 1H), 7.43(d,J=8.0 Hz, 2H), 6.98(d,J=8.0 Hz, 1H), 6.85～6.82(m, 1H), 3.02(t,J=5.6 Hz, 2H), 2.81(t,J=5.6 Hz, 2H), 2.31(s, 3H), 1.94～1.84(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 189.6, 162.6, 157.9, 144.5, 143.7, 138.9, 138.2, 136.6, 132.7, 132.3, 130.8, 130.5, 129.6, 129.5, 129.1, 125.1, 124.9, 121.9, 121.4, 25.6, 25.3, 22.8, 22.2, 21.7; EI-MSm/z: 426 {[M]+}。

5d： 黃色固體，收率71.1%， m.p.184～186 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.96(s, 1H), 7.87(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.73(d,J=16.0 Hz, 1H), 7.55(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.51(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.41(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.35(d,J=8.0 Hz, 2H), 3.05～3.01(m, 2H), 2.82～2.78(m, 2H), 2.34(s, 3H), 1.93～1.86(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 189.8, 162.1, 157.6, 144.2, 143.2, 141.1, 136.1, 134.5, 132.8, 131.0, 129.8, 129.5, 129.4, 128.6, 124.7, 122.6, 120.6, 25.7, 25.2, 22.9, 22.1, 21.5; EI-MSm/z: 426 {[M]+}。

5e： 黃色固體，收率68.3%， m.p.191～193 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.97(s, 1H), 7.72(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.68(t,J=6.8 Hz, 1H), 7.61(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.45(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.40(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.36～7.31(m, 2H), 7.05～7.01(m, 1H), 3.75(s, 3H), 3.05～3.01(m, 2H), 2.83～2.77(m, 2H), 1.89～1.84(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 190.6, 162.2, 157.4, 156.4, 145.2, 144.2, 135.9, 133.6, 131.7, 131.2, 130.7, 130.4, 129.8, 129.6, 126.8, 123.5, 121.9, 121.7, 118.9, 25.5, 25.1, 23.1, 22.4, 55.7; EI-MSm/z: 443 {[M + H]+}。

5f： 黃色固體，收率62.4%， m.p.172～174 ℃;1HNMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.92(s, 1H), 7.77(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.73(t,J=6.8 Hz, 1H), 7.56(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.50(d,J=15.2 Hz, 1H), 7.48(s, 1H), 7.39(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.37～7.34(m, 2H), 3.81(s, 3H), 3.03(t,J=6.0 Hz, 2H), 2.81～2.85(m, 2H), 1.98～1.86(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 189.4, 162.5, 158.8, 156.5, 144.1, 143.9, 136.1, 132.6, 132.3, 131.6, 129.8, 129.3, 124.7, 122.6, 122.2, 121.8, 121.6, 121.2, 120.3, 25.6, 25.3, 22.8, 22.4, 55.4; EI-MSm/z: 443 {[M + H]+}。

5g： 黃色固體，收率66.6%， m.p.189～191 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.94(s, 1H), 7.82(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.80(d,J=16.0 Hz, 1H), 7.60(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.49(d,J=15.2 Hz, 1H), 7.39(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.15(d,J=8.0 Hz, 2H), 3.79(s, 3H), 3.02(t,J=5.6 Hz, 2H), 2.82～2.78(m, 2H), 1.90～1.82(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 188.9, 162.4, 161.5, 158.1, 144.6, 144.1, 135.7, 134.3, 130.7, 129.9, 129.5, 128.2, 127.4, 122.1, 121.7, 119.7, 114.4, 25.7, 25.3, 23.1, 22.5, 55.8; EI-MSm/z: 443 {[M + H]+}。

5h： 黃色固體，收率46.4%， m.p.199～201 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.92(s, 1H), 7.68(d,J=16.0 Hz, 1H), 7.58(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.45(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.29(d,J=15.2 Hz, 1H), 7.23(d,J=8.0 Hz, 2H), 6.91(d,J=8.0 Hz, 2H), 3.01(t,J=5.2 Hz, 2H), 2.81～2.75(m, 2H), 1.92～1.83(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 189.7, 163.7, 162.1, 157.6, 144.1, 143.5, 135.8, 132.5, 131.2, 130.8, 130.2, 129.5, 129.1, 124.8, 121.6, 121.2, 116.9, 25.6 25.3, 22.8, 22.1; EI-MSm/z: 429 {[M + H]+}。

