根皮素對脂多糖誘導的RAW264.7細胞的體外抗炎作用機制

李 潭 孫一涵 李國峰 （長春中醫(yī)藥大學，長春130117）

炎癥是機體在受到各種炎癥因子的刺激和損傷后產生的一種防御反應，能使這些炎癥因子失活和清除，并為組織修復創(chuàng)造環(huán)境。但炎癥也是許多疾病的癥狀或并發(fā)癥。病毒、細菌為誘發(fā)炎癥的主要介質，物理、化學、創(chuàng)傷及其他刺激亦會對其產生影響［1-2］。RAW264.7巨噬細胞是啟動體內炎癥介質產生的中樞細胞［3］。在調節(jié)炎癥反應方面，其中心細胞是激活的巨噬細胞，也是許多炎癥因子的主要來源［4］。大量研究表明，中藥單體（天然化合物）對RAW264.7巨噬細胞具有較好的抑制作用［5］。以LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞為靶點，通過中藥單體（天然化合物）的抗炎及促炎機制，可進一步了解炎癥反應的作用機制，找到有效的防治措施［6］。

根皮素是一種果皮的天然提取物，主要來源于梨皮，石榴皮等果皮，這些果皮本身就具有瀉火燥濕、消腫的功效，現代藥理研究證實根皮素具有抗癌、抗結核和抗菌活性，但其抗炎的具體機制尚不明確［7-10］。中藥單體能通過多途徑、多靶點整合起效防治炎癥的進展。根皮素能否調控RAW264.7巨噬細胞表現出抗炎效果，國內外尚未見相關文獻報道。本文以LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞為研究靶點，運用ELISA、Western blot、實時熒光定量PCR、免疫熒光等方法觀察根皮素對炎癥的作用機制，為臨床應用根皮素防治各種炎癥性疾病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 RAW264.7細胞購自美國克拉克生物科學公司，并穩(wěn)定傳代4次；根皮素（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%）；DMEM、胎牛血清（克拉克生物科學公司，美國）；胰蛋白酶（eBioscience公司，美國）；TRIzo（lInvitrogen公司，美國）；DMSO（百靈威科技有限公司，中國北京）；Taq酶逆轉錄試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、NP40蛋白裂解液、CCK-8檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，中國上海）；Tween-20、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、HRP標記的二抗（碧云天）；COX-2、iNOS、p-IκBα、IκBα、p-NF-κBP65、NF-κB P65、p-Akt、Akt、p-P38、P38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、β-Tubulin一抗（圣克魯斯生物技術公司，美國）；ELISA試劑盒、ECL超敏發(fā)光液（阿普利根生物技術研究所，中國北京）；免疫固定液、DAPI（北京生物技術公司，中國北京）；山羊抗兔二抗（圣克魯斯生物技術公司，美國）；電泳儀（百晶生物技術有限公司，中國）；酶標儀、實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；熒光顯微鏡（蘇州曼威斯光學儀器有限公司，中國）；高壓滅菌鍋（Systec公司，德國）；低溫離心機（Sigma公司，德國）；實驗用烘箱（普斯特檢測設備公司，東莞）；標準恒溫搖床（丙林電子科技公司，上海）；pH計（中儀物聯(lián)技術公司，武漢）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 DMSO配制根皮素原液，濃度為12 mg/ml，加入培養(yǎng)基依次稀釋至實驗所需濃度，即分別取原液10μl，加5 990μl培養(yǎng)基，原液10μl，加3 990μl培養(yǎng)基，原液10μl，加2 990μl培養(yǎng)基，稀釋至20、30和40μg/ml。藥液中DMSO的總含量均不高于0.5%。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 從液氮中取出RAW264.7巨噬細胞迅速復蘇后，將其加入胎牛血清：DMEM=1：9的完全培養(yǎng)基中，并置于恒溫CO2培養(yǎng)箱，待細胞完全貼壁且生長至80%時，胰酶消化，然后以1：3比例傳代培養(yǎng)，待細胞完全貼壁且生長至80%時用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞分組及干預 將細胞分為正常組、模型組（LPS組）、根皮素低、中、高劑量組（根皮素20、30、40μg/ml組），除正常組外均構建炎癥模型，即在含根皮素藥物干預前，將完全培養(yǎng)基吸出，加入不含胎牛血清（非完全培養(yǎng)基）的培養(yǎng)基進行24 h的饑餓處理，之后每個皿加入2μl LPS，培養(yǎng)箱中孵育4 h，密切觀察細胞形態(tài)。

