基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對降脂護(hù)肝膠囊干預(yù)脂肪肝的機(jī)制研究

蔡孟成，金永生，鄭 巍，袁梓珂，郭良君 （1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)：a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，b.藥學(xué)院，上海 00433；. 陸軍第七十二集團(tuán)軍醫(yī)院藥械科，浙江 湖州，313000）

脂肪性肝?。ㄖ靖危┦怯筛鞣N原因引起的以肝細(xì)胞彌漫性脂肪變?yōu)椴±硖卣鞯囊环N臨床綜合征，多數(shù)患者伴有代謝性疾病、心血管疾病與膽道系統(tǒng)疾病。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示：全球25%的成人患有脂肪肝，我國脂肪肝的患病率高達(dá)27%且有逐漸年輕化的趨勢[1]。脂肪肝可逐步發(fā)展為肝炎、肝硬化甚至肝癌，故而早期干預(yù)脂肪肝的發(fā)展是保障廣大人民健康與減輕國家醫(yī)療負(fù)擔(dān)的重要舉措?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要通過調(diào)整生活方式、應(yīng)用抗肝損傷及抗代謝紊亂的藥物（如他汀類）進(jìn)行治療。目前，中西醫(yī)結(jié)合治療脂肪肝越來越被當(dāng)代社會推崇。降脂護(hù)肝膠囊是原湖州福音醫(yī)院中醫(yī)科老中醫(yī)趙文敏主任醫(yī)師多年的經(jīng)驗(yàn)用方，于20 世紀(jì)90 年代已在該院推廣使用，并形成院內(nèi)協(xié)定處方。其由山楂、姜黃、茵陳、葛根和決明子五味中藥組成，具有平肝降脂、活血化瘀的作用，將其與西藥配合應(yīng)用對脂肪肝的治療效果顯著[2-3]，但其作用機(jī)制尚不明確。本文旨在應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對降脂護(hù)肝膠囊的作用機(jī)制進(jìn)行探究，以期為日后的實(shí)驗(yàn)研究與臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物靶點(diǎn)的篩選

本研究采用計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺 (TCMSP；http://lsp. nwu.edu.cn/tcmsp.php) 與Traditional Chinese Medicines Integrated Database (TCMID；http://119.3.41.228:8000/tcmid/search/) 檢索中藥姜黃、茵陳、葛根和決明子的活性成分。因山楂在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中未收錄，筆者應(yīng)用TCMID 對山楂進(jìn)行活性成分檢索，利用TCMID 對其余中藥的活性成分進(jìn)行補(bǔ)充。根據(jù)化合物口服生物利用度 (OB) 與類藥性(DL) 進(jìn)行篩選，OB 閾值設(shè)為 OB≥30%，DL 閾值設(shè)為 DL≥0.18[4-5]。此外，由于齊墩果酸、熊果酸、葛根素、姜黃素和6,7-二甲氧基香豆素等化合物已被證實(shí)具有較好的降脂作用，而且在降脂護(hù)肝膠囊中的含量也較高，故將上述化合物也納入活性成分范圍內(nèi)[6-8]，并通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取成分靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)的收集

以 “fatty liver” “l(fā)iver steatosis”等為關(guān)鍵詞檢索 GeneCard（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫與OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/），收集與脂肪肝相關(guān)的作用靶點(diǎn)[9]。

1.3 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

為明確疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)之間的關(guān)系，將兩部分靶點(diǎn)進(jìn)行交集，輸入 Cytoscape 軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape 軟件的核心架構(gòu)是網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)是基因或活性成分，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接代表這些生物分子之間的相互作用，節(jié)點(diǎn)的度值代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)相連的數(shù)目，度值越大說明該活性成分或靶點(diǎn)處于越核心的位置。

1.4 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

為更深層次探究靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將交集所得的共同靶點(diǎn)上傳至線上軟件String10.5(http://stringdb.org)，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。物種選擇為 Homosapiens，置信度設(shè)置為＞0.9，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲取 PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 生物過程與通路分析

利用 R Project 中的 org.Hs.eg.db 程序包（http://www.bioconductor.org/packages/ release /data /annotation/html/org.Hs.eg.db.html）將基因 symbols 轉(zhuǎn)變?yōu)?Entrez IDs，進(jìn)而利用 clusterProfiler 程序包（3.6版）（http://bioconductor.org/packages http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.ht ml）對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行 GO 分析和 KEGG 通路分析。設(shè)定P＜0.05，并按照涉及的靶點(diǎn)數(shù)目多少進(jìn)行排序，獲取 GO 富集分析的前20 個(gè)條目以及 KEGG 富集的前 20 條信號通路[10]。

