miR-623靶向DNM2調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡研究

許峰 劉聞 陳宇 方漢林 左劍輝

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普胸外科,合肥230022

作為世界上最常見的惡性腫瘤之一,肺癌已成為世界范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)的第一大死亡原因[1]。小細(xì)胞肺癌占20%,非小細(xì)胞肺癌占80%[2]。大約85%～90%的肺癌死亡是由非小細(xì)胞肺癌引起的,其分子機(jī)制是復(fù)雜和異質(zhì)性的[3]。近年來,非小細(xì)胞肺癌的治療進(jìn)展迅速,使人們對其病理機(jī)制、腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制、治療和預(yù)后有了進(jìn)一步的認(rèn)識,診斷和治療的改進(jìn)也大大延長了肺癌患者的生存期。然而非小細(xì)胞肺癌的新分子治療選擇靶點(diǎn)的識別仍然十分有限,需要對肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中涉及的異?；虮磉_(dá)進(jìn)行精確的分子表征,這可能在未來提高臨床療效。了解非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制可能會對臨床實(shí)踐產(chǎn)生重大影響。

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類豐富的非編碼18～25核苷酸小RNA,與特異性靶m RNA的3'-UTR結(jié)合,通過誘導(dǎo)翻譯抑制或m RNA降解來抑制基因表達(dá)。miRNAs參與多種生物學(xué)過程,如細(xì)胞周期進(jìn)展、增殖、生長和凋亡。特殊miRNAs的異常表達(dá)是包括非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的許多人類腫瘤類型的標(biāo)志,它們既可以作為癌基因,也可以作為腫瘤抑制因子。例如,miRNA-143在肺癌細(xì)胞中表達(dá)被強(qiáng)烈下調(diào),導(dǎo)致c-MYC、NUDT1、OCT4和EGFR表達(dá)升高,腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和遷移增加[4]。相比之下,miRNA-21在包括非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的不同癌癥中過表達(dá),導(dǎo)致PTEN抑制,細(xì)胞生長和侵襲增加[5-6]。因此,miRNAs可以作為肺癌診斷、預(yù)后和治療的潛在有用的生物標(biāo)志物。Nigita等[7]發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中多種miRNA失調(diào),包括miR-623,但miR-623對非小細(xì)胞肺癌的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。細(xì)胞凋亡在大多數(shù)多細(xì)胞生物的發(fā)育過程和組織穩(wěn)態(tài)中起重要作用;在許多疾病狀態(tài)的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展過程中,細(xì)胞凋亡的異常已經(jīng)被證實(shí)。在非小細(xì)胞肺癌中,細(xì)胞凋亡的平衡被打破。然而,miR-623是否與凋亡相關(guān)仍未探明?；诖?本研究使用A549作為研究對象,旨在探討miR-623調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549凋亡的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549購自深圳益百順科技有限公司(貨號:A549)。用合成的寡核苷酸和pCMV載體構(gòu)建pGCV-DNM2表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-DNM2)。Lipo2000購自北京斯科科技有限公司(貨號:11668027-0.75)。miR-623過表達(dá)、miR-623抑制、siDNM2和siGFAP均由北京擎科生物科技有限公司合成。RPMI-1640培養(yǎng)基購自北京普益華科技有限公司(貨號:R8005-10X1L)。pmir-glo utr1質(zhì)粒購自廣州基旦生物科技有限公司(貨號:JG190917001M)。GAPDH抗體購自廣州左克生物科技發(fā)展有限公司(貨號:WB2197)。DNM2抗體購自廣州文?？茖W(xué)儀器有限公司(貨號:DF12953)。胎牛血清購自廣州左克生物科技發(fā)展有限公司(貨號:HQ30071)。TRIzol試劑購自廣州齊云生物技術(shù)有限公司(貨號:B610409-25 ml)。HiScriptqRTSuper Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司(貨號:R122-01)。Cham Q SYBR qPCR Master Mix購自廣州捷威斯生物科技有限公司(貨號:Q331-02)。RIPA總蛋白裂解液購自廣州捷威斯生物科技有限公司(貨號:RBG2007-1)。Annexin V-PE凋亡檢測試劑盒購自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司(貨號:C1065)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640中,并且補(bǔ)充10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素。非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞在濕潤的含5%二氧化碳的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將pGCV-DNM2、陰性對照載體、miR-623過表達(dá)、miR-623抑制、siDNM2和siGFP分別與Lipofectamine 2000混合后,在室溫下放置15 min后,緩慢滴入A549細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基。

