黃體生成素受體對(duì)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞增殖分化的影響

汪富林?夏凱?馮鑫?莊錦濤?周明寬?廖武源?雷振明?項(xiàng)鵬?鄧春華?涂響安

【摘要】目的 探討黃體生成素受體（LHCGR）對(duì)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞（SLC）增殖及分化能力的影響。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）及免疫熒光染色比較LHCGR-/-小鼠與LHCGR+/+小鼠睪丸內(nèi)SLC標(biāo)志物的表達(dá)情況。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選出SLC，進(jìn)行5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）及CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)。同時(shí)誘導(dǎo)SLC向睪丸間質(zhì)細(xì)胞（LC）分化，14 d后檢測(cè)上清液睪酮水平。qRT-PCR及免疫熒光檢測(cè)誘導(dǎo)分化后LC標(biāo)志物表達(dá)水平。結(jié)果 LHCGR-/-小鼠睪丸內(nèi)存在SLC，應(yīng)用CD51標(biāo)記并通過(guò)流式分選可獲得SLC。LHCGR-/-小鼠SLC EdU+細(xì)胞比例和CCK-8增殖曲線與LHCGR+/+小鼠比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。LHCGR-/-小鼠SLC誘導(dǎo)分化后培養(yǎng)基上清液睪酮平均水平僅為0.01 ng/ml，低于LHCGR+/+對(duì)照組的2.71 ng/ml

（P < 0.001），其誘導(dǎo)分化后細(xì)胞LC標(biāo)記物的表達(dá)也低于LHCGR+/+小鼠（P均< 0.001）。結(jié)論 敲除LHCGR基因后，睪丸內(nèi)存在SLC且能維持正常的增殖活性，但是分化為L(zhǎng)C受阻。

【關(guān)鍵詞】黃體生成素受體;睪丸間質(zhì)干細(xì)胞;增殖分化;睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育不良

Effect of luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor on the proliferation and differentiation of stem Leydig cells Wang Fulin， Xia Kai， Feng Xin， Zhuang Jintao， Zhou Mingkuan， Liao Wuyuan， Lei

Zhenming， Xiang Peng， Deng Chunhua， Tu Xiangan. Department of Urology and Andrology， the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China

Corresponding author， Tu Xiangan， E-mail： tuxiangan@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To evaluate the effect of luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor （LHCGR） on the proliferation and differentiation of stem Leydig cells （SLCs）. Methods The expression levels of SLC markers in the testes between the LHCGR-/- and LHCGR+/+ mice were statistically compared by quantitative RT-PCR （qRT-PCR） and immunofluorescent staining. The CD51+ SLCs were sorted by flow cytometry and then subject to 5-ethynyl-2-deoxyuridine （EdU） and CCK8 assay. The SLCs were induced to differentiate into the testicular Leydig cells （LCs）. The testosterone level in the supernatant was detected after 14 d. The expression levels of LC markers after induced differentiation were quantitatively measured by qRT-PCR and immunofluorescent staining. Results SLCs were found in the testis of LHCGR-/- mice and these cells could be sorted by CD51 labeling and flow cytometry. The proportion of EdU+ cells and CCK-8 proliferation curve did not significantly differ between the LHCGR-/- and LHCGR+/+ SLCs （both P > 0.05）. After the induced differentiation of LHCGR-/- SLCs， the average testosterone concentration in the culture supernatant was 0.01 ng/ml， significantly lower than 2.71 ng/ml in the LHCGR+/+ mice （P < 0.001）. The expression levels of LC markers in the LHCGR-/- mice were significantly lower compared with those in the LHCGR+/+ mice （all P < 0.001）. Conclusion After LHCGR knockout， SLCs exist in the testis of LHCGR-/- mice and maintain normal proliferative activity. Nevertheless， the differentiation from SLCs into LCs is suppressed.

