高蛋白食品中雜環(huán)胺形成與控制的研究進展

席 俊，陳 陽，陳珍妮，姚利利，劉德果，史莉莉，李 潘，趙天培

河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001

熱傳遞是食品熱加工的重要目的，可以達到殺菌、熟化、提供獨特風味等效果，而高蛋白食品在熱加工過程中，會因蛋白質(zhì)的氧化、降解、聚集等產(chǎn)生許多危害物，包括晚期糖基化終末產(chǎn)物、丙烯酰胺、雜環(huán)胺等[1-2]。毒理學實驗表明雜環(huán)胺毒性遠超典型致癌物黃曲霉毒素B1、多環(huán)芳烴、亞硝酸鹽等[3-5]。目前從食品基質(zhì)中分離的雜環(huán)胺類物質(zhì)超過30種，在食品中廣泛存在，在經(jīng)高溫烹制的肉食制品中尤為顯著[6]。國際癌癥研究機構(gòu)IARC將12種雜環(huán)胺歸為2B組致癌物，將2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹啉(IQ)歸為2A組致癌物。雜環(huán)胺的致突變基礎機制已經(jīng)得到很好的表征，細胞色素P450酶將雜環(huán)胺轉(zhuǎn)化為羥胺，通過N-乙?；D(zhuǎn)移酶或磺基轉(zhuǎn)移酶再轉(zhuǎn)化為相應的酯[7-8]。這些酯可以自發(fā)水解，產(chǎn)生與DNA共價結(jié)合的反應芳基氮離子，雜環(huán)胺-DNA加合物易于發(fā)生移碼突變和點突變[9]。作者詳細探討了包括前提物在內(nèi)影響雜環(huán)胺生成的主要因素，提出使用熱處理植物基蛋白作為模擬體系，研究雜環(huán)胺生成與蛋白在高溫下反應的相關性，來探索蛋白食品中雜環(huán)胺生成機制及對應的抑制機理的設想，以期為后續(xù)研究雜環(huán)胺的生成及抑制提供新的思路。

1 雜環(huán)胺的種類

依據(jù)生成條件將雜環(huán)胺分為兩類[10-11]:氨基-咪唑-氮雜芳烴類雜環(huán)胺一般可在100～250 ℃之間形成，均有一個N-甲基-氨基咪唑主體，按結(jié)構(gòu)細分為喹喔啉類、喹啉類和吡啶類，結(jié)構(gòu)如表1所示；氨基咔啉類雜環(huán)胺按結(jié)構(gòu)細分為α-咔啉類、β-咔啉類、γ-咔啉類、δ-咔啉類，結(jié)構(gòu)如表2所示。

