烷基酚聚氧乙烯醚及相關代謝物檢測方法研究進展

虞冰，林琴，張春榮，吳園園，郭鈐，湯濤*

(1.金華市農產品質量綜合監(jiān)督檢測中心，浙江 金華 321017； 2.浙江省農業(yè)科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021)

環(huán)境內分泌干擾物(EDCs)是一類干擾生物體內分泌的外源性物質，此類物質在環(huán)境中的濃度較低，急性毒性較弱，但能引起生物體的生殖障礙、代謝紊亂、發(fā)育異常及某些癌癥(如乳腺癌、睪丸癌、前列腺癌等)的發(fā)生[1-2]。1996年12月，歐盟首次討論了內分泌干擾物對人體和其他生物體的影響，并將烷基酚類(APs)列為其中一類內分泌干擾物，APs因具有明顯的環(huán)境雌激素效應而引起廣泛關注和研究[3]。

烷基酚聚氧乙烯醚(APEOs)屬于非離子型表面活性劑，具備良好的潤濕性、分散性、洗滌性、乳化性、增溶和滲透作用，可廣泛應用于日用化工行業(yè)，如制備洗滌劑、造紙、紡織印染、冶金、制藥、農藥、印刷、合成樹脂、合成橡膠、塑料等行業(yè)[4]。APEOs包括約80%的壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)、約15%的辛基酚聚氧乙烯醚(OPEOs)、約1%十二烷基酚聚氧乙烯醚(DPEO)和二壬基酚聚氧乙烯醚(DNPEO)[5-6]。

毒性、生物降解性、環(huán)境激素和在生產過程中產生的有害副產物是APEOs產生危害的主要方面[7]。APEOs具有環(huán)境激素效應，已被國際列為禁用的70種環(huán)境激素之一。APEOs的降解產物APEO1-2和APs具有食物鏈的生物累積效應，APEO1-2和APs可在低級生物中聚集，再通過食物鏈在更高一級的生物體體內富集，當APEOs及代謝物在人體內累積達到一定量時容易致病和中毒，APEOs及其代謝物對人體主要的危害是與雌激素受體結合，從而影響人體正常激素分泌，導致生殖器官異常、精子數量減少等[8-9]。APEOs單體的溶解性隨著APEOs鏈長逐漸的縮短而減弱，毒性則是隨著鏈長的縮短而增強。相較于APEOs，APs對水生物的毒性更高，魚類和海藻對NPEO1-2的急性毒性范圍為4 600～14 000 μg·L-1，NP的急性毒性范圍則為17～3 000 μg·L-1，依據美國環(huán)保署(EPA)的制定標準，NPEO1-2為中等毒性，NP為高毒性[9]。因此，這些物質對環(huán)境和人類健康造成很大的威脅。APEOs在自然環(huán)境中普遍存在且濃度較低，環(huán)境中APEOs含量的測定對檢測方法的靈敏度、準確性和穩(wěn)定性要求較高，建立并驗證可靠的檢測方法尤為重要。

1 烷基酚聚氧乙烯醚及烷基酚的檢測技術進展

檢測不同的基質中的APEOs及其代謝產物，所選的儀器不同，前處理方法也不同。如表1所示，一般檢測固態(tài)基質中的APEOs和APs，通常采用甲醇作為萃取劑，超聲萃取或固相萃取，接著進行氮吹，定容后待檢測。而對于液態(tài)基質，通常采用乙腈、甲醇或正己烷作為萃取劑，液-液萃取，接著過柱后過0.22 μm膜，待檢測。因此，在今后的研究中，在檢測APEOs和APs選取前處理方法時，要考慮基質對檢測的影響。

表1 檢測技術的前處理方法

1.1 烷基酚聚氧乙烯醚及烷基酚樣品的前處理方法

前處理的目的是將目標化合物從基質中分離出來，降低基質干擾，使其成可檢測、可分析狀態(tài)。檢測APEOs和APs的前處理方法的步驟一般為提取、凈化和濃縮。而前處理提取方式有索氏提取法、液-液萃取法、微波萃取法、超聲萃取法、固相萃取和QuEChERS法等。