【Key words】Luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor;Stem Leydig cell;

Proliferation and differentiation;Leydig cell hypoplasia

黃體生成素受體（LHCGR）失活型突變是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病。男性患者可表現(xiàn)為小陰莖，尿道下裂甚至外生殖器完全女性化，嚴(yán)重影響男性性征發(fā)育、損害男性生育功能，給患者及家庭帶來(lái)嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)[1]。其主要的發(fā)病機(jī)制是LHCGR失活引起睪丸間質(zhì)細(xì)胞（LC）發(fā)育不良，導(dǎo)致睪酮合成不足，繼而引起生精阻滯[2]。目前臨床上睪酮替代療法對(duì)生育力的改善極其有限，而且長(zhǎng)期激素替代會(huì)抑制精子產(chǎn)生[3-4]。針對(duì)該類患者，迫切需要新療法以恢復(fù)睪酮水平及重建生育力。

睪丸間質(zhì)干細(xì)胞（SLC）是LC的前體細(xì)胞，能夠通過(guò)增殖及分化過(guò)程轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C[5]。筆者團(tuán)隊(duì)所進(jìn)行的前期研究顯示，自體SLC移植能夠恢復(fù)老年食蟹猴的睪酮水平、促進(jìn)精子發(fā)生，是睪酮缺乏相關(guān)疾病的理想治療方法[6]。另一方面，干細(xì)胞介導(dǎo)的基因修復(fù)在治療基因突變型疾病中發(fā)揮重要作用，如基因編輯后造血干細(xì)胞移植已經(jīng)被歐盟批準(zhǔn)用于治療β-珠蛋白生成障礙性貧血以及重癥聯(lián)合免疫缺陷病[7-8]。上述研究提示，經(jīng)基因修復(fù)自體的SLC可能是治療LHCGR缺陷疾病的理想的種子細(xì)胞;但是LHCGR基因突變后，睪丸內(nèi)是否存在SLC及其增殖和分化能力如何，筆者尚未見有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究探究LHCGR敲除后，小鼠睪丸內(nèi)SLC數(shù)量和增殖分化能力的變化，以探討自體SLC移植治療該類患者的可行性。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

LHCGR+/-小鼠由雷振明教授惠贈(zèng)，由LHCGR+/-小鼠繁育得到LHCGR-/-以及LHCGR+/+小鼠。分別選用7 ～ 14 d齡、體質(zhì)量（5±2）g的LHCGR-/-以及LHCGR+/+雄性小鼠各10只;21 d齡（青春期）且體質(zhì)量（10±2）g、56 d齡（成年期）且體質(zhì)量（22±2）g的LHCGR-/-以及LHCGR+/+雄性小鼠各5只[9]。小鼠飼養(yǎng)在12 h光照/黑暗交替、溫度22～24 ℃、濕度50%～70%的SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境，自由采食、飲水。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理均符合中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理規(guī)范，動(dòng)物倫理審批號(hào)為2020-003。

二、主要試劑

包括：TritonX-100（Sigma-Aldrich公司），DMEM/ F12培養(yǎng)基、牛血清白蛋白（BSA）、DAPI、防熒光淬滅劑（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），4%多聚甲醛（Phygene公司），OCT冷凍包埋劑（Sakura公司）;鼠抗Nestin（Arigo公司），兔抗血小板源性生長(zhǎng)因子α（PDGFRα，Abcam公司），兔抗類固醇生成因子-1（SF-1）、鼠抗LHCGR（Novusbio公司），兔抗類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（STAR）、兔抗胰島素樣因子3（INSL3，Cell signaling Technology公司），鼠抗CD51-PE（R&D公司），羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG（Invitrogen公司）。

三、方 法

1. 小鼠SLC原代細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

無(wú)菌條件下分離小鼠雙側(cè)睪丸，剝離睪丸白膜，加入消化液，置于37 ℃搖床中以100轉(zhuǎn)/分消化15 min，然后用DMEM/F12終止消化，過(guò)濾，1100轉(zhuǎn)/分離心4 min，棄上清。使用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸并經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾后，1100轉(zhuǎn)/分離心4 min，棄上清。加入適量的1%BSA重懸細(xì)胞，分為染色組及同型對(duì)照組;染色組中按照1∶50的比例加入鼠抗CD51-PE，對(duì)照組加入相應(yīng)的同型對(duì)照，常溫避光孵育20 min，加入PBS洗滌多余的抗體，1100轉(zhuǎn)/分離心4 min，棄上清。將細(xì)胞沉淀用PBS重懸至流式上樣管中，通過(guò)MoFloAstrios EQs流式細(xì)胞分選儀獲得SLC，SLC于前述報(bào)道SLC培養(yǎng)基中培養(yǎng)[10]。分選獲得的細(xì)胞記為P0，以后每傳一代細(xì)胞記為Pn。