2 結(jié)果

2.1 潛在活性成分的篩選與對應(yīng)靶點(diǎn)的收集

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到?jīng)Q明子活性成分68 個(gè)，姜黃活性成分52 個(gè)，葛根活性成分18 個(gè)，茵陳活性成分53 個(gè)，通過TCMID 數(shù)據(jù)庫檢索到山楂活性成分94 個(gè)，茵陳活性成分58 個(gè)，姜黃活性成分109 個(gè)，葛根活性成分51 個(gè)，決明子活性成分57 個(gè)。根據(jù)OB≥30%與DL≥0.18，篩選出決明子活性成分14 個(gè)，葛根活性成分4 個(gè)，茵陳活性成分13 個(gè)，姜黃活性成分3 個(gè)，山楂活性成分3 個(gè)。將山楂中的齊墩果酸、熊果酸、咖啡酸、金絲桃苷、表兒茶素，葛根中的葛根素、黃豆苷元，姜黃中的姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、二氫姜黃素與茵陳中的濱蒿內(nèi)酯，納入活性成分范圍。其中，MOL000358（β-谷甾醇）為茵陳和葛根的共有成分，MOL000953（膽甾烷醇）為姜黃和決明子的共有成分，MOL000449（豆甾醇）為決明子和姜黃的共有成分。按照類別計(jì)數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)的活性成分共計(jì)46 個(gè)，部分化合物見表1。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取上述中藥活性成分的靶點(diǎn)，除去重復(fù)靶點(diǎn)，共獲得靶點(diǎn)133 個(gè)。

2.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

從GeneCard 與OMIM 數(shù)據(jù)庫去除重復(fù)基因后，獲得與脂肪肝相關(guān)的靶點(diǎn)7 406 個(gè)。

2.3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“2.1”中的133 個(gè)降脂護(hù)肝膠囊活性成分靶點(diǎn)與“2.2”中的7 406 個(gè)脂肪肝靶點(diǎn)，輸入Venny2.1軟件繪制韋恩圖，兩者進(jìn)行交集后，獲得疾病-藥物成分共同靶點(diǎn)118 個(gè)，見圖1。采用Cytoscape 軟件構(gòu)建的活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)共包含157 個(gè)節(jié)點(diǎn)(39 個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，118 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))和327 條邊，其中，紅色節(jié)點(diǎn)表示化合物，綠色節(jié)點(diǎn)表示藥物靶點(diǎn)，連接化合物與靶點(diǎn)的邊表示它們之間有作用關(guān)系，見圖2。表2 列出了化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)、類別及其度值?；钚猿煞侄戎蹬琶? 位 的 是 槲 皮 素（ quercetin） 、 黃 豆 苷 元（daidzein）、熊果酸（ursolic acid）、葛根素（puerarin）和異鼠李素（isorhamnetin），這5 種化合物的節(jié)點(diǎn)數(shù)分別是71、37、27、25 和16。靶點(diǎn)度值排名前5 位的是前列腺素過氧化物合酶1（PTGS1）、核受體共激活因子2（NCOA2）、絲氨酸蛋白酶1（PRSS1）、雌激素受體2（ESR2）和雄激素受體（AR），分別能與26、17、13、11 和11 個(gè)化合物發(fā)生相互作用，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)的特性。

表1 降脂護(hù)肝膠囊部分活性成分

圖1 降脂護(hù)肝膠囊化學(xué)成分作用靶點(diǎn)與脂肪肝相關(guān)病例靶點(diǎn)交集分析

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

應(yīng)用String 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)(圖3)，在此網(wǎng)絡(luò)圖中包含103 個(gè)節(jié)點(diǎn)、474 條邊，同時(shí)得到網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點(diǎn)的頻次 (圖4)。根據(jù)“度值＞均值”篩選出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)38 個(gè)，包括：CCND1、ESR1、EGFR、RELA、FOS、NCOA1、MAPK8、APOB、IL6、NCOA2、PRKCA、RB1、AR、ATF2、RHOA、CASP3、CASP8、CCNB1、ERBB2、PCNA、VEGFA、CYP1A1、GSK3B、MYC、PPARG、CDKN1B、CTSD、HIF1A、P4HB、PSMD3、BARD1、BCL2、CHRM2、ESR2、IGFBP3、NOS3、PGR、PTPN6。度值最高的是CCND1，度值為17；其次為ESR1，度值為16；EGFR、RELA 的度值為15，F(xiàn)OS、NCOA1 度值為14。度值大的靶點(diǎn)提示在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，且很可能是降脂護(hù)肝膠囊治療脂肪肝的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5 GO 與KEGG 富集分析