1.2.2 免疫印跡 使用RIPA緩沖液從非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中提取總細(xì)胞蛋白,然后在4℃的條件下12 000 r/min離心20 min,離心半徑15 cm。隨后收集上清液。使用二辛可寧酸蛋白質(zhì)測定試劑盒測量這些蛋白質(zhì)樣品的濃度。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠中分離蛋白質(zhì)樣品(每個泳道30μg),然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉后,將膜與DNM2(稀釋比為1∶2 000)或GAPDH(稀釋比為1∶5 000)第一抗體在4℃下孵育過夜。第2天,將膜與耦聯(lián)了辣根過氧化物酶的相應(yīng)抗小鼠或抗兔IgG二抗在室溫下孵育1 h。蛋白質(zhì)條帶使用Western Bright ECL試劑盒(相同體積的A液和B液混合后緩緩滴在硝酸纖維素膜上),然后使用ChemiDocTMXRS+系統(tǒng)進(jìn)行可視化。

1.2.3 RNA抽取與實(shí)時熒光定量PCR 用TRIzol試劑提取來自于非小細(xì)胞肺癌A549的總RNA。使用HiScriptqRTSuper Mix從2μg總RNA中進(jìn)行互補(bǔ)脫氧核糖核酸的反向轉(zhuǎn)錄。qRTPCR采用Cham Q SYBR qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行。GAPDH作為內(nèi)部對照。反應(yīng)在96孔平板上進(jìn)行:95℃孵育10 min,40個循環(huán)(95℃孵育15 s,60℃孵育1 min),所有反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)后,使用固定閾值設(shè)置確定循環(huán)閾值(cycle threshold,CT)數(shù)據(jù),并從重復(fù)3次PCR中確定平均CT。采用對比CT法將每種情況與對照組進(jìn)行比較。miRNAs的相對水平使用U6小核RNA歸一化。使用2-ΔCT公式計(jì)算miRNA的相對表達(dá)水平,ΔCT=(CT miRNA-CT GAPDH)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡水平的檢測 根據(jù)制造商的說明,使用Annexin V-PE凋亡檢測試劑盒對不同處理的

細(xì)胞進(jìn)行凋亡分析。簡而言之,經(jīng)過不同處理后,收集在6孔板上生長的漂浮非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和胰蛋白酶分離的細(xì)胞,并用冷的1×PBS洗滌。然后將細(xì)胞沉淀物用結(jié)合緩沖液重懸,并根據(jù)試劑盒方案用Annexin-V染色。熒光顯微鏡觀察。將實(shí)驗(yàn)組中凋亡細(xì)胞的百分比與對照轉(zhuǎn)染組進(jìn)行比較。所有樣品一式三份測量。

1.2.5 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 使用miRDB在線預(yù)測miR-623潛在的靶基因,初步鑒定出目標(biāo)基因?yàn)镈NM2。從人非小細(xì)胞肺癌A549的cDNA文庫中擴(kuò)增出DNM2 3'-UTR的野生型序列。miR-623結(jié)合位點(diǎn)的突變是通過快速突變試劑盒定點(diǎn)突變引入的,將堿基c突變?yōu)間。PCR產(chǎn)物被克隆到pmir-glo utr1質(zhì)粒上。通過雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒進(jìn)行熒光素酶活性的檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-623對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡水平的影響 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡水平為(21.2±6.5)%,使用miR-623過表達(dá)組過表達(dá)miR-623后,發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡水平為(8.3±1.8)%,下降至原來的39.2%(t=3.313,P＜0.05);抑制miR-623后,發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡水平為(70.6±8.9)%,上升至原來的3.3倍(t=7.764,P＜0.05)。

