高慧芳,許佳音,孟 婷,陳金紹,邱君志,張重義,張燎原
(1. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;2. 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科,福建 廈門 361022;3. 廈門中藥廠有限公司,福建 廈門 361002;4. 福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院,福建 福州 350002)
【研究意義】太子參(Pseudostellaria heterophylla)別名孩兒參、童參,為石竹科多年生草本植物,以根部入藥,具有抗疲勞、抗衰老、調(diào)脾虛體倦等功效[1]。太子參以福建省柘榮縣栽培歷史最為悠久,其品質(zhì)優(yōu)良,年產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量的60%,素有“中國(guó)太子參之鄉(xiāng)”的美譽(yù),并于1987年列為太子參的最佳生長(zhǎng)適宜區(qū)、中國(guó)太子參生產(chǎn)基地[2]。近年來(lái),太子參醫(yī)藥價(jià)值開發(fā)日益深入,其原藥材的需求量迅速增加,價(jià)格不斷攀升,給太子參產(chǎn)業(yè)化發(fā)展帶來(lái)重要機(jī)遇。但由于太子參在栽培過(guò)程中存在的連作障礙問(wèn)題,嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)[3?4]。太子參連作障礙主要表現(xiàn)為塊根重下降、分根數(shù)減少特別是地下部位不能正常膨大,從而不能形成具有商品價(jià)值的塊根?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】前期研究發(fā)現(xiàn),土壤肥力、植物根系分泌物和根際微生物種群的失衡,是導(dǎo)致太子參連作障礙的主要原因[5]。而根系分泌物介導(dǎo)的根際微生物種群失衡,尤其是病原微生物的增多,成為太子參連作效應(yīng)發(fā)生的重要原因[6?8]。微生物與土壤生態(tài)功能是相輔相成、息息相關(guān)的,并且跟植物之間有著緊密關(guān)聯(lián)。微生物群落的組成及其多樣性是衡量土壤性質(zhì)和功能的一個(gè)重要指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)[9],太子參連作及菌肥處理會(huì)顯著影響太子參根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)與功能多樣性,推測(cè)微生態(tài)結(jié)構(gòu)失衡是導(dǎo)致太子參連作效應(yīng)形成的根本原因。而不同產(chǎn)地的太子參根際土壤微生物的含量及群落結(jié)構(gòu)存在較大差異性[10]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】柘榮縣由于特殊的地理位置,不同太子參種植地土壤性質(zhì)、氣候環(huán)境、海拔等因素有所差別,但栽培過(guò)程中都存在不同程度的連作問(wèn)題。不同的栽培過(guò)程是否導(dǎo)致菌群結(jié)構(gòu)的變化,存在哪些共性和差異性,這些共性是否是引起連作問(wèn)題、病害增多的原因。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究基于高通量測(cè)序技術(shù),研究柘榮縣5個(gè)不同樣地太子參根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性,并分析土壤pH值和主要化學(xué)性質(zhì)及太子參根系分泌物酚酸類物質(zhì)對(duì)其的影響,以期揭示太子參栽培過(guò)程中病害形成存在的共性及差異性問(wèn)題,為科學(xué)種植太子參并提高其產(chǎn)量及品質(zhì)提供理論依據(jù)。
福建省寧德市柘榮縣,地理位置為N27°05′~N27°19′,E119°43′~E120°04′,屬于亞熱帶季風(fēng)氣候,溫和濕潤(rùn),年平均氣溫15.5 ℃,雨量充沛,年平均降水量為1 600~2 400 mm,平均相對(duì)濕度約為85.00%,雨日多雨區(qū)廣,11~2月少雨,3~6月多雨[2],為 太子參提供良好的種植條件。
于2018年6月25日進(jìn)行柘榮縣太子參根際土壤的采集:選擇植株健壯的太子參,除去表層土壤,找到植物根系,輕輕抖落根系上的土壤于無(wú)菌采集袋中,做好采樣記錄。將每個(gè)樣地的太子參根際土壤取5組混為1個(gè)樣品,每處樣地設(shè)3次重復(fù),分別進(jìn)行理化性質(zhì)的測(cè)定、根系分泌物的檢測(cè)和土壤宏基因組DNA的提取。5個(gè)樣地序號(hào)為:Ⅰ(英山鄉(xiāng)油麻厝村);Ⅱ(東源鄉(xiāng)鴛鴦?lì)^村);Ⅲ(東源鄉(xiāng)綢嶺村);Ⅳ(東源鄉(xiāng)東源村);Ⅴ(乍洋鄉(xiāng)束劉厝村)。5個(gè)樣地的地形為中山丘陵,成土母質(zhì)為坡積母 質(zhì),質(zhì)地是中壤類型[11],詳細(xì)信息如表1所示。
