小鼠腹膜炎模型下血小板的生物學(xué)特征及其轉(zhuǎn)錄組變化

孫志強, 夏美娟, 鄭琳, 趙晶晶, 蘇培, 王洪濤, 周家喜, 劉翠翠

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所), 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 實驗血液學(xué)國家重點實驗室, 國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 天津 300020

血小板是血液系統(tǒng)中體積最小的血細(xì)胞，直徑約2～3 μm[1]，在機(jī)體止血和血栓中發(fā)揮重要作用[2]。近年來，血小板的免疫功能逐漸被研究者們發(fā)現(xiàn)并得到驗證[3]。據(jù)報道，血小板參與炎癥[4]、自身免疫病[5]和抗細(xì)菌/病毒感染[6-8]等多種免疫應(yīng)答過程，可通過黏附清除病原體[9]、分泌活性物質(zhì)[10]、與免疫細(xì)胞相互作用[11]和抗原加工與提呈[12]等多種途徑發(fā)揮免疫調(diào)控作用。例如，在外源性感染早期，血小板可以通過與白細(xì)胞相互作用，尤其是中性粒細(xì)胞，加快中性粒細(xì)胞向感染部位募集[13]；血小板與中性粒細(xì)胞聚集體的形成，有助于調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的免疫功能[14-15]。

雖然沒有細(xì)胞核，但是血小板的胞質(zhì)內(nèi)仍含有種類豐富的RNA，介導(dǎo)血小板的多種功能[16]。隨著RNA測序的快速發(fā)展，血小板的轉(zhuǎn)錄組分析在血小板生物學(xué)研究中的應(yīng)用也越來越廣泛。目前，血小板在不同疾病狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組變化已經(jīng)有部分研究報道，包括膿毒血癥[17]、心肌梗塞[18]、病毒感染[19]等。例如，Middleton等[17]通過對膿毒血癥患者和小鼠模型的血小板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，表面黏附分子CD41蛋白編碼基因ITGA2B(integrin subunit alpha 2b)在膿毒血癥的血小板中顯著上調(diào)，并與患者死亡率增加相關(guān)。Campbell等[20]通過對健康人和登革熱病人的血小板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序也發(fā)現(xiàn)，炎癥相關(guān)基因IFITM3(interferon induced transmembrane protein 3)在登革熱病人的血小板中高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者病情的嚴(yán)重程度和死亡率高度相關(guān)。因此，解析血小板的轉(zhuǎn)錄組變化不僅可以加深對于血小板本身生物學(xué)功能及其潛在分子機(jī)制的理解，而且在臨床疾病的診斷與病情評估中也有極大的應(yīng)用價值。

急性感染模型是研究炎癥狀態(tài)下免疫細(xì)胞數(shù)量與功能變化的重要工具，能為臨床上急性炎癥治療提供理論指導(dǎo)與支撐[21]。為了研究急性感染條件下免疫細(xì)胞和血小板的變化，本研究首先通過小鼠腹腔注射熱滅活的大腸桿菌，構(gòu)建了小鼠腹膜炎急性感染模型；同時借助血常規(guī)、流式細(xì)胞術(shù)等實驗技術(shù)，對感染過程中腹腔免疫細(xì)胞和外周血細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)檢測；最后，通過RNA-Seq解析感染后小鼠血小板轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)變化。本研究有助于加深對急性感染過程中機(jī)體免疫應(yīng)答的認(rèn)知，旨在為解析血小板免疫調(diào)節(jié)功能的分子機(jī)制提供新的角度。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑

獸用血細(xì)胞分析用稀釋液購自深圳mindray公司；臺式液購自廣州沛瑜生物制品有限公司；Trizol購自美國Thermo Scientific公司；本研究中所用抗體均購自美國BioLegend公司。

1.2 實驗儀器

CantoⅡ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；NanoDrop 2000(美國Thermo Scientific公司)；BC-5000Vet血細(xì)胞分析儀(深圳mindray公司)；Multiskan GO酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.3 實驗動物

8周齡的C57BL/6J雌鼠(SPF級別)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院(血液學(xué)研究所)實驗血液學(xué)國家重點實驗室動物中心購買并提供，所有的動物實驗操作都符合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院倫理委員會的規(guī)定與要求。

