脛骨橫向骨搬移術(shù)后皮膚干細(xì)胞促進(jìn)重度糖尿病足創(chuàng)面再生愈合的機(jī)制研究

姜圣潔，花奇凱，陳炎，李山郎，劉光煒，聶新宇，蘇宏杰，鄺曉聰，3*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究中心，廣西 南寧 530021；4.廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530021)

糖尿病容易引發(fā)神經(jīng)與血管慢性損傷，在下肢，尤其是足部皮膚多導(dǎo)致難愈性潰瘍，被稱為糖尿病足。在糖尿病患者的整個(gè)病程中，約有1/4概率罹患糖尿病足，全球每年約400萬患者發(fā)病，而其中的重度糖尿病足是糖尿病患者截肢的主要原因[1-2]，分析發(fā)現(xiàn)，約85%以上糖尿病患者由于重度糖尿病足而截肢。糖尿病足治療最佳結(jié)果是保肢，但仍然是當(dāng)前治療的一大難題。目前常規(guī)清創(chuàng)、換藥方法以及植皮、皮瓣移植等治療手段，未能達(dá)到預(yù)期的愈合效果[4-5]，尤其對于Wagner 3、4級重度糖尿病足患者，截肢率則更高。

針對高截肢率的重度糖尿病足，近幾年花奇凱團(tuán)隊(duì)采用脛骨橫向骨搬移術(shù)治療可顯著提高重度糖尿病足患者潰瘍創(chuàng)面的愈合率，縮短愈合時(shí)間，其依托原理是張力-應(yīng)力法則理論[6]。張力-應(yīng)力法則僅僅是臨床現(xiàn)在的生物學(xué)規(guī)律的邏輯總結(jié)，并未涉及其中具體的分子與細(xì)胞機(jī)制。本次研究從創(chuàng)面局部皮膚干細(xì)胞活化角度，初步研究脛骨橫向骨搬移術(shù)促進(jìn)重度糖尿病足難愈性創(chuàng)面再生愈合的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年6月至2018年1月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科住院，經(jīng)脛骨橫向骨搬移治療的126例重度糖尿病足患者為研究對象，其中男94例，女32例，年齡39～86歲，中位數(shù)年齡61歲；Wagner分級構(gòu)成：3級67例，4級57例，5級2例；TEXAS分級構(gòu)成：2B級50例，2C級6例，2D級9例，3B級17例，3C級1例，3D級43例。脛骨橫向骨搬移術(shù)治療經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)Wagner 3級及以上糖尿病足患者；(2)患者具有強(qiáng)烈的保肢意愿；(3)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者的基礎(chǔ)條件差，不能耐受手術(shù)；(2)動脈完全閉塞，且無明顯側(cè)枝循環(huán)形成者；(3)患者有嚴(yán)重的心肺疾患、肝腎功能不全；(4)免疫功能差或長期接受類固醇治療。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.2.1 主要試劑 小鼠抗人CK19單克隆抗體(Abcam)、兔抗人LGR5多克隆抗體(Abcam)、酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G(immunoglobin G，IgG)工作液(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.2.2 創(chuàng)面愈合情況及大體觀察 記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間，肉眼觀察創(chuàng)面經(jīng)脛骨橫向骨搬移治療后的愈合過程。

1.2.3 標(biāo)本收集 術(shù)前及術(shù)后1個(gè)月復(fù)診時(shí)切取創(chuàng)面邊緣組織，用10%福爾馬林固定、石蠟包埋，切片備用。