以提取的宏基因組DNA為模板,分別擴(kuò)增真菌ITS1區(qū)和細(xì)菌16S rDNA V3~V4區(qū),基于Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序,測(cè)序工作由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。根據(jù)測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù),進(jìn)行質(zhì)量控制,采用PEAR(Paired-End reAd mergeR,version 0.9.6)和Vsearch(version 2.3.4)軟件過(guò)濾原始的測(cè)序數(shù)據(jù),得到有效序列(Valid_Data),并將有效序列在大于97.00%相似性條件下進(jìn)行聚類OTU(Operational Taxonomic Units,操作分類單元),通過(guò)RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋,并得到每個(gè)物種在該樣品中的豐度。利用QIIME軟件計(jì)算樣品中的Alpha多樣性值和Beta多樣性值,并進(jìn)行聚類分析。計(jì)算差異種群兩兩間的Spearman秩相關(guān)系數(shù),借助Gephi(Version 0.9.2)軟件構(gòu)建差異種群共變化網(wǎng)絡(luò),進(jìn)一步探究差 異種群間的相互關(guān)系。
測(cè)定采集土樣的理化性質(zhì),土壤pH值采用電位計(jì)法(水土質(zhì)量比2.5∶1);土壤有機(jī)質(zhì)(Organic Matter,OM)采用外加熱重鉻酸鉀氧化-容量法;土壤全氮(total nitrogen, TN)采用碳氮元素分析儀(VARIO MAX, 德國(guó)ELEMENTAR)測(cè)定[12];土壤銨態(tài)氮(ammonium nitrogen, NH4+)采用靛酚藍(lán)比色法;土壤全磷(total phosphorus, TP)采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法;土壤有效磷(available phosphorus, AP)采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法;土壤全鉀(total potassium, TK)采用堿熔-火焰光度法;土壤速效鉀(available potassium, AK)采用乙酸銨浸提-火焰光度法[13]。
表 1 太子參根際土壤樣品信息Table 1 Information on soils sampled from rhizosphere of P. heterophylla habitats
土壤中有效態(tài)銅、有效態(tài)鋅和有效態(tài)鐵用0.10%HCl浸提,土壤中有效態(tài)錳采用醋酸銨浸提法,并使用電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS,NexION 300X,PerkinElmer)測(cè)定[14]。條件參數(shù):功率為1 300 W,等離子氣流量為13.00 L·min?1,輔助氣流速為1.40 L·min?1,氦氣流量為5.20 L·min?1,氫氣流速為5.80 L ·min?1,采用深度為7.80 mm,重復(fù)采樣3次。
土樣的前期處理參考吳丹等[15]的相關(guān)方法,樣品旋蒸后用甲醇定容至5 mL后用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。9種常見(jiàn)酚酸為對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸及肉桂酸,溶解于甲醇作為標(biāo)品進(jìn)行HPLC檢測(cè)。前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的色譜條件:色譜柱(SunFire C18 5 μm,4.6 mm×250 mm Column),流動(dòng)相A為0.1%磷酸,流動(dòng)相B為甲醇,0~6 min(A:73.00%;B:27.00%),6~22 min(A:50.00%;B:50.00%)檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,進(jìn)樣量10 μL,柱溫30℃。儀器為Waters e2695-Model C ode 998。