1.4 E.coli菌種培養(yǎng)與保存

用接種環(huán)取少量大腸桿菌Escherichiacoli(菌種19138；ATCC)菌液接種在LB固體培養(yǎng)基中活化，37 ℃孵箱恒溫培養(yǎng)18～24 h。挑取單個菌落置于4 mL LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行二次活化，37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)10 h。取菌液和30%甘油按體積比1∶1混勻，置于-80 ℃冰箱保存。

1.5 小鼠腹膜炎模型構(gòu)建

取1.4中二次活化后的E.coli菌液，8 000 r·min-1離心2 min，棄上清。用生理鹽水洗滌2遍后重懸于1 mL生理鹽水中。取洗滌后的適量E.coli菌液與生理鹽水1∶5稀釋后用酶標(biāo)儀測定吸光度(OD600)值并按照每0.1 OD值相當(dāng)于1×108cfu·mL-1計算菌濃度。其余E.coli菌液置于80 ℃，高溫滅活30 min。根據(jù)測定的菌濃度將滅活的菌液用生理鹽水稀釋至1×107cfu·300 μL-1，冷卻至室溫后給每只小鼠腹腔注射300 μL。

1.6 小鼠腹腔細(xì)胞檢測

為了檢測腹膜炎條件下小鼠腹腔中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)目和比例的動態(tài)變化，脫頸法處死E.coli感染不同時間點(0、6、12、24、36、48、72 h)的腹膜炎模型小鼠，使用75%乙醇溶液浸泡1 min，用剪刀剪開小鼠腹部毛皮，用10 mL注射器吸取10 mL PE溶液，在腹正中線處進(jìn)針，反復(fù)多次沖洗小鼠腹腔獲得腹腔細(xì)胞懸液，2 000 r·min-1離心5 min得到細(xì)胞沉淀，再用適量PBS溶液重懸。

利用血細(xì)胞分析儀對腹腔細(xì)胞重懸液進(jìn)行血細(xì)胞分類與計數(shù)。同時，取腹腔細(xì)胞重懸液，按抗體說明書要求加入適量抗小鼠CD45、抗小鼠CD11b、抗小鼠Ly6G、抗小鼠F4/80抗體，4 ℃標(biāo)記30 min。標(biāo)記結(jié)束后，加入1 mL PBS溶液，2 000 r·min-1離心5 min，洗去未結(jié)合的抗體，適量PBS溶液重懸后用CantoⅡ儀器進(jìn)行流式檢測。

1.7 小鼠外周血血細(xì)胞檢測

為了檢測腹膜炎條件下小鼠外周血中單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血小板數(shù)目的動態(tài)變化，取腹膜炎模型小鼠造模后不同時間點(0、6、12、24、36、48、72 h)的內(nèi)眥靜脈血20 μL，加入到480 μL血細(xì)胞稀釋液中，渦旋混勻，使用血細(xì)胞分析儀預(yù)稀釋模式檢測小鼠外周血血細(xì)胞分類與計數(shù)。

1.8 血小板分離與純化

取腹膜炎模型小鼠和注射等量生理鹽水的對照小鼠造模后36 h的下腔靜脈血800～1 000 μL，加入等體積生理鹽水稀釋混勻，1 000 r·min-1離心5 min(5升5降)。取富含血小板的上層液體并轉(zhuǎn)移至新的EP管中，3 500 r·min-1離心2 min。棄上清，加入CGS溶液(pH 6.5)重懸，2 500 r·min-1離心2 min，洗滌2遍。棄上清，加入臺式液重懸，靜置1 h，得到純化后的血小板(純度大于99.9%)。

1.9 轉(zhuǎn)錄組分析

取腹腔注射生理鹽水和熱滅活E.coli的小鼠，在注射后36 h通過下腔靜脈取血，分離并純化血小板。使用Trizol裂解血小板，提取RNA。用NanoDrop 2000對RNA濃度進(jìn)行測定和質(zhì)控。RNA濃度(10～1 000 ng·μL-1)和質(zhì)控合格(28S/18S≥1.0)的樣本送由諾禾致源公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，測序樣本獨立重復(fù)3次。隨后，使用STAR(version 2.7.2a)軟件的默認(rèn)參數(shù)對質(zhì)控后的原始數(shù)據(jù)(fastq)進(jìn)行基因組比對，從GENCODE中下載gencode.vM25作為小鼠的參考基因組。使用featureCounts(version 2.0.1)軟件的默認(rèn)參數(shù)得到樣本的基因表達(dá)譜。對標(biāo)準(zhǔn)化后的基因表達(dá)譜進(jìn)行非參數(shù)檢驗和計算倍數(shù)變化(foldchange, FC)。