2 雜環(huán)胺形成的影響因素

2.1 前體物對雜環(huán)胺形成的影響

雜環(huán)胺的前體物包括氨基酸、還原糖、肌酸(酐)，且各前體物在不同雜環(huán)胺的形成過程中的參與程度也不盡相同。鄢嫣[10]的試驗研究表明，前體物在雜環(huán)胺生成前大量降解，肌酸的降解尤為顯著，與其需脫水生成肌酐有關，作為肌酸的水解產(chǎn)物，肌酐的含量則是先上升后下降。早期試驗發(fā)現(xiàn)單獨熱解色氨酸、谷氨酸、大豆蛋白等可產(chǎn)生雜環(huán)胺[12-13]，后續(xù)試驗發(fā)現(xiàn)在日常烹飪能夠達到的溫度下，苯丙氨酸、色氨酸和大豆蛋白等也可產(chǎn)生雜環(huán)胺[14-15]。肌酸(酐)通常存在于肌肉組織中，是多種雜環(huán)胺形成的前體物質(zhì)，尤其是對于IQ和IQx型雜環(huán)胺來說，肌酸(酐)參與了形成氨基咪唑環(huán)基團[16]。Skog等[17]在模擬體系中使用了14C標記的葡萄糖，并在產(chǎn)物MeIQx、4,8-DiMeIQx和IQx分子中檢測到標記的碳原子，因而證明了葡萄糖是這些雜環(huán)胺的前體物。Chen等[18]發(fā)現(xiàn)單獨加熱肌酐沒有檢測到雜環(huán)胺的生成，而在150 ℃及以上溫度加熱葡萄糖和肌酐則可以生成AαC、MeAαC。Gibis等[19]以10種動物肉為原料做成餡餅，研究了前體物與雜環(huán)胺生成的關系，發(fā)現(xiàn)賴氨酸與PhIP呈高度顯著相關(r=0.77，P<0.001)，酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等也與PhIP呈顯著正相關(r=0.47～0.56，P<0.05)，相比之下，4,8-DiMeIQx、Norharman和Harman與任何游離氨基酸水平均無顯著相關性；Norharman和Harman顯示為葡萄糖含量的函數(shù)；PhIP與總肌酸(酐)和葡萄糖的物質(zhì)的量比極顯著相關(r=0.87，P<0.001)，使用非線性回歸(r=0.497，P<0.001)比線性回歸(r=0.35，P<0.01)更好地描述了MeIQx中與總肌酸(酐)和葡萄糖的摩爾比關系。不同食物基質(zhì)含不同比例、含量的前體物[20-22]，在雜環(huán)胺生成的種類、含量上會有較大的差異[23]。

2.2 烹飪條件及食品基質(zhì)其余組分對雜環(huán)胺形成的影響

除了前體物的影響，食品中雜環(huán)胺的生成還受到烹飪溫度、時間和食品中其余組分如水分、脂肪、鐵含量等因素的影響。Ishak等[24]通過在多個溫度下利用模擬體系研究PhIP形成動力學發(fā)現(xiàn)：PhIP形成的溫度和時間變化之間存在顯著相互作用(P<0.05)；苯丙氨酸模型系統(tǒng)在150 ℃開始形成PhIP，隨著時間延長和溫度的升高，PhIP含量顯著增加(P<0.05)，直到240 ℃加熱8 min達到最高生成記錄，為21.41 μg/mL，而后隨加熱時間的延長含量逐漸下降。Chiu等[25]關于雜環(huán)胺熱穩(wěn)定性的研究認為是高溫導致了PhIP的分解。鄢嫣[10]通過主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn)，動力學曲線僅能分開直觀反映各種雜環(huán)胺的形成規(guī)律，而建立的PCA模型很好地驗證了高溫短時焙烤樣品與低溫長時焙烤樣品生成情況更加靠近；其中PhIP、4-OH′-PhIP、IQ[4,5-b]在250 ℃加熱30 min和225 ℃加熱35 min后含量開始下降。Lu等[26]通過使用植物油代替動物脂肪制作豬肉餡餅，發(fā)現(xiàn)植物油的類型會影響除IQ以外的雜環(huán)胺，并顯著影響總雜環(huán)胺含量(P<0.05)，同時對蛋白質(zhì)氧化的影響顯著(P=0.001)；總雜環(huán)胺含量和TBARS(r=0.826，P<0.01)、羰基蛋白(r=0.778，P<0.01)之間呈顯著正相關，進一步證實脂質(zhì)氧化和蛋白氧化均參與了雜環(huán)胺的形成。郭海濤等[27]發(fā)現(xiàn)脂肪含量的增加會顯著提高極性雜環(huán)胺的生成量(P<0.05)，而對非極性雜環(huán)胺含量則無顯著性影響。Lu等[23]的試驗證明，與雞肉相比，牛肉含有較高水平的非血紅素鐵，可以通過與羥基、過氧自由基發(fā)生反應來加速脂質(zhì)氧化和美拉德反應進程，使得在對照樣品中，牛肉丸的總雜環(huán)胺含量顯著高于雞肉丸(P<0.05)。因此，在不同報道中同種類食品雜環(huán)胺生成的差別，一定程度上受食品中其他組分的影響。

