牛DHX36解旋酶及其突變體底物結(jié)合與解旋活性研究

郭青青，郭海磊，劉娜女，奚緒光

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

解旋酶是一類可以水解三磷酸腺苷釋放能量并打開(kāi)核酸之間氫鍵的一類分子“馬達(dá)”蛋白，廣泛存在于病毒、細(xì)菌和真核生物中[1-2]，參與細(xì)胞的多種代謝過(guò)程，如DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及RNA剪切等生命活動(dòng)[3-5]。編碼解旋酶的基因一旦發(fā)生突變或缺失，將無(wú)法表達(dá)相應(yīng)的蛋白，進(jìn)而引起多種嚴(yán)重的遺傳性疾病，如Bloom綜合癥、Werner綜合癥、Rothmund-Thomson綜合癥等[6-8]。根據(jù)解旋酶的序列保守性、結(jié)構(gòu)相似性及解旋方向性，可以將其分為6個(gè)超家族：SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6[9]。SF1和SF2是其中最大的兩個(gè)超家族，SF1是目前研究得最清楚的超家族；SF2是含有眾多亞家族的超家族，其中研究較多的是DEAD-box、DEAH/RHA和Snf2等亞家族[10-12]。

富含鳥(niǎo)嘌呤的核酸序列可以通過(guò)4個(gè)鳥(niǎo)嘌呤自行組裝成四鏈體結(jié)構(gòu)，即G4結(jié)構(gòu)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，能夠形成G4結(jié)構(gòu)的基因序列多存在于特定的基因組區(qū)域，例如端粒、核糖體DNA、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、啟動(dòng)子區(qū)域[13-15]等。由于位置的特殊性，G4結(jié)構(gòu)可能參與了基因表達(dá)調(diào)控的許多生物學(xué)過(guò)程[16-17]。G4結(jié)構(gòu)主要有兩類，即DNA G4結(jié)構(gòu)和RNA G4結(jié)構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)，人類細(xì)胞中的DNA G4結(jié)構(gòu)在DNA復(fù)制、修復(fù)以及維持染色體的穩(wěn)定等方面起著重要的作用。在DNA復(fù)制過(guò)程中，DNA G4結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)會(huì)阻礙復(fù)制的順利進(jìn)行，此時(shí)就需要解旋酶來(lái)進(jìn)行修復(fù)[18]。真核細(xì)胞中有許多解旋酶，其中不少參與G4結(jié)構(gòu)的解旋活動(dòng)[19-20]。

DHX36(也稱為RHAU或G4R1)是SF2超家族中DEAH/RHA亞家族的成員，是對(duì)含有G4結(jié)構(gòu)的底物具有較高親和力的一類ATP依賴型RNA解旋酶[19-21]。DHX36的基本組成是解旋酶核心區(qū)域以及位于兩側(cè)的N端和包含OB域的C端區(qū)域。目前，人們對(duì)DHX36 N端區(qū)域的研究較為深入，根據(jù)生物信息學(xué)分析，將其分為兩個(gè)部分：富含甘氨酸區(qū)和RSM區(qū)[22]。Lattman等[23]發(fā)現(xiàn)，DHX36 N端的RSM區(qū)是參與G4結(jié)構(gòu)結(jié)合和解旋活動(dòng)必不可少的部分，截去N端區(qū)域后蛋白不具有解旋活性。還有研究表明，DHX36的RSM區(qū)氨基酸序列能夠識(shí)別端粒上的G4結(jié)構(gòu)并參與端粒延伸的調(diào)控[24]。說(shuō)明DHX36的N端區(qū)域是參與G4結(jié)構(gòu)解旋的重要部位。據(jù)報(bào)道，DHX36能夠與G4結(jié)構(gòu)相互作用，從而對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程進(jìn)行調(diào)控，其還在小鼠心臟發(fā)育和造血過(guò)程中發(fā)揮重要作用[25-26]。Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)，果蠅DHX36(DmDHX36)N端的RSM區(qū)和C端的OB域是參與G4結(jié)構(gòu)結(jié)合及解旋的主要部位。