1.10 血小板表面黏附分子表達(dá)水平檢測

為了檢測小鼠腹膜炎感染前后血小板表面黏附分子CD42d的蛋白表達(dá)水平，通過小鼠內(nèi)眥靜脈取血并進(jìn)行血小板純化，取純化后的血小板，按抗體說明書的要求加入抗小鼠CD41、抗小鼠CD42d抗體，室溫標(biāo)記30 min。標(biāo)記結(jié)束后，加入1 mL CGS溶液，2 500 r·min-1離心2 min，洗去未結(jié)合的抗體，適量臺式液重懸后用CantoⅡ儀器進(jìn)行流式檢測。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用FlowJoV10軟件對流式檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實驗數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism8進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。實驗數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，利用標(biāo)準(zhǔn)t檢驗對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中P<0.05則認(rèn)為數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染過程中腹腔和外周血中免疫細(xì)胞檢測

為了研究免疫細(xì)胞和血小板在急性炎癥條件下的潛在作用，通過注射熱滅活的大腸桿菌(1×107cfu·只-1)構(gòu)建了小鼠腹膜炎模型。巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞是固有免疫細(xì)胞的重要組成部分，基于小鼠腹膜炎模型，首先檢測了感染過程中腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞(CD45+CD11b+F4/80+)和中性粒細(xì)胞(CD45+CD11b+Ly6G+)比例的動態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞的比例在感染后6 h急劇降低至最低值，并持續(xù)保持該低水平，直至72 h開始回升。而腹腔內(nèi)中性粒細(xì)胞的比例則在感染后6 h快速升高，12 h到達(dá)最高值，之后逐漸降低，在72 h大致恢復(fù)到正常水平(圖1A)。進(jìn)一步細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)目與比例變化基本一致(圖1B～1C)。外周血細(xì)胞動態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞數(shù)目在感染后24 h開始顯著增加，在感染后期達(dá)到并維持在最大值，這可能與感染后期小鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)目的回升有關(guān)(圖1D)。而外周血中性粒細(xì)胞數(shù)目在感染后6 h迅速增加，12 h達(dá)到最大值，之后開始逐漸減少，這與小鼠腹腔內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目的變化趨勢相一致(圖1E)。上述結(jié)果提示，在感染初期，腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞最先發(fā)揮殺菌作用，隨后外周中性粒細(xì)胞快速遷移至腹腔參與炎癥反應(yīng)。

A:小鼠腹膜炎模型感染過程中腹腔內(nèi)CD45+細(xì)胞中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例動態(tài)變化流式分析，巨噬細(xì)胞：CD45+CD11b+F4/80+，中性粒細(xì)胞：CD45+CD11b+Ly6G+；B:小鼠腹膜炎模型感染過程中腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)目的動態(tài)變化，每個時間點3只小鼠；C:小鼠腹膜炎模型感染過程中腹腔內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目的動態(tài)變化，每個時間點3只小鼠；D:小鼠腹膜炎模型感染過程中外周血單核細(xì)胞數(shù)目的動態(tài)變化，每個時間點5只小鼠；E:小鼠腹膜炎模型感染過程中外周血中性粒細(xì)胞數(shù)目的動態(tài)變化，每個時間點5只小鼠。*，**，***分別表示處理在P<0.05、P<0.01、P<0.001水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義；NS表示無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.2 感染過程中外周血血小板檢測

隨后，為了研究腹膜炎急性感染對小鼠血小板生物學(xué)特征的影響，進(jìn)一步探究了血小板的數(shù)目、大小在急性感染過程中的動態(tài)變化。血常規(guī)檢測發(fā)現(xiàn)，血小板數(shù)目在感染后6 h內(nèi)大幅降低(下降約50%)，在24 h降至最低，之后逐漸升高，72 h后恢復(fù)到正常水平(圖2A)。此外，平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)和血小板分布寬度(platelet distribution width，PDW)則在感染后呈現(xiàn)升高趨勢，說明感染后血小板體積增大且均一性降低(圖2B～2C)。上述結(jié)果表明，在急性感染過程中血小板的數(shù)目和大小會發(fā)生顯著變化，可能預(yù)示著血小板轉(zhuǎn)錄組和生物學(xué)功能的改變。