5i： 黃色固體，收率68.1%， m.p.196～199 ℃;1HNMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.91(s, 1H), 7.74(d,J=16.4 Hz, 1H), 7.60(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.56(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.42(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.39(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.21(d,J=15.6 Hz, 1H), 3.00～2.97(m, 2H), 2.79～2.74(m, 2H), 1.89～1.81(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 190.4, 165.4(d,JCF=252.2 Hz), 162.4, 157.9, 144.5, 144.1, 136.2, 133.6(d,JCF=3.3 Hz), 132.2, 130.7(d,JCF=8.7 Hz), 130.5, 130.2, 129.9, 129.6, 122.2, 121.3, 116.1(d,JCF=22.4 Hz), 25.8, 25.2, 22.7, 22.2; EI-MSm/z: 430 {[M]+}。

5j： 黃色固體，收率64.8%， m.p.188～190 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.93(s, 1H), 7.91～7.85(1H, m), 7.81(d,J=16.0 Hz, 1H), 7.59(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.52～7.44(1H, m), 7.39(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.24～7.21(1H, m), 7.138～7.08(1H, m), 3.02(t,J=5.6 Hz, 2H), 2.82～2.76(m, 2H), 1.90～1.83(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 189.6(d,JCF=8.5 Hz), 162.4(d,JCF=252.4 Hz), 162.1, 158.2, 143.6, 143.2, 135.7(d,JCF=8.5 Hz), 135.2, 132.5, 131.4(d,JCF=8.7 Hz), 130.6, 130.4, 129.7, 129.2, 124.6(d,JCF=3.3 Hz), 123.5(d,JCF=22.0 Hz), 122.3, 121.9, 116.7(d,JCF=22.0 Hz), 25.7, 25.3, 22.8, 22.4; EI-MS,m/z: 430 {[M]+}。

5k： 黃色固體，收率67.1%， m.p.211～213 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.96(s, 1H), 7.77(d,J=15.2 Hz, 1H), 7.62(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.51(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.44(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.32(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.16(d,J=15.6 Hz, 1H), 3.01(t,J=5.2 Hz, 2H), 2.82～2.76(m, 2H), 1.93～1.84(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 191.2, 162.2, 158.2, 144.7, 144.3, 138.8, 136.7, 134.8, 132.6, 131.2, 129.8, 129.5, 129.1, 128.9, 128.3, 122.4, 121.4, 25.7, 25.3, 22.8, 22.2; EI-MSm/z: 447 {[M]+}。

5l： 黃色固體，收率61.8%， m.p.117～119 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.96(s, 1H), 7.78(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.55(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.51～7.43(m, 1H), 7.41(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.39(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.35(t,J=8.0 Hz, 1H), 7.19～7.11(m, 2H), 3.01(t,J=5.6 Hz, 2H), 2.81(t,J=5.2 Hz, 2H), 1.92～1.85(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 189.6, 162.7, 158.5, 144.6, 144.2, 135.9, 134.7, 133.6, 132.4, 131.6, 130.8, 130.5, 130.0, 129.6, 129.3, 128.2, 127.4, 121.9, 121.6, 25.8, 25.3, 22.7, 22.2; EI-MSm/z: 447 {[M]+}。

5m： 黃色固體，收率72.3%， m.p.208～210 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.91(s, 1H), 7.82(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.76(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.58(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.55(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.51(d,J=16.0 Hz, 1H), 7.39(d,J= 8.0 Hz, 2H), 3.04～2.95(m, 2H), 2.80～2.75(m, 2H), 1.91～1.82(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 189.6, 162.5, 157.4, 143.9, 143.6, 135.8, 134.7, 132.9, 132.2, 130.8, 130.2, 129.8, 129.4, 128.9, 122.2, 121.8, 120.6, 25.6, 25.2, 22.7, 22.2; EI-MSm/z: 491 {[M]+}。