1.2.4 創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察 將切片常規(guī)脫蠟水化后，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.2.5 創(chuàng)面組織中CK19、LGR5陽性細(xì)胞分布與蛋白表達(dá)情況觀察 采用免疫組織化學(xué)染色法，創(chuàng)面組織蠟塊常規(guī)脫蠟、水化、修復(fù)，依次滴加一抗稀釋液小鼠抗人CK19單克隆抗體(1︰1 000)、兔抗人LGR5多克隆抗體(1︰25)，和采用酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG二抗以及DAB顯色，封片后光鏡下采圖，以Image J軟件進(jìn)行LGR5、CK19染色陽性細(xì)胞面積比例測算。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面愈合情況及創(chuàng)面大體觀 納入研究的126例患者，1例截肢，125例患者創(chuàng)面愈合，愈合時(shí)間為(143.5±86.4)d。脛骨橫向搬移術(shù)后，傷口早期可見黃色纖維素樣膜性物質(zhì)，創(chuàng)緣收縮，類似于創(chuàng)面愈合炎癥期；隨后創(chuàng)面邊緣開始增生，向創(chuàng)面中心部位移行，期間鮮紅肉芽組織形成并填充創(chuàng)面，創(chuàng)面邊緣不斷上皮化使創(chuàng)面愈合，僅有少量線性或細(xì)條狀瘢痕，見圖1。

2.2 創(chuàng)面組織病理學(xué)變化 治療前創(chuàng)面組織表皮層變薄，以基底層明顯，真皮層有大量炎性細(xì)胞浸潤且微血管少；脛骨橫向搬移術(shù)后，爬行覆蓋創(chuàng)面皮膚組織可見完整表皮結(jié)構(gòu)，基底層細(xì)胞增多，真皮層炎性細(xì)胞減少，可見豐富的微血管、膠原纖維和腺管結(jié)構(gòu)，見圖2。

a 術(shù)前表皮層、真皮層 b 術(shù)前皮下組織 c 術(shù)后表皮層和真皮層 d 術(shù)后皮下組織

2.3 創(chuàng)面組織中CK19、LGR5表達(dá)情況 潰瘍創(chuàng)面邊緣組織中，CK19蛋白是細(xì)胞質(zhì)染色陽性，在術(shù)后創(chuàng)面組織，陽性細(xì)胞聚集性分布于表皮、真皮以及皮下腺體組織中，但基底層細(xì)胞未見明顯的CK19陽性細(xì)胞，其CK19陽性細(xì)胞面積比為(9.095±2.926)%，顯著高于術(shù)前的(1.834±0.772)%，兩者比較t=13.141，P<0.05。LGR5蛋白是細(xì)胞質(zhì)染色陽性，主要分布于皮膚真皮層的腺管樣結(jié)構(gòu)的上皮細(xì)胞中，術(shù)前創(chuàng)面組織中LGR5細(xì)胞面積比為(1.398±0.620)%，治療后LGR5為(6.781±1.889)%，兩者比較t=14.829，P<0.05(見圖3～4)。

3 討 論

脛骨橫向骨搬移術(shù)衍生于外固定架技術(shù)，但已經(jīng)拓展了外固定架技術(shù)的應(yīng)用范疇，現(xiàn)在多用于各種下肢難愈性創(chuàng)面的治療，療效顯著，如糖尿病足、骨髓炎潰瘍等[6-8]。從其遵循基本的張力-應(yīng)力法則來看，其認(rèn)為在活體組織受到持續(xù)穩(wěn)定的緩慢牽伸張力時(shí)，可以刺激組織發(fā)生類似胎兒組織的細(xì)胞分裂，參與組織的修復(fù)與再生，是一個(gè)臨床現(xiàn)象與愈合規(guī)律的描述性總結(jié)，未涉及其中的細(xì)胞與分子機(jī)制。本次研究納入的重度糖尿病足患者，都是經(jīng)過多家醫(yī)院和進(jìn)行過多次清創(chuàng)、皮瓣移植等治療，療效不佳而成為典型難愈性創(chuàng)面。在脛骨橫向搬移術(shù)后，約2～3周開始出現(xiàn)新鮮肉芽，后續(xù)又可觀察到創(chuàng)面邊緣上皮開始向創(chuàng)面中心移行，最后愈合創(chuàng)面可見線性或細(xì)條狀瘢痕，一般愈合時(shí)間為4～5個(gè)月，創(chuàng)面已基本愈合為大體觀基本正常的上皮組織。在脛骨橫向搬移術(shù)后1個(gè)月左右創(chuàng)面邊緣移行的上皮組織取材，發(fā)現(xiàn)表皮層結(jié)構(gòu)完整，基底層、棘層、顆粒層、透明層、角質(zhì)層，真皮層可見以單核細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，但較術(shù)前減少；同時(shí)，在此階段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)真皮層豐富的微血管、毛細(xì)血管、膠原和柱狀上皮構(gòu)成的腺管樣結(jié)構(gòu)，這均提示移行的上皮組織具有較為完整的組織結(jié)構(gòu)，為后期形成皮膚重塑并形成相關(guān)功能提供了細(xì)胞與組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，這均表明脛骨橫向骨搬移術(shù)可促進(jìn)重度糖尿病足難愈性潰瘍創(chuàng)面的再生愈合，值得進(jìn)一步研究其中的調(diào)控機(jī)制。