2. 免疫熒光染色

使用LHCGR-/-以及同窩的LHCGR+/+雄性小鼠睪丸，置于4%多聚甲醛中浸泡2 h，換高糖（30%）浸泡過(guò)夜，然后用OCT包埋睪丸，冰切機(jī)切成10 μm厚組織于載玻片上。組織染色時(shí)取組織切片于56 ℃烤箱中孵育15 min后，用PBS洗3次。0.2%Triton穿透15 min后，PBS洗1遍，10%山羊血清、2%BSA于PBS中封閉45 min，加一抗孵育過(guò)夜;PBS洗5次，加相應(yīng)的二抗孵育45 min后，PBS洗5次。滴加DAPI，PBS洗2次。使用防熒光淬滅劑封片。用LSM800或Leica DMi8拍照。細(xì)胞染色時(shí)，取培養(yǎng)好的細(xì)胞，PBS清洗1次;甲醛固定15 min后PBS洗2次。0.2%Triton穿透

15 min，后續(xù)步驟同組織切片染色。

3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

為了探究LHCGR敲除之后，睪丸內(nèi)是否還存在SLC。首先通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了青春期及成年期小鼠睪丸組織SLC標(biāo)記物CD51、巢蛋白（Nestin）、PDGFRα以及無(wú)芒相關(guān)同源異型盒基因（ARX）的表達(dá)水平[5， 11-14]。從睪丸組織或細(xì)胞中抽提RNA。RNA濃度及純度由紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 1000）測(cè)定。使用模板DNA合成試劑盒（Novoprotein）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR程序按照廠家推薦的方案進(jìn)行，使用羅氏LightCycle 480 qRT-PCR儀檢測(cè)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物合成序列見表1。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)△Ct計(jì)算靶基因表達(dá)水平，并以相對(duì)表達(dá)量的形式報(bào)告結(jié)果。每組測(cè)量3個(gè)樣品，每個(gè)樣品均重復(fù)測(cè)量3次后取平均值。

4. 睪丸SLC增殖能力檢測(cè)

取P2代的LHCGR-/-及LHCGR+/+小鼠SLC用于增殖實(shí)驗(yàn)。5-乙炔基-2-脫氧尿苷（EdU）增殖實(shí)驗(yàn)具體步驟為：將P2代SLC消化之后，種植于24孔板中，種植密度為105個(gè)/孔。培養(yǎng)箱中過(guò)夜后，用培養(yǎng)基將EdU稀釋至2倍工作液，半量換液加入到孔中2 h后染色，染色按照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行。用Leica DMi8顯微鏡進(jìn)行拍照，每組設(shè)8孔，每孔隨機(jī)取3個(gè)視野計(jì)算EdU+細(xì)胞比例平均值。細(xì)胞CCK-8實(shí)驗(yàn)按標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行：將細(xì)胞種植在96孔板中，種植細(xì)胞量為2×103

個(gè)/孔。待細(xì)胞貼壁后，連續(xù)5 d用Infinite F200 Pro酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度并記錄。每組設(shè)20孔，重復(fù)測(cè)量3次吸光度值后取平均值。

5. 睪丸SLC分化能力檢測(cè)

睪丸SLC分化液的配制和先前報(bào)道的類似[15]。具體為：DMEM/F12培養(yǎng)基中加入2%胎牛血清、10 ng/ml黃體生成素（LH）、1 nmol/L甲狀腺激素、1 ng/ml白血病抑制因子、10 ng/ml血小板源性生長(zhǎng)因子AA、50 ng/ml胰島素樣生長(zhǎng)因子1和1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒。將P2代SLC傳至6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%左右時(shí)，半換液加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。每2 d換液，誘導(dǎo)14 d后，取24 h上清液用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)睪酮（金域公司），每組測(cè)量6孔。誘導(dǎo)分化后細(xì)胞qRT-PCR及免疫熒光檢測(cè)如前所述。每組測(cè)量3個(gè)樣品，每個(gè)樣品均重復(fù)測(cè)量3次后取平均值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用GraphPad Prism 8.2.1制圖，使用SPSS 25.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、LHCGR-/-小鼠睪丸內(nèi)存在SLC