1.2.4 CCK-8法檢測RAW264.7的細胞活性 在CCK-8實驗中，經3次傳代，待細胞穩(wěn)定后，將6×103個細胞用移液器加入96孔板（200μ/l孔），保證每孔細胞均勻，數量基本相同。將細胞恒溫培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱，當其增長到80%時，將完全培養(yǎng)基吸出，加入非完全培養(yǎng)基，200μ/l孔培養(yǎng)3 h，然后用不同濃度的根皮素（1、5、10、20、40、60、80、100μg/ml）處理細胞并孵育4 h，加入20μl CCK-8后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，酶標儀測量450 nm處吸光度A。

1.2.5 ELISA測定細胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β含量 分組同前，培養(yǎng)至細胞密度達80%后，吸出完全培養(yǎng)基，加入非完全培養(yǎng)基饑餓細胞，24 h后在根皮素低、中、高濃度組中分別加入相應濃度的根皮素藥液，培養(yǎng)4 h后在除正常組之外的其余各組分別加入2μl 1μg/ml的LPS，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，然后將培養(yǎng)皿中的上清液移入EP管中備用。將上清液分別加入96孔板中后檢測相關基因表達。

1.2.6 RT-PCR檢測RAW264.7細胞中COX-2、iN‐OS、TNF-α、IL-1β、IL-6等的表達 TRIzol試劑提取細胞總RNA，在primescript?第一鏈cDNA合成試劑盒的作用下，將總RNA反轉錄成cDNA，以β-actin為內參。在cfx96系統(tǒng)中，進行基因表達的PCR分析。95℃ 變性15 s，60℃ 退火40 s，72℃ 延伸15 s，擴增40個周期。采用2-ΔΔCt法分析。引物序列如表1。

1.2.7 Western blot測定根皮素作用于RAW264.7細胞后相關蛋白的表達 將RAW264.7巨噬細胞置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2 d。當細胞增長至培養(yǎng)皿低壁80%時，用非完全培養(yǎng)基代替完全培養(yǎng)基，饑餓細胞24 h，加入相應濃度的根皮素，4 h后加入LPS，3 h后收集細胞，加入NP40裂解液，冰上裂解20 min，BCA試劑盒測蛋白濃度。將NP40、十二烷基硫酸鈉（5×SDS）、蛋白樣品按計算值加入EP管，沸水中煮5 min后，加入15μl樣品于12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，轉移至PVDF膜，室溫下用5%脫脂乳TBST膜孵育2 h。將膜置于COX-2（1：1 000）、iNOS（1：1 000）、p-IκBα（1：2 000）、IκBα（1：2 000）、p-NF-κB P65（1：3 000）、NF-κB P65（1：2 000）、p-Akt（1：3 000）、Akt（1：3 000）、p-P38（1：1 000）、P38（1：1 000）、p-ERK1/2（1：2 000）、ERK1/2（1：2 000）、p-JNK1/2（1：1 500）、JNK1/2（1：1 500）和β-Tubulin（1：3 000）抗體中，4°C過夜，TBST中洗滌5次（10 min/次），然后在含山羊抗兔（1：3 000）或山羊抗鼠（1：3 000）二級抗體的5%的脫脂乳中孵育1 h，然后在TBST中再次洗滌5次，10 min/次，在暗室用ECL超敏發(fā)光液觀察條帶。

1.2.8 免疫熒光法檢測NF-κB P65在RAW264.7細胞中的核移位 將玻片放入濃硫酸中浸泡24 h，取出后流水沖洗30次，放入無水乙醇中浸泡4 h，蒸餾水沖洗10次，烘干后高壓滅菌，160℃烘箱3 h烤干，放入超凈臺備用。將玻片置于24孔板，事先準備好含有細胞懸液的培養(yǎng)基加入24孔板中爬片。待細胞完全貼壁且增長至40%～50%時吸出完全培養(yǎng)基，并加入非完全培養(yǎng)基饑餓細胞24 h，之后將除正常組外的每孔加入0.5μl的LPS繼續(xù)培養(yǎng)4 h，低、中、高劑量組加入相應濃度的根皮素，培養(yǎng)3 h后，每孔加入500μl冷PBS清洗3次（不含鉀），5 min/次。室溫下每孔加入免疫固定液500μl固定15 min，無鉀PBS清洗3次（5 min/次），擦干水痕，用含0.1%Triton X-100的PBS沖孔20 min（滲透）。再次用冷PBS清洗3次（不含鉀）。將24孔板中的玻片取出置于載玻片，每個玻片上加入50μl 5%山羊血清孵育3 h，沿邊緣擦干后，將200μl 5%山羊血清加入1μl NF-κBP65（1：200）抗體配成混合液，在每個玻片上加入混合液20μl孵育過夜。第2天室溫復溫30 min，清洗，擦干水痕，用山羊抗兔Ⅱ抗（1：2 000）放置1 h，在暗室操作。再次清洗后，DAPI固定細胞染色，靜置并在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包分析實驗數據。結果以±s表示，每組數據至少重復3次。對各組數據進行單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 根皮素對RAW264.7巨噬細胞生長抑制作用的影響 CCK-8法觀察細胞經不同濃度的根皮素藥物處理后細胞增殖活性的變化，結果顯示，與正常組相比，各劑量藥物對RAW264.7巨噬細胞的增殖均無明顯影響（P＞0.05），表明在該濃度范圍內，藥物不影響細胞增殖，亦沒有細胞毒性。見表2。