采用Excel 2016和SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素(one-way ANOVA)方差分析和Duncan法多重比較分析(a=0.05)。采用Adobe Photoshop CS6軟件作 圖。采用Canoco 5軟件進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)(CCA)分析。
5個(gè)樣地的太子參根際土壤經(jīng)測(cè)序后共得到744 331條真菌基因優(yōu)化序列,按照97.00%序列相似性基礎(chǔ),可劃分為1 314個(gè)真菌分類單元(OTU):14門(Phylum),44綱(Class),87目(Order),157科(Family),275屬(Genus),396種(Species);共得到1 032 029條細(xì)菌基因優(yōu)化序列,按照97.00%序列相似性劃分10 310個(gè)細(xì)菌分類單元(OTU):38門(Phylum),101 綱(Class),160 目(Order),263科(Family),484屬(Genus),554種(Species)。如圖1-A和1-B所示,真菌和細(xì)菌的OTU豐度存在不同程度的差異。1-A所示,5組之間只有Ⅰ組和Ⅱ組真菌OTU豐度呈顯著差異性;1-B所示,Ⅳ組的細(xì)菌OTU豐度最高;Ⅲ組的細(xì)菌OTU豐度最低,與Ⅰ、Ⅱ組的細(xì)菌OTU豐度有顯著差異性;而Ⅲ組和Ⅳ組的細(xì)菌OTU豐度呈極顯著差異。不同樣地的真菌OTU豐度與細(xì)菌OTU相比,5組之間的細(xì)菌OTU豐度呈現(xiàn)更明顯的差異性。說(shuō)明不同栽培地對(duì)太子參根際土壤細(xì)菌的影響大于對(duì)其真菌的影響,且太子參根際土壤微生物以細(xì)菌為主。
通過(guò)對(duì)韋恩圖中各樣品特有的或共有的真菌OTU數(shù)進(jìn)行分析,如圖1-C所示,5個(gè)樣地的樣品中真菌共有OTU數(shù)達(dá)到264個(gè)。其中,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ4組的共有真菌OTU為99,說(shuō)明這4組的真菌群落結(jié)構(gòu)相似性高;Ⅰ、Ⅱ 和Ⅳ三者共有的真菌OTU為40,說(shuō)明這3組的真菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高;Ⅲ和Ⅳ這兩者的共有真菌OTU為64,說(shuō)明這2組的真菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ特有真菌OTU分別為31、22、121、45、72,分別占其OTU總數(shù)的4.03%、3.12%、16.31%、5.45%、9.36%。而5個(gè)樣地共有真菌OTU數(shù)均高于其他的隨機(jī)組合共有真菌OTU,表明不同樣地的微生物物種相近。
從圖1-D可以看出,5個(gè)樣地土壤細(xì)菌共有OTU數(shù)為2 044;Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ四組的共有細(xì)菌OTU為2 109,說(shuō)明這4組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性高;Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ三者共有的細(xì)菌OTU為873,說(shuō)明這3組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高;Ⅰ和Ⅳ這兩者的共有細(xì)菌OTU為250,說(shuō)明這2組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ特有細(xì)菌OTU分別為140、49、396、311、161,分別占各太子參細(xì)菌OTU總數(shù)的1.87%、0.66%、8.68%、3.81%、2.37%。
從圖1綜合分析,單個(gè)樣地的OTU數(shù)均不同,其中單個(gè)樣地的OTU數(shù)Ⅲ為最多(真菌121個(gè),細(xì)菌396個(gè)),Ⅱ最少(真菌22個(gè),細(xì)菌49個(gè)),說(shuō)明不同樣地太子參根際土壤中各自特有的微生物不同,存在差異性;而5個(gè)樣地的共有OTU數(shù)明顯多于特有的數(shù)量,說(shuō)明5個(gè)樣地的根際土壤微生物組成 趨勢(shì)相似。
圖 1 真菌和細(xì)菌的OTU豐度及韋恩圖(AB:箱線圖;CD:韋恩圖)Fig. 1 OTU richness and Venn diagrams on fungi and bacteria in rhizosphere soil (AB: Box-plot; CD: Venn diagrams)