5n： 黃色固體，收率75.3%， m.p.188～190 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.92(s, 1H), 7.75(d,J=16.0 Hz, 1H), 7.59(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.37(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.33(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.12(t,J=7.6 Hz, 2H), 6.71～6.53(m, 1H), 3.00～2.94(m, 2H), 2.80～2.73(m, 2H), 2.30(s, 6H), 1.91～1.84(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 189.5, 162.8, 157.8, 144.4, 144.1, 139.2, 137.3, 134.9, 132.3, 131.5, 131.2, 129.5, 129.1, 128.6, 128.2, 121.7, 120.4, 25.6, 25.2, 22.7, 22.1, 19.2; EI-MSm/z: 440 {[M]+}。

5o： 黃色固體，收率70.6%， m.p.214～216 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.97(s, 1H), 7.93(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.80(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.65(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.57(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.55～7.48(m, 3H), 7.49(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.40(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.37(d,J=15.6 Hz, 1H), 6.78～6.75(m, 1H), 3.02(t,J=5.6 Hz, 2H), 2.83～2.77(m, 2H), 1.90～1.82(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 190.3, 162.4, 157.5, 143.8, 143.1, 134.6, 134.2, 133.6, 133.3, 132.8, 132.6, 130.6, 130.2, 129.8, 129.3, 128.7, 128.4, 128.1, 127.8, 126.8, 123.7, 122.2, 121.9, 25.9, 25.5, 22.8, 22.3; EI-MSm/z: 463 {[M + H]+}。

5p： 黃色固體，收率71.4%， m.p.181～183 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.91(s, 1H), 7.59(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.57(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.50(d,J=1.2 Hz, 1H), 7.44(d,J=15.2 Hz, 1H), 7.40(d,J=8.0 Hz, 2H), 6.72(d,J=3.6 Hz, 1H), 6.58～6.51(m, 1H), 3.02～2.94(m, 2H), 2.81～2.74(m, 2H), 1.90～1.82(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 186.5, 162.7, 157.4, 153.2, 146.7, 144.1, 134.8, 133.2, 131.4, 130.5, 129.6, 128.9, 122.6, 121.3, 117.7, 112.3, 25.6, 24.9, 22.3, 21.9; EI-MSm/z: 403 {[M + H]+}。

5q： 黃色固體，收率79.5%， m.p.192～194 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.97(s, 1H), 7.89(d,J=3.2 Hz, 1H), 7.74(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.68(d,J=5.2 Hz, 1H), 7.57(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.41(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.39(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.16～7.12(m, 1H), 3.00(t,J=5.6 Hz, 2H), 2.80(t,J=5.2 Hz, 2H), 1.91～1.83(m, 4H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 187.4, 162.5, 157.8, 143.6, 143.2, 140.3, 135.2, 132.7, 132.5, 130.9, 130.4, 129.7, 128.8, 128.5, 127.6, 123.1, 121.8, 25.7, 25.4, 22.8, 22.3; EI-MSm/z: 419 {[M + H]+}。

5r： 黃色固體，收率76.6%， m.p.196～198 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 12.04(s, 1H), 7.96(s, 1H), 7.72(d,J=15.2 Hz, 1H), 7.60(d,J=15.2 Hz, 1H), 7.60(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.42～7.37(m, 3H), 7.19～7.14(m, 1H), 6.29～6.24(m, 1H), 3.01～2.95(m, 2H), 2.80～2.75(m, 2H), 1.90～1.82(m, 4H);13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz)δ: 179.7, 162.6, 158.2, 143.8, 143.4, 134.8, 132.7, 132.4, 130.6, 129.4, 128.7, 128.1, 127.5, 122.3, 121.7, 117.5, 111.8, 25.7, 24.6, 22.4, 22.1; EI-MSm/z: 402 {[M + H]+}。

1.3 抗腫瘤活性測試

取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板中，細胞密度約為0.8× 104個/每孔，在5% CO237 ℃的培養(yǎng)箱中孵育24 h，棄去培養(yǎng)基，加入200 μL不同濃度的待測化合物5a～5r，并以5-氟尿嘧啶(5-FU)和他莫昔芬(TAM)為陽性對照，而空白組加入等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育3 d，加入25 μL MTS溶液，繼續(xù)孵育4 h，在波長為490 nm處用酶標儀測定每孔吸光度(OD)值，計算測試化合物的IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