GO 富集條目（圖5）主要包括：DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、類固醇激素受體、類固醇結(jié)合、整合素結(jié)合、核受體結(jié)合等。KEGG 富集信號通路（圖6）主要包括：PI3K-Akt 信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染、癌癥中的微小RNA、乙型肝炎、EB 病毒感染等。其中，PI3K-Akt 信號通路的靶點(diǎn)主要包括：GF、RTK、CK、CKR、GPCR、PKC、NOS、 Raf、 GSK3、 Myc、 CCND1、 p27、 Cyclin、p27Kip1、Bcl-2、CASP9、CREB、Mcl-1、NF-?B。乙型肝炎的靶點(diǎn)主要包括：Fas、JNK、c-Myc、SAPK、 NF-?B、 I?B、 Bcl2、 CASP8、 CASP3、CASP9、 pRb、 PKC、 Survivin、 ATF2、 CREB、PCNA、Raf、AP-1、ELK-1、IL6（圖7、圖8）。

3 討論

圖2 降脂護(hù)肝膠囊活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其度值

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脂肪肝病位在肝，病因主要與過食肥甘厚膩、嗜酒無度有關(guān)，疾病早期多為脾失健運(yùn)，痰濕內(nèi)生，濕郁化熱；疾病后期多見熱灼營陰，煉液成痰，痰瘀互結(jié)，故而脂肪肝在早期應(yīng)以清利濕熱為主，在后期當(dāng)在清利濕熱的基礎(chǔ)上佐以活血化瘀。臨床上脂肪肝患者早期無特征性癥狀，故而容易被患者忽視，當(dāng)疾病進(jìn)展到一定程度，患者才來到醫(yī)院尋求治療。降脂護(hù)肝膠囊以清利濕熱、祛瘀活血為治療原則，對脂肪肝后期具有良好的治療作用。方中山楂消食化積、行氣活血、降脂化濁，茵陳清利濕熱、疏肝護(hù)肝，兩者針對痰瘀互結(jié)之病機(jī)根本，共為君藥；葛根通經(jīng)活絡(luò)，解酒毒降脂為臣藥；決明子清肝通便泄?jié)?，姜黃活血行氣為佐使藥?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，山楂的主要化學(xué)成分主要有槲皮素等黃酮類化學(xué)成分，以及熊果酸等三萜酸及綠原酸、檸檬酸等有機(jī)酸等。研究表明，其中總黃酮及三萜酸等化學(xué)成分是山楂降脂作用的主要活性成分，可以抑制低密度脂蛋白的氧化修飾，減少脂質(zhì)過氧化物的形成，發(fā)揮降血脂的作用[11-13]。茵陳的化學(xué)成分主要有6,7-二甲氧基香豆素類、綠原酸、對羥基苯乙酮和揮發(fā)油等化學(xué)成分，這些成分也是茵陳的降脂和保肝的主要活性成分[14-16]。葛根的化學(xué)成分主要有葛根素等異黃酮化合物，這類化合物具有降脂和保肝作用，是葛根降脂作用的主要活性成分[17-19]。決明子的主要化學(xué)成分為蒽醌類物質(zhì)，研究表明決明子蒽醌能減少腸道對膽固醇的吸收，增加排泄，能抑制血清膽固醇升高和主動脈粥樣硬化斑點(diǎn)形成，能明顯增加血清 HDLC 含量及提高HDL-C/TCM 比值，通過反饋調(diào)節(jié)LDL 代謝，降低血清膽固醇水平，延緩和抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，改善體內(nèi)膽固醇的分布[20-21]。姜黃的主要化學(xué)成分為姜黃素類不飽和二酮類物質(zhì)，研究表明姜黃素具有降低高脂血癥大鼠血清TC 及LDL-C 的作用，對家兔的動脈粥樣硬化形成也有抑制作用[22-23]。此外，姜黃還可以增強(qiáng)阿伐他汀的降血脂作用[24]。綜上，降脂護(hù)肝膠囊具有明確的中醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)與物質(zhì)基礎(chǔ)，本文旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究降脂護(hù)肝膠囊的作用機(jī)制，以期推廣其臨床應(yīng)用。