比較5個(gè)樣地太子參根際土壤微生物群落的α多樣性,其中Observed-species指數(shù)、Chao1指數(shù)越高,說(shuō)明物種多樣性越好,物種越豐富;Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)越高,說(shuō)明物種豐富度和均勻度越好。如表2所示,結(jié)果發(fā)現(xiàn),太子參根際土壤細(xì)菌群落的Observed-species指數(shù)和Chao1指數(shù)呈明顯的差異性。其中Ⅳ、Ⅱ土壤中細(xì)菌有著較高的Observed_species指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù),說(shuō)明樣地Ⅳ、Ⅱ土壤的細(xì)菌群落豐富度和多樣性高于其他3個(gè)樣地;Ⅲ土壤的多樣性指數(shù)均呈現(xiàn)較低值,說(shuō)明此樣地土壤菌群豐富度和多樣性較低??傊訁⒏H土壤中細(xì)菌群落多樣性呈現(xiàn)趨勢(shì)為:Ⅳ>Ⅱ>Ⅰ>Ⅴ>Ⅲ,5個(gè)樣地太子參根際土壤的細(xì)菌群落豐富度及均勻性存在顯著差異,而真菌群落差異不明顯。
主坐標(biāo)分析圖上點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離越近,說(shuō)明樣品之間的微生物群落差異越小。由圖2可以看出,真菌第一軸的解釋量為27.25%,第二軸的解釋量為13.95%,第一、二兩軸的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到41.20%;細(xì)菌第一軸的解釋量為38.67%,第二軸的解釋量為12.80%,第一、二兩軸的累積貢獻(xiàn)率達(dá)51.47%,可以較為全面反映樣本信息。圖2-A中,其中Ⅳ、Ⅰ、Ⅱ之間的點(diǎn)距離較近,說(shuō)明3個(gè)樣地的微生物群落構(gòu)成相似。而Ⅲ、Ⅴ的3個(gè)點(diǎn)與其他樣地的點(diǎn)之間距離較遠(yuǎn),說(shuō)明Ⅲ、Ⅴ與其他樣地的微生物群落構(gòu)成差異較大。從圖中可以看出,無(wú)論是真菌或者細(xì)菌群落,Ⅳ、Ⅰ、Ⅱ這3個(gè)樣地之間距離較近,說(shuō)明每組內(nèi)的群落構(gòu)成相似性較高;而Ⅲ與其他樣地距離較遠(yuǎn),說(shuō)明該樣地的微生物群落與其他樣地的微生物群落構(gòu)成相似性較低。
基于Unifrac距離矩陣進(jìn)行UPGMA聚類分析,如圖3所示,將5組樣品劃分為2個(gè)類群。第一類群包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ四組樣品,說(shuō)明這4個(gè)樣地太子參根際土壤微生物群落相似性較高;第二類為Ⅲ樣地樣品,與第一類樣品整體距離較遠(yuǎn),說(shuō)明Ⅲ樣地樣品與其他4組樣地太子參根際土壤微生物群 落差異較大。
表 2 樣品α多樣性指數(shù)Table 2 α diversity indices on 5 rhizosphere soil samples at P. heterophylla habitats
圖 2 主坐標(biāo)分析太子參根際土壤真菌和細(xì)菌群落差異Fig. 2 Principal coordinates analysis on fungi and bacteria communities in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats
為了反映太子參根際土壤微生物群落組成的相似性和差異性,對(duì)OTU進(jìn)行物種分類后首先在“門”分類等級(jí)對(duì)5個(gè)樣地的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。如圖4-A所示,聚類后OTU對(duì)應(yīng)的真菌類群涉及子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、被孢菌門(Mortierellomycota)、毛霉門(Mucoromycota)、類原生動(dòng)物門(Rozellomybota)、球囊菌門(Glomeromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、芽枝菌門(Blastocladiomycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)、Aphelidiomycota、捕 蟲 菌 門(Zoopagomycota),一個(gè)門未被鑒定unidentified,一個(gè)門未被分類fungi_unclassitied。其中子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)在5個(gè)樣地的含量都很高;子囊菌門(Ascomycota)在Ⅴ根際土壤中的含量為最高,在Ⅲ根際土壤中含量較低;擔(dān)子菌門(Basidiomycota)在Ⅲ根際土壤中的含量為最高,在Ⅴ根際土壤中含量較低;接合菌門(Zygomycota)在 Ⅰ 根際土壤中含量為最高,在Ⅴ根際土壤中的含量較低,說(shuō)明不同樣地的微生物群落豐度存在差異。