表2 糖尿病足治療前后創(chuàng)面組織中CK19、LGR5染色陽性細(xì)胞面積百分比(%)

a 術(shù)前表皮層、真皮層 b 術(shù)前皮下組織 c 術(shù)后表皮層和真皮層 d 術(shù)后皮下組織

a 術(shù)前表皮層、真皮層 b 術(shù)前皮下組織 c 術(shù)后表皮層和真皮層 d 術(shù)后皮下組織

本課題組在前期研究也發(fā)現(xiàn)，脛骨橫向骨搬移術(shù)后創(chuàng)面巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)有所改變，從趨向M1極化的促炎狀態(tài)回落至M1/M2均衡狀態(tài)，M1和M2細(xì)胞數(shù)量均減少，但維持一定數(shù)量，這和本次發(fā)現(xiàn)真皮層中單核細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤減少是一致的[9-10]。在皮膚再生修復(fù)中，一定程度的炎性反應(yīng)是必要條件，尤其M2巨噬細(xì)胞，也稱為“傷口愈合”巨噬細(xì)胞，既可以誘導(dǎo)血管生成和組織重塑，還可以分泌抗炎因子，調(diào)控創(chuàng)面愈合微環(huán)境，通過激活皮膚干細(xì)胞來啟動和參與潰瘍創(chuàng)面再生修復(fù)[11-12]。本次研究發(fā)現(xiàn)CK19和LGR5陽性細(xì)胞活化明顯高于術(shù)前，提示皮膚干細(xì)胞已經(jīng)被動員與活化參與創(chuàng)面再生修復(fù)。其中CK19與表皮干細(xì)胞有關(guān)，在研究中發(fā)現(xiàn)CK19陽性細(xì)胞分布在表皮和真皮層，且分布面積明顯增加，基底數(shù)量細(xì)胞也增加，表明皮膚干細(xì)胞參與修復(fù)可能是全方位的。尤其值得關(guān)注的是，在真皮層腺腔結(jié)構(gòu)中的柱狀上皮細(xì)胞有大量LGR5陽性細(xì)胞，而LGR5是毛囊干細(xì)胞的標(biāo)志，其分布面積明顯高于術(shù)前組織。在后續(xù)新生皮膚結(jié)構(gòu)重塑中，CK19和LGR5等陽性的皮膚干細(xì)胞均可參與微血管、毛發(fā)、汗腺、皮脂腺等組織結(jié)構(gòu)的再生，如LGR5陽性細(xì)胞毛發(fā)再生的前體細(xì)胞[13-14]。而本次研究與前期研究也發(fā)現(xiàn)搬移后真皮層出現(xiàn)豐富的微血管。因此，脛骨橫向骨搬移技術(shù)能顯著促進(jìn)重度糖尿病足難愈性創(chuàng)面愈合，其機(jī)制可能是通過改善創(chuàng)面愈合微環(huán)境，如M1和M2巨噬細(xì)胞的調(diào)控平衡，在適度的炎性環(huán)境中活化皮膚干細(xì)胞，如CK19和LGR5陽性細(xì)胞，以形成表皮、微血管和皮膚腺體等，達(dá)到再生的效果。