表1 氨基-咪唑-氮雜芳烴類雜環(huán)胺分類及理化性質(zhì)

食品中雜環(huán)胺以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在。Kataoka等[28]發(fā)現(xiàn)可以通過酸水解或酶解將PhIP從食品大分子化合物中釋放出來，通過加熱PhIP與白蛋白制備雜環(huán)胺與蛋白質(zhì)的結(jié)合物，認為結(jié)合態(tài)雜環(huán)胺是在游離態(tài)雜環(huán)胺產(chǎn)生的基礎上再與蛋白結(jié)合，后續(xù)在干熱模型體系中發(fā)現(xiàn)PhIP-甘氨酸、IQ-甘氨酸、MeIQx-甘氨酸和Trp-P-1-甘氨酸加合物可在200 ℃加熱10 min產(chǎn)生，過程如圖1所示，其中PhIP-甘氨酸加合物最佳形成條件為200 ℃加熱5 min，且加合物可在200 ℃下穩(wěn)定保持至少20 min[29]。Chen等[30]發(fā)現(xiàn)在較低溫度(小于200 ℃)時結(jié)合態(tài)雜環(huán)胺的種類比游離態(tài)雜環(huán)胺多；存在4種單一形式存在的雜環(huán)胺，6種以兩種形式存在的雜環(huán)胺；因Harman、Norharman的主要貢獻使得結(jié)合態(tài)雜環(huán)胺含量遠遠高于游離態(tài)雜環(huán)胺，而Harman、Norharman則是廣泛存在于各類食品中的兩類雜環(huán)胺[31]，意味著在以往未區(qū)分雜環(huán)胺存在狀態(tài)的研究中，高蛋白食品中雜環(huán)胺的實際含量比檢測所得含量要高。

表2 氨基咔啉類雜環(huán)胺的分類及其理化性質(zhì)

圖1 PhIP與氨基酸加合物的形成[29]

3 雜環(huán)胺的抑制

3.1 新型加熱方式對雜環(huán)胺產(chǎn)生的影響

過高的熱加工溫度和熱處理時間的延長會不可避免地造成雜環(huán)胺含量的升高，但隨著新型加熱方式如微波加熱、紅外加熱、過熱蒸汽加熱等方式的逐漸普及，研究顯示新型加熱方式使得雜環(huán)胺含量低于傳統(tǒng)的加熱方式。Suleman等[32]對比了炭烤、紅外燒烤和過熱蒸汽燒烤對羊肉餅加工過程中雜環(huán)胺的生成情況發(fā)現(xiàn)：炭烤組中存在9種極性雜環(huán)胺，總量為555.58 ng/g，紅外燒烤存在7種極性雜環(huán)胺，總量為181.48 ng/g，過熱蒸汽燒烤存在7種極性雜環(huán)胺，總量為30.67 ng/g；炭烤組中非極性雜環(huán)胺總量為426.06 ng/g，紅外燒烤中非極性雜環(huán)胺總量為148.59 ng/g，過熱蒸汽燒烤中非極性雜環(huán)胺總量為89.65 ng/g。值得注意的是，紅外燒烤相對于炭烤和過熱蒸汽燒烤極性雜環(huán)胺中引入了MeIQ，含量達到11.66 ng/g；而在非極性雜環(huán)胺方面，炭烤獨有AαC，含量達到16.88 ng/g，過熱蒸汽燒烤獨有MeAαC，含量達到7.32 ng/g。Yao等[33]使用了3種木炭進行炭烤雞腿，并與電燒烤、煤氣燒烤進行了對比，其中，煤氣燒烤雜環(huán)胺總量最高達30.38 ng/g，電燒烤雜環(huán)胺總量最低為12.43 ng/g。李利潔[34]利用模擬體系研究PhIP的生成規(guī)律發(fā)現(xiàn)：相對于傳導密封加熱最高生成量約2.45 ng/mL，使用微波回流加熱和傳導回流加熱所生成的PhIP含量明顯偏低，其中微波回流加熱含量不到0.1 ng/mL。