圖 3 UPGMA 聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of UPGMA
圖 4 太子參根際土壤優(yōu)勢(shì)微生物群落組成Fig. 4 Compositions of dominant microbial communities in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats
如圖4-B所示,在細(xì)菌“門”的分類水平上,5個(gè)樣地太子參根際土壤在細(xì)菌菌落的組成上并無(wú)較大差別,且在細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度上差異也較小。在5個(gè)樣地的太子參根際土壤中有6個(gè)“門”的細(xì)菌菌群分布最多:變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、后壁菌門(Firmicutes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)。其中變形菌門(Proteobacteria)在5個(gè)樣地的豐度最高,并在Ⅲ的太子參根際土壤中含量占據(jù)首位。酸桿菌門(Acidobacteria)在5個(gè)樣地的豐度有所差異,其中在Ⅳ和Ⅱ的太子參根際土壤中含量相似且豐度較高,在Ⅲ土壤中的含量為最少。而放線菌門(Actinobacteria)在Ⅲ土壤中含量最高,在Ⅳ和Ⅱ的土壤中含量相對(duì)較低。綠彎菌門(Chloroflexi)和后壁菌門(Firmicutes)在5個(gè)樣地的土壤中含量基本持平??偟膩?lái)說(shuō),在“門”分類水平上,5個(gè)樣地的優(yōu)勢(shì)菌群保持一致,說(shuō)明在“門”水平,太子參根際土壤微生物群落組成具有相似性。
豐度熱圖是對(duì)豐度最高的前20種物種分類信息進(jìn)行相似性聚類,比較在不同樣地之間“屬”的含量差異,從圖4-C中可以看出,正青霉屬(Eupenicillium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、柄孢殼屬(Podospora)、被孢霉菌屬(Mortierella)、田頭菇屬(Agrocybe)在樣地Ⅰ中豐度較高,腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Ascomycota_unclassified、肉座菌屬(Hypocrea)在樣地Ⅴ中豐度較高,粉褶蕈屬(Entoloma)在樣地Ⅱ豐度較高,雙擔(dān)菌屬(Geminibasidium)、瘦臍菇屬(Rickenella)在樣地Ⅲ中豐度較高,赤霉屬(Gibberella)、毛殼菌屬(Chaetomium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、捷別爾達(dá)孢屬(Teberdinia)在Ⅳ中豐度較高。由此可見(jiàn),同一菌屬在不同樣地的豐度存在差異性。如圖4-D所示,同一細(xì)菌物種在不同樣地間的豐度亦存在差異,如Gp2、Gp3在樣地Ⅳ中豐度較高,芽單孢菌屬(Gemmatimonas)在樣地Ⅱ中豐度較高,但是它們?cè)谄渌麡拥刂胸S度均較低;對(duì)各樣品進(jìn)行聚類發(fā)現(xiàn),Ⅱ和Ⅳ為一類,此結(jié)果與細(xì)菌群落組成及分布圖一致。
表3展示的是不同樣地間太子參根際土壤真菌群落中前20種優(yōu)勢(shì)分類單元及其相對(duì)豐度??梢钥闯?,Ⅰ樣地的優(yōu)勢(shì)“屬”是被孢霉屬(Mortierella)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、柄孢殼屬(Podospora)等;Ⅱ樣地的優(yōu)勢(shì)“屬”是被孢霉屬(Mortierella)、粉褶蕈屬(Entoloma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)等;Ⅲ樣地的優(yōu)勢(shì)“屬”是瘦臍菇屬(Rickenella)、雙擔(dān)菌屬(Geminibasidium)、被孢霉屬(Mortierella)等;Ⅳ樣地的優(yōu)勢(shì)“屬”是被孢霉屬(Mortierella)、赤霉屬(Gibberella)、捷別爾達(dá)孢屬(Teberdinia)等;Ⅴ樣地的優(yōu)勢(shì)“屬”是腐質(zhì)霉屬(Humicola)、被孢霉屬(Mortierella)等??傮w來(lái)看,不同樣地的優(yōu)勢(shì)“屬”不同,同種“屬”在不同樣地間的豐度不同,但差異不明顯,說(shuō)明不同樣地的太子參根際土壤的微生物真菌群落趨于一致。