2.2 根皮素對RAW264.7巨噬細胞TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響 ELISA結果表明，與正常組相比，模型組上述炎癥因子表達水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組相比，根皮素藥物濃度各劑量干預后可明顯下調細胞上清液中上述炎癥因子表達（P＜0.01或P＜0.001）。見表3。

2.3 根皮素對RAW264.7巨噬細胞相關COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β表達的影響 與正常組相比，模型組mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.001）；與模型組相比，根皮素藥物各劑量組干預后各指標mRNA表達明顯降低（P＜0.01或P＜0.001）。見圖1、表4。

2.4 Western blot檢測根皮素對RAW264.7細胞的相關蛋白表達

2.4.1 根皮素對RAW264.7細胞MAPK信號通路的影響 與正常組相比，模型組MAPK信號通路的相關蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.001）；與模型組相比，根皮素藥物各劑量組干預后可明顯降低LPS誘導RAW264.7巨噬細胞p-P38和p-ERK1/2的蛋白表達水平（P＜0.01或P＜0.001），但對p-JNK1/2蛋白表達無影響。見圖2、表5。

表1 實時定量PCR引物Tab.1 Primers for real-time quantitative PCR

表2 不同濃度根皮素對RAW264.7巨噬細胞增殖的影響（xˉ ±s，n=5）Tab.2 Effect of phloretin at different concentrations on proliferation of RAW264.7 macrophages（xˉ ±s，n=5）

表3 含根皮素藥物濃度對RAW264.7巨噬細胞TNF-α、IL-6和IL-1β的影響（xˉ±s，n=3）Tab.3 Effect of phloretin concentration on TNF-α，IL-6 and IL-1βin RAW264.7 macrophages（xˉ ±s，n=3）

表4 根皮素藥物各濃度對RAW264.7巨噬細胞相關mRNA表達的影響（xˉ±s，n=3）Tab.4 Effectsof different concentrationsof phloretin on expression of related mRNA in RAW264.7 macrophage（xˉ ±s，n=3）

圖1 RAW264.7巨噬細胞中COX-2和iNOS的蛋白表達Fig.1 Protein expression electrophoresis of COX-2 and iNOSin RAW264.7 macrophages

圖2 RAW264.7巨噬細胞MAPK信號通路中P38、ERK 1/2、JNK1/2的蛋白表達電泳Fig.2 Protein expression electrophoresis of P38，ERK1/2，JNK 1/2 in MAPK signaling pathway of RAW264.7 macrophage

圖3 RAW264.7巨噬細胞Akt/NF-κB信號通路中相關蛋白的表達電泳Fig.3 Expression and electrophoresis of related proteins in Akt/NF-κB signaling pathway of RAW264.7 mac?rophage

2.4.2 根皮素對RAW264.7巨噬細胞Akt和NF-κB信號通路的影響 與正常組相比，模型組Ak/t NF-κB信號通路的相關蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.001）；與模型組相比，根皮素藥物各劑量組干預后可明顯降低LPS誘導RAW264.7巨噬細胞Akt、IκBα、NF-κB P65的蛋白表達水平（P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001）。見圖3、表6。

表5 根皮素藥物各濃度組對RAW264.7巨噬細胞MAPK信號通路蛋白表達的影響（xˉ±s，n=3）Tab.5 Effects of different concentrations of phloretin on MAPK signal pathway protein expression in RAW264.7 macrophages（xˉ ±s，n=3）

圖4 顯示了NF-κB P65核移位的代表性顯微照片（×200）Fig.4 Representative micrographs showing nuclear translocation of NF-κB P65（×200）