A:小鼠腹膜炎模型感染過程中外周血血小板數(shù)目的動態(tài)變化；B:小鼠腹膜炎模型感染過程中外周血血小板MPV的動態(tài)變化；C:小鼠腹膜炎模型感染過程中外周血血小板PDW的動態(tài)變化。每個時間點5只小鼠。*，**，***，****分別表示處理在P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.000 1水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義；NS表示無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.3 感染前后血小板轉(zhuǎn)錄組分析

為了進(jìn)一步研究感染前后血小板的轉(zhuǎn)錄組變化，分別收集了對照組和感染小鼠的純化血小板(純度大于99.9%)進(jìn)行了RNA-Seq。通過對兩組6個測序樣本進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)，發(fā)現(xiàn)對照組和實驗組的3個血小板樣本組內(nèi)變異小，但組間具有明顯差異(圖3A)。差異基因分析發(fā)現(xiàn)，3 725個編碼基因在感染組血小板中顯著上調(diào)(P<0.05, 上升倍數(shù)≥2)，僅108個基因在感染后明顯下降(P<0.05, 下降倍數(shù)≥2)(圖3B)。為了進(jìn)一步研究急性感染中血小板轉(zhuǎn)錄組變化的生物學(xué)意義，首先對感染組表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)分析。結(jié)果表明，這些基因顯著富集于中性粒細(xì)胞脫顆粒、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和中性粒細(xì)胞激活等基因集(圖3C)。Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)分析發(fā)現(xiàn)，與對照血小板相比，白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移(NES=1.51,P=0)相關(guān)基因顯著富集在感染組血小板中(圖3D)。上述結(jié)果提示，在急性感染過程中，血小板可能通過促進(jìn)白細(xì)胞遷移、中性粒細(xì)胞激活等過程參與免疫應(yīng)答。

A:對照小鼠和腹膜炎模型小鼠外周血血小板轉(zhuǎn)錄組PCA，由3次獨立重復(fù)實驗得到6個血小板RNA樣本；B:對照小鼠和腹膜炎模型小鼠血小板中的差異基因火山圖(Volcano Plot)(E.coli vs control：腹膜炎小鼠 vs 對照小鼠)，Up表示表達(dá)水平上調(diào)的基因(P<0.05，F(xiàn)C≥2)，Down表示表達(dá)水平下調(diào)的基因(P<0.05，F(xiàn)C≤0.5)，NS表示表達(dá)水平無顯著差異的基因(P<0.05，0.5

2.4 感染后血小板表面黏附分子表達(dá)水平檢測

血小板表面黏附分子在血小板與中性粒細(xì)胞等白細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮重要作用[22]。為了進(jìn)一步探討血小板促進(jìn)白細(xì)胞遷移的潛在分子機(jī)制，對比了兩組血小板中表面黏附分子的表達(dá)變化(P<0.05, 上升倍數(shù)≥2)。分析發(fā)現(xiàn)，人血管性血友病因子vWF、血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(Pecam1，CD31)、L-選擇素(Sell，CD62L)、P-選擇素(Selp，CD62P)等介導(dǎo)血小板與白細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞黏附的關(guān)鍵因子均在感染后顯著上調(diào)(圖4A)。而且，Itga2b(CD41)、Gp5、Gp1ba和Gp1bb(CD42d/b/c)等黏附分子經(jīng)典受體基因的表達(dá)也明顯升高(圖4A)。為了進(jìn)一步檢測上述表面黏附分子的蛋白表達(dá)水平，選取了表達(dá)豐度和差異倍數(shù)均較高的CD42d進(jìn)行流式檢測。分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，感染36 h后血小板CD42d的平均熒光強度顯著增強(圖4B)。而且，感染36 h后CD42dhigh血小板的比例也顯著升高(圖4C～4D)。上述結(jié)果提示，急性炎癥條件下，血小板可能通過高表達(dá)多種表面黏附分子促進(jìn)白細(xì)胞遷移，從而參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。