圖3 降脂護(hù)肝膠囊蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 降脂護(hù)肝膠囊作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖5 降脂護(hù)肝膠囊GO 富集分析

圖6 降脂護(hù)肝膠囊KEGG 富集分析

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法共篩選出降脂護(hù)肝膠囊中的活性成分39 個(gè)，作用靶點(diǎn)118 個(gè)，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)聯(lián)合作用的整體性和關(guān)聯(lián)性的特點(diǎn)。根據(jù)“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)結(jié)果，進(jìn)一步得到排名前5 的關(guān)鍵化合物為槲皮素、黃豆苷元、熊果酸、葛根素和異鼠李素。現(xiàn)代研究表明，槲皮素主要通過抗氧化應(yīng)激與抑制炎癥小體激活改善胰島素抵抗，從而減少脂質(zhì)堆積并調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[25-27]；黃豆苷元在通過抗氧化改善脂代謝紊亂的同時(shí)可以調(diào)節(jié)能量代謝，其機(jī)制可能與棕色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白1 的表達(dá)增加有關(guān)[28-30]；熊果酸與葛根素主要通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮減少脂肪堆積的作用，其作用機(jī)制主要與上調(diào)AMPK 和PPARa的表達(dá),及下調(diào)SREBP-lc 和ACC 的表達(dá)有關(guān)[31-33]；現(xiàn)代研究表明，50 mg/kg 劑量口服異鼠李素可以抑制小鼠肝內(nèi)三酰甘油的含量，同時(shí)肝損傷標(biāo)記物也得到相應(yīng)改善，但其作用機(jī)制有待探究[34]。綜上，降脂護(hù)肝膠囊可能是通過槲皮素、黃豆苷元、熊果酸、葛根素和異鼠李素等活性成分發(fā)揮抗氧化應(yīng)激與抑制炎癥反應(yīng)干預(yù)脂肪肝的。

圖7 PI3K-Akt 信號通路圖

圖8 乙型肝炎通路圖

根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果和“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)結(jié)果，降脂護(hù)肝膠囊干預(yù)脂肪肝的主要作用靶點(diǎn)有周期蛋白D1（CCND1）、雌激素受體1（ESR1）、表皮生長因子受體（EGFR）等，其中，CCND1 與炎癥反應(yīng)和能量代謝有關(guān)；ESR1 與EGFR 除了與炎癥反應(yīng)相關(guān)外，還與血管生成有關(guān)，脂肪肝患者多伴有胰島素抵抗，其并發(fā)癥如肥胖癥、高血壓、糖尿病等可能會誘發(fā)新生血管疾病，如視網(wǎng)膜病變。GO 功能富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降脂護(hù)肝膠囊活性成分主要涉及氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、激素抵抗等生物學(xué)過程；KEGG 通路富集主要涉及PI3K-Akt 信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染、癌癥中的微小RNA、乙型肝炎、EB 病毒感染等信號通路，高相關(guān)度的通路主要包括炎癥通路、病毒感染與癌癥通路通路。PI3K-Akt 可以調(diào)控各種不同細(xì)胞的功能，如代謝、生長、增殖、存活等；乙型肝炎通路主要與乙肝病毒感染的炎癥反應(yīng)相關(guān)。現(xiàn)代研究表明，脂肪肝與代謝以及炎癥反應(yīng)高度相關(guān)，在代謝紊亂的基礎(chǔ)上，乙肝病毒感染使得炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇，可逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌愋偷母窝?，若不及時(shí)干預(yù)可進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌。綜上所述，降脂護(hù)肝膠囊可能是通過槲皮素、黃豆苷元、熊果酸、葛根素和異鼠李素等活性成分通過抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激兩條途徑改善脂代謝，降低脂肪堆積，并防止脂肪肝進(jìn)一步向肝癌方向轉(zhuǎn)化，體現(xiàn)了一定的保肝作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析是中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究的重要手段，但是基于中醫(yī)藥理論藥材配伍的特點(diǎn)，還應(yīng)當(dāng)考慮中藥活性成分的含量以及成分與成分之間的協(xié)同作用關(guān)系，這需要通過后續(xù)對海量數(shù)據(jù)處理算法的研發(fā)，此外，還需要通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得出的結(jié)果以增強(qiáng)說服力。但無論如何，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果對臨床應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)研究都具有一定的指導(dǎo)意義。