1.1.1 索氏提取

索氏提取法是利用相似相溶和虹吸原理，用溶劑將固體長期浸潤，將待提取的物質浸出來。常用的提取溶劑有乙腈、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、石油醚和正己烷等。陳武炯[11]利用150 mL甲醇經索氏提取器提取5 h，檢測紡織品中的APs和APEOs殘留，該方法回收率為80%～95%，相對標準偏差(RSD)為1.3%～4.6%(n=5)。GB/T 23322—2009[21]規(guī)定了紡織品中APEOs檢測的前處理方法以甲醇為提取溶劑，索氏提取3 h，該方法回收率為90%～110%，RSD<10%，該標準已于2018年被GB/T 23322—2018[22]替換。索氏提取法提取效率雖高，但所需溶劑消耗量大、提取的時間長，操作也較為復雜。

1.1.2 液-液萃取

液-液萃取原理是依據目標化合物在不同溶劑中的溶解度不同，進而將其從另一種溶劑中分離出來。常用的萃取溶劑有乙酸乙酯、甲醇、氯仿、二氯甲烷和乙腈等。液-液萃取主要應用于提取液態(tài)基質中APEOs及其代謝物。Li等[14]用甲醇提取飲料中的NP和OP，方法回收率為82%～94%，RSD<3.2%。蔡素婷等[20]用50%硫酸溶液調節(jié)1 L水樣的pH至小于2后，用60 mL的二氯甲烷反復提取3次，濃縮后用正丙酮定容、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷(BSTFA+TMCS，體積比99∶1)衍生0.5 h，經GC/MS分析后，4-t-OP、NP、4-t-OPEO1-2和NPEO1-24種化合物的回收率85%～110%，RSD為5.1%～8.8%。孫彥[19]也利用二氯甲烷做萃取溶劑提取水中的p-t-OP、AP和APEO1-2，回收率為84%～103%，RSD為5.8%～13.0%。液-液萃取法優(yōu)點是回收率高、重現性好，缺點是提取溶劑量較大、萃取時容易形成乳液，需進一步分離，且該方法適合提取簡單的基質中短鏈的APEOs和代謝物，當基質體系較為復雜時，提取效果不理想。

1.1.3 微波萃取

微波萃取主要是利用微波的熱效應，加速化合物的運動，使其被有效提取。王成云等[16]用甲醇作萃取劑微波萃取30 min，反復萃取2次紡織品中的NP、OP、NPEO3-16和OPEO3-16，方法回收率達93%～104%，RSD<5%，方法檢測限為0.01～0.025 mg·L-1。微波萃取法的優(yōu)點是設備簡單、萃取效率高、重現性好、節(jié)省時間和試劑等優(yōu)點。

1.1.4 超聲提取

超聲提取的原理是利用超聲波的空化效應和次級作用，促進化合物和基質的分離和促進化合物與提取溶劑的融合。黃芳等[10]用甲醇和水的混合溶液提取紡織品中的APEOs，回收率為91%～98%，RSD<5%。蒲愛軍等[23]以甲醇為溶劑超聲波萃取紡織染整助劑產品中殘留的NP、OP、NPEO2-17和OPEO2-17，回收率為98%～102%，RSD均<5%。左瑩等[24]用乙腈做萃取劑，分別超聲5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70 min后，測定紙中APEOs的含量。結果表明：超聲萃取時長超過35 min后，提取效率相近，最終選擇用乙腈超聲萃取35 min，該方法回收率為51%～117%，其中OPEO2、NPEO2-4、NPEO14-20回收率不足70%，RSD為2%～12%。超聲萃取法操作簡單，但僅對APs和特定聚合度的APEOs提取效率較高。