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，青春期LHCGR-/-小鼠SLC標(biāo)記物表達(dá)水平與LHCGR+/+小鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（CD51 t = 0.392、P = 0.714，Nestin t = 0.009、P = 0.993，PDGFRα t = 0.594、P = 0.584，ARX t = 1.185、P = 0.301），見圖1A。成年期LHCGR-/-小鼠睪丸內(nèi)SLC數(shù)量比青春期時(shí)減少，但LHCGR-/-小鼠SLC標(biāo)記物ARX、Nestin表達(dá)高于LHCGR+/+小鼠（ARX t = 3.196、P = 0.033，Nestin t = 3.947、P = 0.017），CD51、PDGFRα表達(dá)呈升高趨勢(shì)但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（CD51 t = 2.326、P = 0.081，PDGFRα t = 1.968、P = 0.120），見圖1A。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，無(wú)論是青春期還是成年期的 LHCGR-/-小鼠，SLC標(biāo)記物Nestin和PDGFRα的表達(dá)均高于LHCGR+/+小鼠（青春期Nestin t = 9.865、P < 0.001，PDGFRα t = 14.640、P < 0.001;成年期Nestin t = 21.170、

P < 0.001，PDGFRα t = 4.176、P = 0.006），見圖1B～E。

二、LHCGR-/-小鼠SLC的分離及鑒定

通過(guò)用SLC特異性標(biāo)記物CD51的流式抗體，從LHCGR-/-小鼠中分離出一群CD51+的細(xì)胞，見圖2A;分選下來(lái)的細(xì)胞在鏡下呈典型的長(zhǎng)梭形的干細(xì)胞形態(tài)，見圖2B。進(jìn)一步對(duì)SLC的純度進(jìn)行了鑒定。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)Nestin、PDGFRα的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)99.0%的CD51+細(xì)胞表達(dá)Nestin，93.1%的CD51+細(xì)胞表達(dá)PDGFRα，進(jìn)一步證實(shí)了LHCGR-/-小鼠分選獲得的細(xì)胞為高純度的SLC，見圖2C、D。

三、LHCGR-/-小鼠SLC的增殖能力分析

P2代LHCGR-/-小鼠SLC與EdU共孵育2 h后，其EdU+細(xì)胞比例為14.57%;與LHCGR+/+小鼠（陽(yáng)性細(xì)胞比例為14.63%）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 0.025，P = 0.980），見圖3A、B。SLC與CCK-8共孵育1 h后，2組SLC的吸光度值均隨時(shí)間升高，且LHCGR-/-小鼠與LHCGR+/+小鼠CCK-8增殖曲線比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F處理=0.331，P = 0.569;F時(shí)間=33.015，P < 0.001;F交互=0.143，P = 0.966），見圖3C。

四、LHCGR-/-小鼠SLC分化成LC受阻

使用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)小鼠SLC分化后14 d，LHCGR+/+小鼠細(xì)胞培養(yǎng)基中睪酮平均水平達(dá)2.71 ng/ml，與之相對(duì)應(yīng)的分化后LHCGR-/-小鼠細(xì)胞培養(yǎng)基中睪酮平均水平僅為0.01 ng/ml （t = 6.768，P < 0.001），提示LHCGR-/-小鼠SLC不能分化為具有產(chǎn)睪酮能力的LC，見圖4A。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LHCGR-/-小鼠SLC經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后LC標(biāo)記物STAR、SF-1、INSL3的mRNA表達(dá)低于LHCGR+/+小鼠（STAR t = 26.847、P < 0.001，SF-1 t = 36.956、P < 0.001，INSL3 t = 27.823，P < 0.001），見圖4B。免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示，LHCGR-/-小鼠SLC誘導(dǎo)分化后不表達(dá)LHCGR、STAR、SF-1、INSL3等LC標(biāo)志蛋白，進(jìn)一步提示LHCGR-/-小鼠SLC分化受阻，見圖4C。