目前，因人DHX36(hDHX36)蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)難度較大，因此有關(guān)hDHX36的酶學(xué)特征和結(jié)構(gòu)研究相對(duì)較少。本研究選擇與hDHX36同源性較高且可在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的牛(Bostaurus)DHX36(BtDHX36)解旋酶為材料，利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得高純度野生型BtDHX36蛋白、RSM區(qū)突變體蛋白(BtDHX36R63AI65A、BtDHX36Y69A、BtDHX36K76AN77AK78A)和OB域突變體蛋白(BtDHX36Y862A)，利用熒光各向異性法(FA)和快速停流-熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)，比較野生型BtDHX36及其突變體對(duì)底物結(jié)合和解旋活性的差異，旨在為牛DHX36的酶學(xué)特征和結(jié)構(gòu)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質(zhì)粒、載體及菌種 野生型BtDHX36蛋白編碼的基因序列(載體PBHM-BtDHX36)，由Bio-Matik公司合成；表達(dá)載體pET15b、大腸桿菌菌株Top10、BL21(DE3)和質(zhì)粒pET15b-sumo-DmDHX36均由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物大分子實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑、柱材及儀器 T4 DNA ligase、Prime STAR DNA polymerase，購(gòu)自Takara公司；EcoRⅠ、XhoⅠ、NdeⅠ等限制性內(nèi)切酶，購(gòu)自NEB公司；Ni-NTA Beads、Hi Trap SP HP預(yù)裝柱，購(gòu)自GE healthcare公司；低溫超高壓破碎儀，購(gòu)自JNBIO公司；超聲波破碎儀，購(gòu)自寧波江南儀器廠；AKTA purifier蛋白純化儀，購(gòu)自GE healthcare公司。

1.2 方 法

1.2.1 DNA底物的準(zhǔn)備 根據(jù)文獻(xiàn)[28]，設(shè)計(jì)用于DNA結(jié)合試驗(yàn)的底物16nt-ssDNA、Telomere G4和用于解旋試驗(yàn)的底物Telomere G4-16T序列，交給生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中16nt-ssDNA和Telomere G4底物均標(biāo)記熒光素(fluorescein，F(xiàn))，Telomere G4-16T底物標(biāo)記熒光素(fluorescein，F(xiàn))和六氯熒光素(hexachloroflourescein，HF)，底物序列見(jiàn)表1。16nt-ssDNA底物用ddH2O稀釋后備用；Telomere G4和Telomere G4-16T底物分別置于退火緩沖液(100 mmol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5)中，100 ℃加熱使其變性5 min，然后緩慢冷卻至室溫，備用。

1.2.2 野生型BtDHX36及其突變體表達(dá)載體的構(gòu)建 野生型BtDHX36及其突變體表達(dá)載體構(gòu)建流程如圖1所示。將含有BtDHX36基因的載體PBHM-BtDHX36用EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙酶切，得到野生型BtDHX36基因片段。使用實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的pET15b-sumo-DmDHX36質(zhì)粒為模板，以sumo-F為上游引物(序列：5′-GCCATATGAGCGATAGCGAAGT-3′)，sumo-R為下游引物(序列：5′-CAGATTGGCGGCGAATTCCA-3′)，擴(kuò)增具有促進(jìn)蛋白溶解作用的sumo基因片段，PCR擴(kuò)增體系為50 μL：5×Prime STAR Buffer(Mg2+plus)10 μL、Prime STAR DNA polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL、dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4.0 μL、sumo-F和sumo-R(10 μmol/L)各1 μL、模板(30 ng/μL)1 μL、ddH2O 32.5 μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min后，16 ℃保溫。對(duì)sumo基因片段進(jìn)行NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切,使用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切pET15b載體。將BtDHX36、sumo基因片段、pET15b按照3∶3∶1物質(zhì)的量比加入連接體系，16 ℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Top10克隆菌，涂至平板后于37 ℃培養(yǎng)8 h，對(duì)菌落進(jìn)行PCR、質(zhì)粒EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，最終獲得野生型重組質(zhì)粒pET15b-sumo-BtDHX36。

采用Overlap PCR 在BtDHX36中引入點(diǎn)突變，用突變后的BtDHX36基因片段構(gòu)建4種BtDHX36突變體(mutant)(RSM區(qū)突變體BtDHX36R63AI65A、BtDHX36Y69A、BtDHX36K76AN77AK78A和OB域突變體BtDHX36Y862A)的重組質(zhì)粒，并進(jìn)行菌落PCR、質(zhì)粒EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，具體方法同上。