2.2 miR-623與DNM2的相關(guān)性 通過miRDB在線分析,發(fā)現(xiàn)miR-623潛在靶向TRIM44、FOXN2、PTPRD、KLF3、DNM2、EPHB6、APEM2、BIRC2、PHF6和FBN2。過表達(dá)miR-623后,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中DNM2的表達(dá)水平下降至原來的35.0%(t=5.418,P＜0.05),而TRIM44、FOXN2、PTPRD、KLF3、EPHB6、APEM2、BIRC2、PHF6和FBN2的表達(dá)水平均無顯著變化(P值均＞0.05),見表1。抑制miR-623后,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中DNM2的表達(dá)水平上升至原來的1.47倍(t=2.898,P＜0.05),而TRIM44、FOXN2、PTPRD、KLF3、EPHB6、APEM2、BIRC2、PHF6和FBN2的表達(dá)水平均無顯著變化(P值均＞0.05),見表2。通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-623靶向DNM2的3'端非編碼區(qū),見圖1。

表1 過表達(dá)miR-623后2組相關(guān)基因的相對表達(dá)水平(±s)

基因 對照組相對表達(dá)水平miR-623過表達(dá)組相對表達(dá)水平 t值 P值TRIM44 1.05±0.30 1.01±0.22 0.232 8 0.827 4 FOXN2 0.65±0.12 0.55±0.02 1.424 0 0.227 6 PTPRD 1.49±0.40 1.44±0.32 0.169 1 0.874 0 KLF3 0.95±0.29 0.99±0.30 0.166 0 0.876 2 DNM2 1.42±0.31 0.42±0.10 5.317 1 0.006 0 EPHB6 1.48±0.39 1.44±0.39 0.125 6 0.906 1 AP3M2 0.41±0.10 0.45±0.09 0.515 0 0.633 7 BIRC2 2.09±0.53 2.08±0.52 0.023 3 0.982 5 PHF6 0.49±0.11 0.51±0.10 0.233 0 0.827 2 FBN2 0.29±0.08 0.33±0.05 0.734 4 0.503 4

表2 抑制miR-623后2組相關(guān)基因的相對表達(dá)水平(±s)

表2 抑制miR-623后2組相關(guān)基因的相對表達(dá)水平(±s)

基因 對照組相對表達(dá)水平miR-623抑制組相對表達(dá)水平 t值 P值TRIM44 1.05±0.30 1.09±0.34 0.152 8 0.886 0 FOXN2 0.65±0.12 0.61±0.28 0.227 4 0.831 2 PTPRD 1.49±0.40 1.52±0.48 0.083 1 0.937 7 KLF3 0.95±0.29 0.97±0.23 0.093 6 0.929 9 DNM2 1.42±0.31 2.04±0.02 3.457 0 0.025 9 EPHB6 1.48±0.39 1.49±0.38 0.031 8 0.976 1 AP3M2 0.41±0.10 0.43±0.10 0.244 9 0.818 5 BIRC2 2.09±0.53 2.02±0.53 0.161 8 0.879 3 PHF6 0.49±0.11 0.48±0.11 0.111 3 0.916 7 FBN2 0.29±0.08 0.27±0.13 0.226 9 0.831 6

圖1 miR-623對野生型或突變型DNM2 3'端非編碼區(qū)活性的影響

2.3 DNM2對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡水平的影響 通過siDNM2敲低DNM2后,發(fā)現(xiàn)與對照組比較,非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡下降至原來的26.7%(t=7.381,P＜0.05)(圖2)。

圖2 敲低DNM2對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549凋亡水平的影響 A:敲低DNM2的表達(dá)情況;B:敲低DNM2后非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡情況

通過DNM2質(zhì)粒過表達(dá)DNM2后,發(fā)現(xiàn)與對照組比較,非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡上升至原來的3.66倍(t=4.113,P＜0.05)(圖3)。

圖3 過表達(dá)DNM2對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549凋亡水平的影響 A:DNM2質(zhì)粒過表達(dá)后DNM2的表達(dá)情況;B:DNM2質(zhì)粒過表達(dá)后非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡情況

同時敲低miR-623和DNM2,與對照組(同時轉(zhuǎn)染空載體和陰性對照載體)相比,非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡水平無明顯變化(t=0.626,P＞0.05),見圖4;同時過表達(dá)miR-623和DNM2,與對照組(同時轉(zhuǎn)染siGFP和陰性對照載體)相比,非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡水平無明顯變化(t=0.751,P＞0.05),見圖5。