如表4所示,在細(xì)菌“屬”水平,可能是測(cè)序原因(由于微生物種類繁多,加之受到測(cè)序讀長(zhǎng)的顯示,所以在實(shí)際分析過(guò)程中,并非所有的OTU代表序列都能獲得“屬”水平的分類學(xué)信息),在前20個(gè)優(yōu)勢(shì)屬中,只鑒定得到7種,它們?yōu)樗釛U菌(Gp1、Gp2、Gp3),羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、纖線桿菌屬(Ktedonobacter)、勒氏菌屬(Gaiella);將每個(gè)菌屬在不同樣地進(jìn)行比較可以看出,芽單胞菌屬(Gemmatimonas)在Ⅱ的含量多于其他樣地;羅河桿菌屬(Rhodanobacter)在Ⅲ的含量明顯多于其他樣地;酸桿菌(Gp1)在5個(gè)樣地的含量均較高,而酸桿菌(Gp2、Gp3)在Ⅳ的含量高于其他4個(gè)樣地;纖線桿菌屬(Ktedonobacter)在Ⅴ、Ⅰ的含量較高,在Ⅲ的含量較低。同種“屬”在不同樣地間的豐度不同,結(jié)果表明,5個(gè)樣地的微生物菌屬豐度存在差異性,說(shuō)明不同樣地太子參根際 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)不同。
從表5看出,不同樣地太子參根際土壤化學(xué)性質(zhì)均存在差異性。太子參根際土壤偏酸性,pH值為4.8~5.3。在Ⅱ和Ⅴ2個(gè)樣地,土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全鉀含量均較高;在樣地Ⅲ中全磷、速效鉀含量最高,而有機(jī)質(zhì)、全鉀指標(biāo)與其他4個(gè)樣地相比含量較低。從表6得出,有效態(tài)微量元素在樣地Ⅲ中的含量均較低。其中:有效態(tài)錳在Ⅳ中含量最高,為23.14 mg·kg?1;有效態(tài)銅、有效態(tài)鐵在Ⅰ中含量最高,分別為4.18 mg·kg?1和151.94 mg·kg?1;有效態(tài)鋅在Ⅱ中含量最高,為13.19 mg·kg?1;其中有效態(tài)錳和有效態(tài)銅含量不同樣地差異顯著。表明不同樣地太子參根際土壤化學(xué)性質(zhì)存在差異性,說(shuō)明不同樣地太子參的種植會(huì)對(duì)太子參根際土壤的化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響。
表 3 不同樣地太子參根際土壤真菌群落中前20種優(yōu)勢(shì)分類單元及其相對(duì)豐度Table 3 Top 20 dominant taxa and their relative abundance of fungi community in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats
如表7、8所示,5個(gè)樣地太子參根系分泌物中均含有對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸和肉桂酸。其中,5個(gè)樣地中對(duì)香豆酸、安息香酸、丁香酸的總含量高于其他6種,肉桂酸的含量最低;丁香酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)香豆酸、香蘭素在5個(gè)樣地中含量差異明顯??傊环铀嵩诓煌瑯拥睾坎煌?,同一樣地的不同酚酸含量也存在差異性。說(shuō)明不同樣地太子參根系分泌物中酚酸種類相同,但含量會(huì)有 所差異。
網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜微生物群落的探究中。以上研究表明:不同樣地太子參根際土壤的微生物菌屬分布及豐度差異顯著。為進(jìn)一步探究太子參根際微生態(tài)環(huán)境中微生物間的相互作用,本研究通過(guò)對(duì)差異菌屬兩兩間相關(guān)系數(shù)的計(jì)算,構(gòu)建共變化網(wǎng)絡(luò)(圖5),在真菌菌屬共變化網(wǎng)絡(luò)中,核心菌屬是捷別爾達(dá)孢屬(Teberdinia)、稻曲菌屬(Villosiclava);在細(xì)菌的共變化網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中,核心菌屬是酸桿菌(Gp1、Gp3)和羅思河小桿菌屬( Rhodanobacter)。
選取真菌的前3優(yōu)勢(shì)“門”-子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)和細(xì)菌的前4優(yōu)勢(shì)“門”-變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi),探討太子參根際土壤微生物豐度、根際土壤化學(xué)性質(zhì)及酚酸類物質(zhì)的典范對(duì)應(yīng)分析。