1.2.3 野生型BtDHX36及其突變體的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將鑒定正確的野生型重組質(zhì)粒pET15b-sumo-BtDHX36轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。挑選單克隆進(jìn)行活化，37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液在600 nm處的吸光度(OD600)為0.7～0.8時(shí)，加入IPTG(終濃度0.3 mmol/L)，18 ℃誘導(dǎo)14 h后取樣。將樣品進(jìn)行4 500 r/min離心(10 min)，收集菌體沉淀，按質(zhì)量(g)體積(mL)比1∶10加入裂解Buffer(20 mmol/L Tris-HCl pH=7.9，500 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)5%甘油，5 mmol/L咪唑)復(fù)溶，先利用低溫超高壓破碎儀破菌4次，再使用超聲波打斷DNA雙鏈以降低溶液黏度，然后于12 000 r/min離心45 min，分別留取部分上清液和沉淀樣品。用0.45 μm濾膜過(guò)濾上清液，將其載入Ni-NTA親和層析柱，使用Elute Buffer(20 mmol/L Tris-HCl pH=7.9，500 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)10%甘油，300 mmol/L咪唑)洗脫，留取部分洗脫樣品。將含有目的蛋白的洗脫樣品按1∶1 000的物質(zhì)的量比加入sumo酶，4 ℃酶切過(guò)夜，留取部分酶切樣品。用稀釋Buffer(20 mmol/L Tris-HCl，pH=7.9，體積分?jǐn)?shù)10%甘油)稀釋蛋白樣品至NaCl終濃度為80 mmol/L，然后使用Hi Trap SP HP柱梯度洗脫，將得到的洗脫樣品進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)，合并較純組分并用30 ku的Millipore超濾管離心濃縮，分裝后立即用液氮速凍，置于-80 ℃保存。對(duì)上述各步所得樣品進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)。同法對(duì)BtDHX36突變體蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)與純化。

1.2.4 野生型BtDHX36體外最佳底物結(jié)合條件試驗(yàn) 以16nt-ssDNA為底物，檢測(cè)野生型BtDHX36與底物的體外最佳結(jié)合條件，考察因素包括KCl、MgCl2濃度、反應(yīng)溫度、pH，反應(yīng)體系150 μL，其中含5 nmol/L熒光標(biāo)記底物的16nt-ssDNA、野生型BtDHX36蛋白(0，4，8，12，16，20，24，36，50，100，200，300 nmol/L)和Buffer(20 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、20 mmol/L Tris-HCl，pH=7.5)。分別在不同的KCl濃度(0，50和100 mmol/L)、反應(yīng)溫度(25，30和37 ℃)、MgCl2濃度(0，2和5 mmol/L)、pH(6.5，7.5和8.5)下孵育5 min，用Infinite F200/M200型多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)測(cè)定每種反應(yīng)條件下的各向異性值(Δr)，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。用Origin軟件擬合蛋白濃度與Δr的曲線，由此曲線獲得理論最大各向異性值(Δrmax)，用希爾方程Δr=Δrmax×P/(Kd+P)，計(jì)算平衡解離常數(shù)(Kd)，式中P為解旋酶的濃度。以Kd為判定指標(biāo)，確定野生型BtDHX36蛋白與16nt-ssDNA的體外最佳結(jié)合條件。

1.2.5 野生型BtDHX36及其突變體的底物結(jié)合活性差異分析 在最佳底物結(jié)合條件下，以Telomere G4為底物，檢測(cè)野生型BtDHX36及其4種突變體(BtDHX36R63AI65A、BtDHX36Y69A、BtDHX36K76AN77AK78A、BtDHX36Y862A)蛋白與底物結(jié)合活性的差異。具體操作為：使用酶標(biāo)板加樣，結(jié)合反應(yīng)體系為150 μL/孔，其中含5 nmol/L底物和不同濃度(0，5，10，15，20，30，40，60，100，200，400 nmol/L)的上述5種蛋白，振蕩混勻，37 ℃孵育5 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)得到其對(duì)應(yīng)的Δr，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。用Origin軟件擬合蛋白濃度與Δr的曲線，由此曲線獲得Δrmax，進(jìn)而得到結(jié)合比例(Δr/Δrmax), 用Origin軟件擬合蛋白濃度與結(jié)合比例的曲線。使用希爾方程計(jì)算Kd，比較5種蛋白結(jié)合活性的差異。