A:對照小鼠(Control)和腹膜炎模型小鼠(E.coli)血小板中表面黏附分子的表達(dá)分析熱圖(Heatmap)；B:對照小鼠和腹膜炎模型小鼠血小板中黏附分子CD42d的平均熒光強度(MFI)流式結(jié)果統(tǒng)計分析；C:對照小鼠和腹膜炎模型小鼠中CD42dhigh血小板比例流式檢測結(jié)果；D:對照小鼠和腹膜炎模型小鼠CD42dhigh血小板比例統(tǒng)計分析。流式分析驗證中對照小鼠和腹膜炎模型小鼠各5只。*和***分別表示在P<0.05和P<0.001水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

本研究基于小鼠腹膜炎急性感染模型，對免疫細(xì)胞和血小板在急性感染過程中的動態(tài)變化進(jìn)行了細(xì)致的檢測與分析。研究發(fā)現(xiàn)，在感染早期外周血中性粒細(xì)胞能快速遷移至腹腔參與炎癥反應(yīng)，外周血血小板數(shù)目和大小在感染過程中發(fā)生顯著變化。進(jìn)一步對血小板轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行RNA測序，分析發(fā)現(xiàn)腹膜炎模型小鼠的血小板轉(zhuǎn)錄組發(fā)生了顯著改變，血小板中免疫反應(yīng)相關(guān)基因在感染后顯著上調(diào)，多種表面黏附分子的表達(dá)顯著增加，血小板的免疫功能顯著增強。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是生物學(xué)研究中的重要工具。目前，血小板轉(zhuǎn)錄組測序在一些特定疾病條件下已有相關(guān)研究報道[16]，這些研究極大地推動了血小板領(lǐng)域的發(fā)展，拓展了研究者們對血小板功能的認(rèn)知，尤其是血小板的免疫功能。本研究通過對腹膜炎模型小鼠的血小板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，不僅為血小板研究領(lǐng)域提供了小鼠腹膜炎條件下血小板的轉(zhuǎn)錄圖譜，而且為血小板免疫功能及作用機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

血小板的免疫功能多樣，在機(jī)體固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答中都發(fā)揮著重要作用。并且在不同疾病條件下，血小板參與免疫反應(yīng)的分子機(jī)制也不盡相同。激活的血小板可以通過膜表面表達(dá)的P選擇素(P-selectin)與白細(xì)胞表面的P選擇素糖蛋白配體(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)相互作用，調(diào)節(jié)白細(xì)胞外滲、吞噬作用和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄與釋放等生物學(xué)功能[22]。血小板能和中性粒細(xì)胞形成聚集體，調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)、中性粒細(xì)胞細(xì)胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)的產(chǎn)生與釋放[14-15]。血小板表面受體分子在介導(dǎo)血小板抗感染和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其中表面黏附分子CD41[23]、CD42[24]、P-selectin[25]和CD31[26]等在血小板聚集黏附、白細(xì)胞募集過程中尤為關(guān)鍵。本研究通過對血小板轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，腹膜炎急性感染后小鼠血小板的轉(zhuǎn)錄組發(fā)生了顯著改變，大量免疫反應(yīng)相關(guān)的基因以及多種介導(dǎo)血小板與白細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞黏附的受配體分子的表達(dá)顯著升高。上述結(jié)果提示，在急性炎癥條件下，血小板可能通過高表達(dá)多種表面黏附分子增強自身的免疫功能，從而更快更強地促進(jìn)白細(xì)胞遷移和激活中性粒細(xì)胞，參與調(diào)節(jié)炎癥進(jìn)程和免疫應(yīng)答的過程之中。

總之，本研究對急性感染條件下血小板免疫調(diào)節(jié)功能的分子機(jī)制做了初步探索，但仍然存在許多有趣且重要的問題值得進(jìn)一步研究。比如，急性感染條件下血小板免疫表型的改變，血小板與外周血其他免疫細(xì)胞相互作用的方式，血小板數(shù)量對腹膜炎急性感染進(jìn)程的影響等。未來研究中對這些問題的解答，有助于深入了解血小板在腹膜炎等急性感染條件下的免疫調(diào)控機(jī)制，有望為急性感染患者的臨床診斷與治療提供新的思路和方法。