如圖6-A、6-B所示,子囊菌門(Ascomycota)豐度與根際土壤大部分化學(xué)性質(zhì)、酚酸物質(zhì)呈正相關(guān)關(guān)系,與全磷、有效磷、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;而擔(dān)子菌門(Basidiomycota)豐度與大部分根際土壤化學(xué)性質(zhì)、酚酸物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,與全磷、有效磷、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸呈正相關(guān)關(guān)系;接合菌門(Zygomycota)豐度與有效態(tài)銅、銨態(tài)氮、對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、安息香酸呈正相關(guān)關(guān)系。圖6-C和6-D所示,放線菌門(Actinobacteria)豐度與速效鉀、全磷呈正相關(guān)關(guān)系,與酚酸物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;綠彎菌門(Chloroflexi)豐度與有效態(tài)鐵、對(duì)羥基苯甲酸呈正相關(guān)關(guān)系;變形菌門(Proteobacteria)豐度與銨態(tài)氮、有效磷、水楊酸呈正相關(guān)關(guān)系;酸桿菌門(Acidobacteria)豐度與根際土壤大部分化學(xué)性質(zhì)和酚酸物質(zhì)呈正相關(guān)關(guān)系,與全磷、有效磷、速效鉀、水楊酸呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。典范對(duì)應(yīng)分析表明太子根際土壤微生物群落分布受土壤理化性質(zhì)及酚酸類物質(zhì)的影響,說(shuō)明太子參土壤化學(xué)性質(zhì)及酚酸類物質(zhì)參與了根際微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的演變。
表 4 不同樣地太子參根際土壤細(xì)菌群落中前20種優(yōu)勢(shì)分類單元及其相對(duì)豐度Table 4 Top 20 dominant taxa and their relative abundance of bacteria community in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats
表 5 不同樣地太子參根際土壤化學(xué)性質(zhì)Table 5 Chemical properties of rhizosphere soil from P. heterophylla habitats
表 6 不同樣地太子參根際土壤中有效態(tài)微量元素的含量Table 6 Content of available trace elements in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats
表 7 不同樣地太子參根系分泌物酚酸的含量Table 7 Content of phenolic acids in root exudates of P. heterophylla at different locations
表 8 不同樣地太子參根系分泌物酚酸的含量Table 8 Content of phenolic acids in root exudates of P. heterophylla at different locations
圖 5 太子參根際差異微生物共變化網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 5 Co-occurrent network of microorganisms in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats
圖 6 太子參根際土壤微生物群落分布、化學(xué)性質(zhì)和酚酸物質(zhì)的典范對(duì)應(yīng)分析Fig. 6 Canonical correspondence analysis on community distribution, chemical properties and phenolic acids in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats
許多作物都存在連作效應(yīng),尤以藥用植物表現(xiàn)最為突出,約占70.00%的以根部入藥的藥用植物存在不同程度的連作效應(yīng),如太子參、澤瀉、三七、地黃等均存在嚴(yán)重的連作效應(yīng)問(wèn)題[16]。根際是土壤與植物根系之間緊密結(jié)合的環(huán)境,同時(shí)也是土壤-根系-微生物三者緊密結(jié)合、相互影響的場(chǎng)所[17]。鄒立思[10]等研究發(fā)現(xiàn),太子參根際土壤微生物以細(xì)菌為主,還包含放線菌及真菌,這與本研究不同樣地太子參根際土壤的細(xì)菌數(shù)目明顯多于真菌結(jié)論一致。5個(gè)樣地的優(yōu)勢(shì)屬中的鐮刀菌屬(Fusarium)和赤霉屬(Gibberella)為常見(jiàn)的真菌致病菌。