討論

人LHCGR位于2號(hào)染色體短臂上，具有12個(gè)外顯子，其編碼的蛋白是具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白耦聯(lián)受體。LHCGR失活型突變是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病。目前已有多例報(bào)道LHCGR失活型突變引起的男性性腺發(fā)育不良[16-18]。其主要的發(fā)病機(jī)制是LC發(fā)育不良導(dǎo)致睪酮合成不足[2]。Lei等（2004年）利用超生理劑量（4 ～ 8倍生理劑量）的睪酮可以部分重建LHCGR-/-小鼠生育力。但是超生理劑量的睪酮會(huì)引起睪丸變小、抑制生精、情緒改變、頭痛等不良反應(yīng)，無(wú)法應(yīng)用于臨床[3]。SLC是LC的前體細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)SLC移植能恢復(fù)衰老以及損傷引起的睪酮低下小鼠模型的睪酮水平[6]。Lo等（2004年）也發(fā)現(xiàn)睪丸側(cè)群細(xì)胞移植可以恢復(fù)LHCGR-/-小鼠的睪酮水平以及改善生精功能。但是異體的SLC移植可能會(huì)引起免疫排斥，阻礙細(xì)胞療法的臨床轉(zhuǎn)化。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，自體SLC移植可恢復(fù)衰老食蟹猴的睪酮水平，減輕睪酮缺乏相關(guān)癥狀[6]。因此針對(duì)LHCGR失活型突變來(lái)說(shuō)，自體SLC移植可能是潛在的解決方案。而LHCGR失活型突變個(gè)體中是否存在SLC及其增殖和分化能力如何，筆者尚未見有相關(guān)報(bào)道。

本研究通過(guò)檢測(cè)睪丸內(nèi)SLC標(biāo)記物mRNA及蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示LHCGR-/-小鼠睪丸內(nèi)存在SLC，且與LHCGR+/+小鼠相比，成年時(shí)睪丸中SLC比例更高，這可能與生精細(xì)胞比例較低有關(guān)。本研究進(jìn)一步根據(jù)既往文獻(xiàn)使用CD51作為標(biāo)志物，通過(guò)流式細(xì)胞分選技術(shù)獲得了SLC[19]。結(jié)果顯示，原代SLC呈典型的長(zhǎng)梭形的干細(xì)胞形態(tài)。盡管Chen等[20]報(bào)道成年小鼠CD51強(qiáng)陽(yáng)性的細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，但是本研究分離獲得SLC的小鼠日齡為7 ～ 14 d，相對(duì)而言，巨噬細(xì)胞含量較少，流式細(xì)胞分選也并未看到明顯的分群。另外，本研究的免疫熒光染色結(jié)果顯示，99.0%的CD51+的細(xì)胞表達(dá)SLC標(biāo)記物Nestin，進(jìn)一步提示分選后細(xì)胞為高純度的SLC。

增殖和分化是干細(xì)胞最重要的特性。本研究顯示，LHCGR-/-小鼠SLC具有正常的增殖能力，但是不能分化為具有產(chǎn)睪酮能力的LC，提示LHCGR失活型突變會(huì)引起SLC分化受阻。與之相對(duì)應(yīng)地，文獻(xiàn)報(bào)道LHCGR-/-小鼠和LHCGR失活型突變患者睪丸內(nèi)僅有極少數(shù)發(fā)育不良的睪丸間質(zhì)細(xì)胞[9]。但是目前尚不清楚LHCGR突變之后引起SLC分化受阻的原因?？赡芘cSLC細(xì)胞分化需要LH的刺激，而LHCGR突變之后，細(xì)胞喪失了對(duì)LH的反應(yīng)性有關(guān)。LH作用于LHCGR可激活下游信號(hào)分子環(huán)磷酸腺苷，因此直接的環(huán)磷酸腺苷刺激能否促進(jìn)LHCGR-/-小鼠SLC分化仍待進(jìn)一步研究闡明。

總之，LHCGR基因敲除小鼠睪丸內(nèi)存在SLC，且能使用CD51標(biāo)記細(xì)胞通過(guò)流式分選出該群細(xì)胞。該類小鼠的SLC增殖能力正常，但是不能分化為具有產(chǎn)睪酮能力的LC。提示直接的SLC自體移植可能不適用于該類患者，文獻(xiàn)報(bào)道LHCGR突變往往是由點(diǎn)突變引起，通過(guò)基因編輯體外修復(fù)SLC后移植可能是該類疾病的解決方案[21]。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-03-08）

（本文編輯：林燕薇）