以商業(yè)廉價的環(huán)己酮、氰乙酸乙酯、硫粉和嗎啉為原料，首先通過Gewald反應(yīng)制得2收率86.8%，然后與甲酰胺發(fā)生關(guān)環(huán)反應(yīng)得到3收率72.5%，再與對甲醛苯硼酸發(fā)生Chan-Lam偶聯(lián)反應(yīng)生成4收率81.7%，最后與芳香酮發(fā)生Claisen-Schmidt縮合反應(yīng)制得目標化合物5a～5r，總收率23.9%～40.9%。

2.2 抗腫瘤活性

采用MTS法測試了目標化合物的體外抗腫瘤活性，以荷爾蒙依賴型乳腺癌MCF-7和三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞為測試細胞，正常的乳腺上皮細胞MCF-10A為對照細胞。表1的實驗結(jié)果表明，目標化合物5a～5r對MCF-7和MDA-MB-231這兩種乳腺癌細胞具有明顯的抑制活性，其IC50值均在30 μmol·L-1以內(nèi)。這些結(jié)果表明，四氫苯并噻吩并嘧啶酮類查爾酮具有抗乳腺癌活性。進一步分析這些化合物的構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn)，化合物5a～5r對MDA-MB-231細胞的抑制活性要強于MCF-7細胞，其中化合物查爾酮單元上的取代基對活性影響較大。當查爾酮單元苯環(huán)上沒有取代基(化合物5a)時，其對MCF-7和MDA-MB-231細胞展現(xiàn)出了中等的抑制活性，而用給電子基團甲基(化合物5b～5d)、甲氧基(化合物5e, 5d～5g)、羥基(化合物5h)或者空間位阻較大的2,6-二甲基苯基(化合物5n)和1-萘基 (化合物5o)取代后沒有明顯地提高抗腫瘤活性；但是，當用吸電子基團鹵素取代(化合物5i～5m)或者用呋喃、噻吩、吡咯五元雜環(huán)取代(化合物5p～5r)后抗腫瘤活性顯著地提高。尤其是5p～5r這3個雜環(huán)查爾酮化合物對MDA-MB-231的抑制活性較化合物5a提高了至少兩倍，并強于陽性藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)和他莫昔芬(TAM)。

隨后，為了評價這些目標化合物的毒性，測試了其對正常MCF-10A的抑制活性。表1的結(jié)果顯示，目標化合物5a～5r抑制MCF-10A的IC50值均大于100 μmol·L-1，表明這些化合物基本沒有毒性，而陽性藥物5-FU和TAM卻展現(xiàn)出了一定的毒性；同時，化合物5a～5r的體外治療指數(shù)(ITVI > 3)也大于5-FU和TAM，而IVTI值越高，安全性也就越高[22]，這表明目標化合物5a～5r的生物安全性高于5-FU和TAM。

表1 化合物5a～5r的抗增殖活性(n=3)

根據(jù)活性亞結(jié)構(gòu)拼接原理構(gòu)建了四氫苯并噻吩并嘧啶并查爾酮類雜合物。以環(huán)己酮、硫和氰乙酸乙酯為起始原料，經(jīng)過Gewald反應(yīng)、Chan-Lam偶聯(lián)反應(yīng)和Claisen-Schmidt縮合反應(yīng)合成了18個新型5,6,7,8-四氫苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮并查爾酮化合物。初步的體外抗腫瘤活性表明，這些化合物對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞展現(xiàn)出了良好的抑制活性，尤其是化合物查爾酮單元的苯環(huán)以對位吸電子基或雜環(huán)取代有更好的抗三陰性乳腺癌活性，其中2-噻吩基取代化合物5q(IC50=5.1 μmol·L-1)對MDA-MB-231細胞展現(xiàn)出了最強的抑制活性，分別是陽性藥物5-FU(IC50=9.6 μmol·L-1)和他莫昔芬(IC50=17.8 μmol·L-1)的1.8和3.4倍。此外，目標化合物對正常的MCF-10A無明顯細胞毒性，并低于參考藥物5-FU和他莫昔芬。這些研究結(jié)果表明，將四氫苯并噻吩并嘧啶酮和查爾酮活性單元拼接能夠得到新的抗乳腺癌雜合物，這為今后探索新型抗腫瘤化合物積累了寶貴的經(jīng)驗。