3.2 添加外源物及食品加熱前預處理對雜環(huán)胺的影響

自由基反應對雜環(huán)胺的形成起著重要作用[35]，因此，預期抗氧化劑的加入能減少高蛋白食品中雜環(huán)胺的形成，但以往的報道存在與預期相反的情況。許多研究人員認為具有抗氧化特性的物質(zhì)的抗氧化或促氧化作用可能因其結(jié)構(gòu)、濃度、使用方法以及其余底物影響，而對雜環(huán)胺的抑制具有不同的表現(xiàn)。Mehr等[36]研究了肉豆蔻精油、生姜精油及其納米乳液對烤牛肉餅中雜環(huán)胺的影響，試驗中使用DPPH清除率評價了外源添加物的抗氧化能力，使用Minitab?19進行相關性分析(圖2)，r值變化范圍0.936～0.986，顯示DPPH清除率與雜環(huán)胺抑制率有較好的正相關性。但Nuray等[37]在研究中發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，具有抗氧化能力的洋蔥水提取物的使用導致了總雜環(huán)胺含量的增加。Salazar等[38]通過研究25種黃酮類化合物對PhIP的抑制作用時發(fā)現(xiàn)，芳香環(huán)位有兩個羥基的酚類是最有效的抑制劑，烷基或羧基作為芳環(huán)中額外取代基存在會減弱多酚物對PhIP的抑制作用，引入額外羥基和氨基很大程度抵消了多酚的抑制作用，在趙磊等[39]的研究中同樣印證了這一觀點。鄢嫣[10]使用大豆分離蛋白、組織蛋白、淀粉等肉制品中常用配料研究對雜環(huán)胺形成的影響，發(fā)現(xiàn)這些配料的添加會促進雜環(huán)胺的生成，推測與蛋白高溫加熱后產(chǎn)生的游離氨基酸和羰基化合物有關，而當添加量達到10%時雜環(huán)胺含量開始降低，這與添加物的物理阻隔效應，限制雜環(huán)胺前體物的轉(zhuǎn)移、接觸有關。

圖2 DPPH清除率與雜環(huán)胺抑制率相關性分析

Mehr等[36]將牛肉餅凍存90 d，然后加熱檢測雜環(huán)胺，發(fā)現(xiàn)隨凍藏時間的延長，雜環(huán)胺的生成量逐漸下降，認為是凍藏減少了水分含量(P<0.05)，從而限制了雜環(huán)胺前體物向食品表面的遷移，使得雜環(huán)胺生成量減少。張昆[22]在研究凍藏對肉制品雜環(huán)胺生成情況的影響時，重點研究了多次凍融對雜環(huán)胺生成的影響，試驗發(fā)現(xiàn)豬肉、牛肉和雞肉在多次凍融后結(jié)合態(tài)雜環(huán)胺含量都明顯增加(P<0.05)，推測與反復凍融導致的脂質(zhì)、蛋白的氧化有關。

4 以熱處理蛋白為模擬體系研究雜環(huán)胺的生成及抑制機理

熱加工食品中蛋白含量、氧化程度、降解程度等往往和雜環(huán)胺的形成呈現(xiàn)相關性，但以蛋白為目標物系統(tǒng)研究雜環(huán)胺生成機理方面的研究比較少。隨著科技發(fā)展和食品工業(yè)的變革，尋找肉類替代品解決肉制品供給不足、肉類相關的道德和環(huán)境問題成為一種可能，在零售和食品服務領域的全球食品市場中，肉類模擬食品行業(yè)正在迅速發(fā)展。目前的人造肉包含植物蛋白肉和細胞培養(yǎng)肉兩個方面，其中植物蛋白產(chǎn)品已在蛋白質(zhì)食品領域中占據(jù)一席之地，更容易被消費者接受[40]。植物蛋白肉的主要來源是大豆蛋白和小麥面筋蛋白，基于大豆蛋白的食品在加熱情況下會有雜環(huán)胺的生成[31,41-42]，因此未來對植物肉安全性方面的研究亟待加強[43]。本實驗室在早先研究中發(fā)現(xiàn)干熱大豆分離蛋白中含有多種雜環(huán)胺(圖3)，因此以蛋白為氨基酸的提供源，代替以往氨基酸-還原糖-肌酸(酐)模擬體系，研究蛋白制品雜環(huán)胺的生成機理更為合理。