在藥用植物中,鐮刀菌成為主要的致病菌對(duì)象[18]。薛彩云等[19]研究發(fā)現(xiàn),鐮刀菌屬對(duì)二年生的五味子造成嚴(yán)重的莖基腐病病害,會(huì)在生產(chǎn)上造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。劉西莉等[20]研究發(fā)現(xiàn),鐮刀菌可引起嚴(yán)重的根腐病,直接影響麻黃的產(chǎn)量和品質(zhì)。Chen等[21]、Wu等[22]研究發(fā)現(xiàn),連作太子參根際土壤隨著連作年限增加,致病菌鐮刀菌數(shù)量增高,酚酸混合物可促進(jìn)鐮刀菌菌絲和孢子生長(zhǎng)。說(shuō)明鐮刀菌屬是引起太子參連作效應(yīng)的一類致病真菌。如表3所示,5個(gè)地區(qū)均含有鐮刀菌屬,但每個(gè)地區(qū)的鐮刀菌豐度有所差別,其中Ⅳ樣地的鐮刀菌豐度最高,其后依次為Ⅱ、Ⅰ、Ⅴ,Ⅲ樣地的鐮刀菌豐度最低,且每個(gè)樣地的鐮刀菌含量與其根際土壤其他微生物物種數(shù)呈反比,暗示鐮刀菌影響太子參根際土壤其他微生物物種數(shù)組成,響應(yīng)太子參的連作效應(yīng)。赤霉菌屬是玉米、水稻和小麥等禾本科植株的主要致病真菌,可導(dǎo)致作物嚴(yán)重減產(chǎn)[23]。目前太子參的連作過(guò)程中關(guān)于赤霉菌的研究較少,對(duì)引起太子參連作效應(yīng)的致病真菌應(yīng)引起關(guān)注。被孢霉屬(Mortierella)和腐質(zhì)霉屬(Humicola)是一種常見(jiàn)的腐生真菌。稻曲菌屬(Villosiclava)可侵染水稻小穗引起穗部病害[24]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5個(gè)樣地的差異性真菌屬為毛殼菌屬(Chaetomium)、捷 別 爾 達(dá) 孢 屬(Teberdinia)、Sordariales_unclassified、田頭菇屬(Agrocybe)、稻曲菌屬(Villosiclava)等。而在真菌菌屬共變化網(wǎng)絡(luò)中,核心菌屬是捷別爾達(dá)孢屬(Teberdinia)、稻曲菌屬(Villosiclava)。說(shuō)明差異菌屬在太子參根際微生態(tài)環(huán)境中起到一定的作用。5個(gè)樣地太子參根際土壤細(xì)菌群落在“屬”分類水平的前20種優(yōu)勢(shì)菌屬中,酸桿菌門的酸桿菌(Gp1、Gp2、Gp3),可以降解植物殘?bào)w多聚物,參與鐵循環(huán)和光合作用等,是具有促進(jìn)作用潛力的一類菌[25]。芽單孢菌屬(Gemmatimonas)參與固氮過(guò)程[26]。
植物根際微生物的群落構(gòu)建受到根系分泌物、土壤化學(xué)性質(zhì)等的影響[27]?;ㄉ捣置谖镏械谋郊姿嵩黾恿烁H土壤中伯克霍氏菌的相對(duì)豐度[28]。Wu等[29]研究發(fā)現(xiàn),太子參根系分泌物酚酸和有機(jī)酸等物質(zhì)對(duì)于其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有重要影響。本研究中5個(gè)樣地的太子參根際土壤微生物群落分布與根際土壤化學(xué)性質(zhì)、根系分泌物酚酸類物質(zhì)都有一定的相關(guān)性。有研究表明,黏質(zhì)沙雷氏菌可對(duì)太子參組培苗產(chǎn)生致害作用,導(dǎo)致根部腐爛和葉片枯萎[30];太子參根系分泌物酚酸類物質(zhì)促進(jìn)微生物病原菌黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)生長(zhǎng)并使其成為優(yōu)勢(shì)菌[31?32]。而此次的測(cè)序結(jié)果中并未檢測(cè)到黏質(zhì)沙雷氏菌,這可能與不同地區(qū)的太子參根際土壤微生物存在差異有關(guān)。
綜上所述,植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性對(duì)植物的健康生長(zhǎng)有著極其重要的作用。本文通過(guò)研究柘榮縣5個(gè)樣地的太子參根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性,發(fā)現(xiàn)不同樣地微生物群落結(jié)構(gòu)及組成豐度存在共性及差異性,暗示真菌致病菌鐮刀菌屬等影響太子參根際土壤微生物結(jié)構(gòu)組成及豐度多樣性。同時(shí),太子參根際土壤微生物群落分布受到根際土壤化學(xué)性質(zhì)及根系分泌物酚酸類物質(zhì)的影響,暗示太子參土壤連作效應(yīng)很可能歸因于根系分泌物參與調(diào)控根際微生物菌群結(jié)構(gòu)和多樣性演變,導(dǎo)致病原菌增多。所得結(jié)果為后續(xù)連作太子參根際土壤微生物群落分布、太子參連作效應(yīng)及相關(guān)根際致病菌的研究奠定了一定的工作基礎(chǔ)。