1.2.6 野生型BtDHX36及其突變體的解旋活性差異分析 利用Bio-Logic SFM-400停流裝置結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理，以Telomere G4-16T為底物，測(cè)定得到野生型BtDHX36及其突變體蛋白的解旋動(dòng)力學(xué)曲線，并以速率常數(shù)為指標(biāo)分析野生型BtDHX36及突變體蛋白的解旋活性差異。試驗(yàn)重復(fù)3次，所有解旋數(shù)據(jù)均參考Zhang等[29]的方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型BtDHX36及其突變體的載體構(gòu)建與蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

2.1.1 野生型BtDHX36表達(dá)載體的鑒定及蛋白純化 野生型BtDHX36經(jīng)菌落PCR鑒定,得到2.8 kb的片段(圖2-A)，與預(yù)期結(jié)果一致。挑選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒pET15b-sumo-BtDHX36經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，出現(xiàn)了約2.8 kb的目的基因片段(圖2-B)。將重組質(zhì)粒pET15b-sumo-BtDHX36轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)野生型BtDHX36蛋白(108 ku)，結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白在沉淀和上清液中均有表達(dá)，但主要存在于沉淀中(圖2-C泳道1)。上清液樣品經(jīng)Ni-NTA親和層析純化可得到大量目的蛋白(圖2-C泳道3)，經(jīng)sumo酶切后獲得了不帶sumo標(biāo)簽的蛋白(圖2-C泳道4)；經(jīng)SP柱梯度洗脫后得到相對(duì)較純的野生型BtDHX36(圖2-C泳道5)；最終濃縮得到純度大于95%的野生型BtDHX36蛋白(圖2-C泳道6)。

A.野生型BtDHX36菌落PCR鑒定結(jié)果，M.DS5000 DNA Marker，1.菌落PCR結(jié)果;B.野生型BtDHX36重組質(zhì)粒的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定結(jié)果，M.DS5000 DNA Marker，1.雙酶切產(chǎn)物;C.野生型BtDHX36蛋白誘導(dǎo)表達(dá)純化結(jié)果，1.菌體破碎沉淀，2.菌體破碎上清液，3.Ni-NTA柱洗脫液，4.不帶sumo標(biāo)簽的蛋白，5.Hi Trap SP HP離子柱純化后的蛋白，6.濃縮結(jié)果，M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白MarkerA.The wild-type BtDHX36 colony PCR identification results,M.DS5000 DNA Marker,1.Colony PCR results;B.Identification results of wild-type BtDHX36 recombinant plasmid by EcoRⅠ and XhoⅠ double digestion,M.DS5000 DNA Marker,1.Double digestion products;C.Induced expression and purification results of wild-type BtDHX36 protein,1.Bacterial crushing precipitate,2.Bacterial crushing supernatant,3.Ni-NTA column eluent,4.Protein without sumo tag,5.His Trap SP HP ion column purified protein,6.Concentration result,M.Standard protein Marker圖2 野生型BtDHX36表達(dá)載體鑒定及蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化Fig.2 Identification of wild-type BtDHX36 expression vector and induced expression and purification of protein

2.1.2 BtDHX36突變體表達(dá)載體的鑒定及蛋白純化結(jié)果 BtDHX36突變體表達(dá)載體的鑒定及蛋白純化結(jié)果見(jiàn)圖3。

A.BtDHX36突變體菌落PCR鑒定結(jié)果，M.DS5000 DNA Marker；B.BtDHX36突變體重組質(zhì)粒的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，M.DS5000 DNA Marker；C.突變體濃縮結(jié)果，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker;1～4.分別代表突變體BtDHX36R63AI65A、BtDHX36Y69A、BtDHX36K76AN77AK78A和BtDHX36Y862AA.PCR identification results of BtDHX36 mutant colonies,M is DS5000 DNA Marker;B.BtDHX36 mutant recombinant plasmid identified by EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ double digestion results,M is DS5000 DNA Marker;C.Mutant concentration results,M is the standard protein Marker;1-4.Results of mutant BtDHX36R63AI65A,BtDHX36Y69A,BtDHX36K76AN77AK78A,BtDHX36Y862A,respectively圖3 BtDHX36突變體表達(dá)載體鑒定及蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化Fig.3 Identification of BtDHX36 mutant expression vector and induced expression and purification of protein