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥死亡原因之一,嚴(yán)重危害著人類的健康和生命[8-9]。盡管相關(guān)治療取得了快速進(jìn)展,非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后仍然不容樂觀[10],肺癌患者的5年生存率較低,與其他癌癥相比,肺癌治療效果有限。這種有限療效的一個主要原因是肺癌對放療和/或化療的固有或獲得性耐藥。因此,探索新的有效的診斷和治療靶點(diǎn)是很重要的。為了開發(fā)更有效的診斷和治療技術(shù),迫切需要更好地了解導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌癌變的分子生物學(xué)改變的遺傳改變。有必要從分子水平研究肺癌細(xì)胞的抗凋亡作用,闡明肺癌的基本分子機(jī)制。因此,探索新的有效的診斷和治療靶點(diǎn)是很重要的。為了開發(fā)更有效的診斷和治療技術(shù),迫切需要更好地了解導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌癌變的分子生物學(xué)改變的遺傳改變。

圖4 抑制miR-623和DNM2對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549凋亡水平的影響

圖5 過表達(dá)miR-623和DNM2對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549凋亡水平的影響

miRNAs是一類小的非編碼RNA(21～25個核苷酸),其在非小細(xì)胞肺癌的幾乎所有方面發(fā)揮作用,如增殖、凋亡、侵襲/轉(zhuǎn)移和血管生成[11-12]。在本研究中,發(fā)現(xiàn)miR-623的表達(dá)能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡,隨后通過miRDB在線分析miR-623的潛在底物m RNA,發(fā)現(xiàn)miR-623的潛在靶標(biāo)——DNM2,并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確認(rèn)了miR-623對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中DNM2的表達(dá)抑制作用,并進(jìn)一步探明miR-623對DNM2的抑制作用是通過靶向其3'端非編碼區(qū)來實(shí)現(xiàn)的。盡管本研究通過miRDB和熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)miR-623的底物DNM2,然而miR-623是否有其他底物,并且這些底物在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展中是否發(fā)揮生物學(xué)功能仍然值得進(jìn)一步探究。

DNM2是GTP結(jié)合蛋白的一個亞家族,在生物過程中介導(dǎo)膜的分裂和融合,如內(nèi)吞作用、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞分裂和細(xì)胞器分裂。DNM2在胞吞作用機(jī)制中起兩種作用:一種是內(nèi)吞囊泡收縮的早期作用,另一種是內(nèi)吞囊泡破裂的晚期作用。目前發(fā)現(xiàn)DNM2是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用所必需的[13]。除此之外,DNM2還參與了其他細(xì)胞過程,如:通過與肌動蛋白結(jié)合蛋白相互作用來調(diào)控肌動蛋白的組裝和重組阻斷Na+/H+交換器以促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[14]。DNM2是一種新的連接蛋白伴侶,通過一種創(chuàng)新的機(jī)制模型,DNM2可以控制連接蛋白43縫隙連接斑塊的內(nèi)陷、內(nèi)吞、循環(huán)和降解[15]。此外,DNM2是氧化應(yīng)激蛋白的新搭檔,可能在氧化損傷過程中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用[16]。Fish等[17]報(bào)道,DNM2可能主要負(fù)責(zé)過表達(dá)的p53促進(jìn)的凋亡,DNM2是p53上游信號通路的一部分,可以激活轉(zhuǎn)錄因子p53,潛在地觸發(fā)凋亡。此外,Gao等[18]也發(fā)現(xiàn)DNM2能夠促進(jìn)活性氧產(chǎn)生和Ca2+的堆積,最后促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)DNM2能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡,因此激活DNM2可能促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡。本研究同時發(fā)現(xiàn)DNM2的表達(dá)受到miR-623的負(fù)調(diào)控,抑制miR-623能夠上調(diào)DNM2的表達(dá),從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡。因此,miR-623可能是非小細(xì)胞肺癌治療的潛在靶標(biāo),靶向miR-623可能成為治療非小細(xì)胞肺癌患者的一種可能的替代方案。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突