表6 根皮素藥物各濃度組對RAW264.7巨噬細胞Akt/NF-κB信號通路蛋白表達的影響（xˉ±s，n=3）Tab.6 Effects of different concentrations of phloretin on Akt/NF-κB signaling protein expression in RAW264.7 macro?phages（xˉ ±s，n=3）

2.5 根皮素減弱LPS刺激的RAW264.7細胞NF-κB P65炎癥信號通路 Western blot和免疫細胞化學方法研究根皮素對RAW264.7巨噬細胞NF-κB P65磷酸化和NF-κB P65核移位的影響。Western blot結果表明，根皮素抑制NF-κB P65的磷酸化（圖3）。免疫細胞化學-免疫熒光（ICC-IF）結果表明，根皮素抑制NF-κBP65亞基向細胞核的轉移（圖4）。

3 討論

LPS誘導RAW264.7巨噬細胞分泌相關炎癥因子產生炎癥反應，因此，本實驗通過深入研究LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞抗炎細胞因子的變化規(guī)律，進一步認識其對炎癥反應機制。LPS誘導細胞4 h，與正常組相比，模型組均可升高細胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放，表明炎癥模型造模成功。

TNF-α為一類經典炎癥因子，可誘導多種炎癥的發(fā)生，最終導致細胞凋亡，并處于炎癥級聯(lián)反應的中心，對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞NO合成具有重要意義。IL-1β是機體早期炎癥的標志物，可誘導炎癥因子IL-8等的產生，其產生在細胞損傷中起決定性作用［11-12］。促炎因子也包括IL-6，有研究表明，IL-6具有抗炎和致炎的雙向作用，其作用與其在組織中含量有關，正常水平的IL-6對機體有利，而過多IL-6會引起炎癥損傷，同時IL-6在神經病理性疼痛中也發(fā)揮重要作用［13-14］。本研究發(fā)現根皮素低、中、高濃度組均可下調LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞TNF-α、IL-6和IL-1β的表達升高，并呈現良好的濃度依賴性，說明根皮素的抗炎作用與抑制炎癥細胞因子有關。

在炎癥反應中，促炎癥酶（iNOS和COX-2）也起關鍵作用，其催化產物能顯著促進炎癥反應進展，大量分泌NO，是炎癥反應檢測的重要指標［15］。目前，調節(jié)NO合成酶及其誘導型合成酶iNOS的表達是治療炎癥疾病的重要手段。通常，組織細胞內COX-2活性極低，在相關因素誘導后得到激活。通過調節(jié)前列腺素合成進而介導炎癥與疼痛反應。因此，為了探討根皮素抗炎作用機制，課題組研究了LPS模型組和不同濃度根皮素組iNOS和COX-2的關系。本次研究結果表明，根皮素能顯著降低LPS刺激RAW264.7細胞產生的iNOS和COX-2。這些研究表明，根皮素對RAW264.7細胞炎癥相關因子的表達具有抑制作用，并呈濃度依賴性。同時，HUANG等［16］的研究表明，根皮素能顯著抑制脂肪細胞慢性炎癥性疾病的炎癥反應。

NF-κB是一類由P50和P65組成蛋白家族。其中P65是促炎基因表達的重要調節(jié)因子［17-18］。NF-κB通過控制TNF-α、IL-6和IL-1β的表達在炎癥反應中發(fā)揮重要作用［19］。Akt是NF-κB的上游分子，對NF-κB的活化具有重要作用［20-21］。為了探討根皮素在炎癥反應中的作用，課題組在LPS刺激的RAW264.7細胞中檢測了Ak/tNF-κB相關蛋白的表達。結果表明，根皮素顯著減弱LPS誘導的Ak/t NF-κB相關蛋白的磷酸化。MAPK信號通路也參與炎癥細胞因子的調節(jié)［22-23］。因此，課題組同時檢測了根皮素對P38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化的影響。結果表明，根皮素能顯著下調ERK1/2和P38磷酸化。有研究表明，在急性肺損傷模型中，根皮素能顯著抑制JNK1/2的磷酸化［24］。該結果與本研究并不一致，因此課題組認為不同細胞的根皮素抑制炎癥的機制可能不同。

綜上，根皮素可抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞的炎癥反應，其抗炎作用與抑制炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的生成，下調iNOS和COX-2蛋白表達，介導激活Ak/tNF-κB、ERK1/2和P38蛋白表達的調控有關。這可能是其防治各種慢性炎癥疾病重要作用機制。為后續(xù)臨床開發(fā)用藥提供理論依據。