4種BtDHX36突變體表達(dá)載體經(jīng)菌落PCR鑒定，均獲得了與野生型BtDHX36一致的結(jié)果(圖3-A)。挑選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，出現(xiàn)與野生型BtDHX36長(zhǎng)度一樣(2.8 kb)的片段(圖3-B)。4種BtDHX36突變體經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)純化后，均獲得與野生型一致的純化結(jié)果，并得到純度大于95%的BtDHX36突變體蛋白(圖3-C)。

2.2 野生型BtDHX36解旋酶體外最佳底物結(jié)合條件的確定

由圖4-A可知，當(dāng)KCl濃度為50 mmol/L時(shí)，野生型BtDHX36解旋酶與16nt-ssDNA底物的平衡解離常數(shù)Kd值最小，為(16.2±0.1) nmol/L，表明此時(shí)蛋白與底物親和力最強(qiáng)；由圖4-B可以看出，當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，Kd值最小，因此BtDHX36結(jié)合底物的最佳反應(yīng)溫度為37 ℃；由圖4-C可知，當(dāng)MgCl2濃度為2 mmol/L時(shí)，Kd值最小，說(shuō)明此時(shí)蛋白與底物親和力最強(qiáng)；由圖4-D可以看出，20 mmol/L Tris-HCl的pH過(guò)高或過(guò)低都不利于蛋白與底物的結(jié)合，當(dāng)pH為7.5時(shí)，Kd值最小。綜上可知，野生型BtDHX36與16nt-ssDNA底物的體外最佳結(jié)合條件為：KCl 50 mmol/L、MgCl22 mmol/L、20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5、反應(yīng)溫度37 ℃。

圖4 野生型BtDHX36解旋酶與16nt-ssDNA底物的體外最佳結(jié)合條件Fig.4 In vitro optimal binding conditions of wild-type BtDHX36 helicase and 16nt-ssDNA substrate

2.3 野生型BtDHX36及其突變體與底物結(jié)合活性的比較

從圖5-A可以看出，野生型BtDHX36蛋白、RSM區(qū)突變體蛋白(BtDHX36R63AI65A、BtDHX36Y69A、BtDHX36K76AN77AK78A)和OB域突變體蛋白(BtDHX36Y862A)均能高效結(jié)合Telomere G4底物。圖5-B顯示，野生型BtDHX36蛋白Kd值最小，為(56.5±0.4) nmol/L，表明其與底物的結(jié)合活性較突變體強(qiáng)；RSM區(qū)突變體蛋白BtDHX36R63AI65A、BtDHX36Y69A和BtDHX36K76AN77AK78A的Kd值較大，分別為(71.4±0.5)，(75.8±0.2)和(62.7±0.4) nmol/L，表明其與底物的結(jié)合活性有所下降；OB域突變體BtDHX36Y862A結(jié)合該底物的Kd值最高，達(dá)到了(87.6±0.4) nmol/L，表明OB域位點(diǎn)Y862A突變的酶蛋白對(duì)底物結(jié)合活性有較明顯影響。說(shuō)明各突變位點(diǎn)均可降低酶蛋白與Telomere G4的結(jié)合活性。

2.4 野生型BtDHX36及其突變體解旋活性的比較

圖6結(jié)果顯示，野生型BtDHX36及其突變體對(duì)Telomere G4-16T均有解旋活性，但解旋比例存在差異，野生型蛋白、RSM區(qū)突變體BtDHX36K76AN77AK78A和OB域突變體BtDHX36Y862A的解旋比例接近80%，RSM區(qū)突變體BtDHX36R63AI65A和BtDHX36Y69A的解旋比例相對(duì)較低，分別為63%和51%。就解旋速率來(lái)講，野生型BtDHX36、OB域突變體BtDHX36Y862A和RSM區(qū)突變體BtDHX36K76AN77AK78A的解旋速率常數(shù)均在0.40～0.50 s-1，差異不明顯；RSM區(qū)突變體BtDHX36R63AI65A和BtDHX36Y69A的解旋速率在0.10～0.22 s-1，較野生型下降明顯，表明這些位點(diǎn)的突變嚴(yán)重影響了BtDHX36蛋白的解旋速率。從以上結(jié)果可以看出，OB域突變對(duì)蛋白解旋影響不大，但RSM區(qū)不同位點(diǎn)的突變能不同程度地影響蛋白解旋的比例和速率，其中RSM區(qū)位點(diǎn)R63AI65A突變與Y69A突變的酶蛋白既影響了解旋比例又影響了解旋速率，表明這些位點(diǎn)在Telomere G4-16T底物解旋方面發(fā)揮著重要作用。