注：4個圖的縱軸均表示強度/%。

雜環(huán)胺的生成直接受氨基酸含量、羰基化合物、自由基反應的影響，而蛋白在熱處理過程中發(fā)生的系列復雜反應會影響上述雜環(huán)胺生成條件。利用共價交聯(lián)形成多酚-蛋白復合物來穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)，提高蛋白抗氧化性，改善熱處理過程游離氨基酸釋放等方面的研究，對蛋白食品中抗氧化劑的加入對雜環(huán)胺生成抑制機理的解釋提供了很好的參考依據(jù)。氨基酸側(cè)鏈氧化是蛋白羰基形成的主要途徑，并且是唯一被證實肉蛋白中羰基的形成機制[44]，羰基含量與總巰基、自由氨基極顯著負相關(P<0.01)[45]。為了減少具有一定毒性的人工合成抗氧化劑的使用[46]，天然抗氧劑在食品中的應用得到廣泛研究。多酚是廣泛存在于植物體內(nèi)具有抗菌、抗氧化、提高機體免疫力等多種生物活性的一大類天然產(chǎn)物，在食品中作為食品添加劑的應用也十分廣泛。在蛋白體系中，多酚可以通過共價作用和非共價作用與蛋白結(jié)合改變蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。桑葚多酚可以提高豬肉干加工貯藏過程中蛋白氧化穩(wěn)定性[47]，低濃度綠原酸即可抑制羰基的生成，抑制蛋白氧化[48]，Utrera等[49]的研究則顯示天然抗氧化劑對肌原纖維蛋白羰基的影響受到多酚濃度、氧化條件、蛋白質(zhì)靶標的影響。在植物蛋白方面，焦銘[50]的研究發(fā)現(xiàn)兒茶素-蛋白相互作用提高氧化蛋白消化后的營養(yǎng)特性，釋放了更多的游離氨基酸。姜麗君[51]發(fā)現(xiàn)單寧可以結(jié)合小麥面筋蛋白上的自由氨基，與張慧蕓等[52]在多酚-肌原蛋白方面的結(jié)果互相印證，表明多酚-蛋白作用機理在動物源蛋白和植物源蛋白方面具有共性，對雜環(huán)胺的產(chǎn)生具有潛在影響，但尚未有相關研究報道。

5 展望

研究高蛋白制品中雜環(huán)胺產(chǎn)生和抑制機理多使用真實食品熱處理和氨基酸-還原糖-肌酸(酐)模擬體系，對雜環(huán)胺產(chǎn)生抑制方面的研究，除考慮引入新型健康加熱方式外，多集中于研究添加天然抗氧化劑如富含多酚、黃酮類物質(zhì)后對食物中雜環(huán)胺生成量的影響，但目前在雜環(huán)胺生成、抑制機理上研究解釋仍有不足。真實食品熱處理的結(jié)果在不同文獻中有所出入，而使用現(xiàn)有的模擬體系推導所得結(jié)論不能很好地應用于真實食品中，因此，開發(fā)既接近真實食品基質(zhì)，又能避免無關反應影響的模擬體系更有助于雜環(huán)胺抑制研究的實際應用。隨食品工業(yè)的快速發(fā)展，植物肉或在不久的未來進入快速發(fā)展，意味著更多類型高蛋白食品被研發(fā)制造出來，持續(xù)加大對蛋白食品中雜環(huán)胺的產(chǎn)生及抑制研究將有利于食品工業(yè)的健康發(fā)展。