A.與底物結(jié)合比例；B.與底物結(jié)合的Kd值A(chǔ).Binding fraction on Telomere G4 substrate;B.Kd value on substrate圖5 野生型BtDHX36及其突變體與Telomere G4底物結(jié)合活性的比較Fig.5 Comparison of wild-type BtDHX36 and its mutants with Telomere G4 substrates binding activity

A.解旋動(dòng)力學(xué)曲線；B.解旋速率常數(shù)A.Unbinding kinetic curves;B.Reaction rate constant圖6 野生型BtDHX36及其突變體蛋白對(duì)Telomere G4-16T解旋活性的比較Fig.6 Comparison of the unbinding activity of wild-type BtDHX36 and its mutant proteins on Telomere G4-16T

3 討 論

Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)，果蠅DHX36(DmDH-X36)的RSM區(qū)是特異性識(shí)別G4結(jié)構(gòu)的重要部位。Srinivansan等[30]研究表明，RSM區(qū)不僅起到與G4結(jié)構(gòu)親和的作用，而且還能促進(jìn)RNA雙鏈和RNA-G4結(jié)構(gòu)的重塑。BtDHX36與人類DHX36的序列同源性為91%，且研究表明，不同物種DHX36解旋酶的N端RSM區(qū)高度保守[31]，這說(shuō)明RSM區(qū)在不同物種間可能發(fā)揮相似的生物學(xué)功能，且這種功能是細(xì)胞生存所必需的。本試驗(yàn)比較了野生型BtDHX36與其突變體蛋白對(duì)Telomere G4-16T底物解旋活性的差異，發(fā)現(xiàn)相較于OB域氨基酸的突變，RSM區(qū)氨基酸突變對(duì)蛋白解旋Telomere G4-16T底物的影響更大，且RSM區(qū)位點(diǎn)R63AI65A突變與Y69A突變的酶蛋白均能在解旋比例和速率兩方面影響解旋活性。這預(yù)示著在生物體內(nèi)，BtDHX36解旋酶可能更傾向于在富含G4結(jié)構(gòu)的端粒附近發(fā)揮生物學(xué)功能，且N端的RSM區(qū)在這種功能中起著無(wú)可替代的作用。

FA是一種根據(jù)熒光偏振原理研究生物大分子和核酸互作的一種手段，該方法具有靈敏性高、檢測(cè)濃度低等優(yōu)點(diǎn)[32-33]。本研究采用FA法，首先確定了BtDHX36與16nt-ssDNA結(jié)合的最適條件為KCl 50 mmol/L、MgCl22 mmol/L、20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5、反應(yīng)溫度37 ℃；在此基礎(chǔ)上檢測(cè)了野生型BtDHX36及其突變體對(duì)Telomere G4底物的結(jié)合活性差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各突變體酶蛋白與Telomere G4的結(jié)合活性均低于野生型酶蛋白。FRET技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，能在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下對(duì)蛋白質(zhì)-核酸間相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)研究。本研究利用FRET技術(shù)分析了野生型BtDHX36及其突變體對(duì)Telomere G4-16T解旋活性的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OB域Y862A突變對(duì)酶蛋白的解旋活性無(wú)明顯影響，說(shuō)明該位點(diǎn)可能不直接參與BtDHX36對(duì)含有G4結(jié)構(gòu)底物的解旋活動(dòng)；RSM區(qū)R63AI65A和Y69A突變均對(duì)酶蛋白的解旋活性有明顯影響，降低了酶蛋白解旋含有G4結(jié)構(gòu)底物的比例和速率，說(shuō)明這2個(gè)位點(diǎn)是參與蛋白解旋G4結(jié)構(gòu)的重要位點(diǎn)。