1.1.5 固相萃取

固相萃取法通過選擇性吸附目標組分和選擇合適的洗脫液，凈化并分離出目標組分。林琴[25]用甲醇-水溶液提取茶鮮葉、干茶和茶湯中的APEOs，經HLB固相萃取柱富集和凈化、再用含5%二氯甲烷甲醇溶液淋洗，3種基質中的回收率分別為32%～111%、61%～112%和72%～117%，RSD<20%。王金成等[18]將海水經C18固相萃取柱富集凈化后，用20%甲醇水淋洗，此方法NP的回收率為59.6%～64.4%，OP和APEOs的回收率為84.4%～104.4%，RSD為1.0%～13.5%。水基質中的NP和OP還可以用二氯甲烷/正己烷(4∶1，V/V)或MTBE/甲醇(1∶1，V/V)混合萃取后，經HLB固相萃取柱富集后分析檢測[26-27]。固相萃取法可富集凈化復雜固態(tài)基質和液態(tài)基質中的APs和APEOs，可檢測范圍較廣，此方法的缺點是萃取的容量低且容易阻塞固相萃取柱。

1.1.6 QuEChERS法

QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)是近年來國際上比較流行的一種農產品檢測快速前處理技術。該方法的原理是利用吸附劑填料吸附基質中的雜質，達到凈化的目的。Chen等[28]用乙腈提取蜂蜜、花粉和蜂蠟中的APEO3-13，1 mL提取液經150 mg MgSO4，150 mg PSA和50 mg C18凈化后，回收率為75%～111%，RSD<9%。Jiang等[29]用QuEChERS法凈化卷心菜，生菜和菠菜樣品中APEO2-20，該方法的回收率為72.8%～122.6%，RSD≤18.3%。QuEChERS法操作簡單、所需有機溶劑量少，可有效節(jié)約實驗成本，且此方法回收率高可檢測固態(tài)基質中不同聚合度的APEOs。

綜上所述，上述幾種前處理提取方法中，索氏提取法花費時間較長、溶劑需求量較大且操作復雜；液-液萃取法溶劑需求量也較大，且僅適用于液態(tài)基質中目標化合物的提??；微波萃取操作簡單、提取效率較高；超聲萃取適合提取APs和特定聚合度的APEOs；固相萃取法雖適用于提取多種復雜基質中的APs和APEOs，但固相萃取柱也有容量低、易阻塞吸附劑的缺點；QuEChERS法回收率較高，可檢測較高聚合度的APEOs，適用于提取復雜基質中的APEOs。

1.2 烷基酚聚氧乙烯醚及烷基酚的儀器分析方法

APEOs及APs的儀器分析方法主要是色譜法和質譜法。其中普遍采用HPLC法、GC法、LC/MS法和GC/MS法(表2和表3)來分析測定各種基質中的APEOs及其代謝產物的含量。

表3 固態(tài)基質的分析方法

表2 液態(tài)基質的分析方法

1.2.1 HPLC法

HPLC是一種具有廣泛適用領域的分離分析方法，由于其具有廣泛的選擇性、高體積流速、耗樣量較小、高靈敏度、良好的分離效能和不破壞原有樣品等優(yōu)點，而被廣泛應用于各個學科領域。

黃芳等[10]采用高效液相色譜/核磁共振光譜法來測定紡織品及紡織助劑中APEOs，用外標定量法，首先對流動相和檢測波長進行選擇，接著用雙體系色譜進行定性，最后再用核磁共振光譜進行驗證。實驗結果表明：該方法可用于測定紡織品及紡織助劑中APEOs類化合物，并且能達到足夠的準確度和檢測下限，方法可靠。

陳武炯[11]采用高效液相色譜/二極管陣列檢測器分別對紡織品中的APs和APEOs進行檢測。對波長和流動相條件進行篩選，最終確定最佳的儀器條件，該方法中OP、NP及OPEOs的線性范圍為5～100 μg·mL-1，NPEO的線性范圍為10～200 μg·mL-1，R2為0.998 3～0.999 8，檢測限為0.1～2 μg·mL-1。劉顯奎等[26]采用高效液相色譜/二極管陣列檢測器對皮革中的APEOs進行檢測，對波長、流動相、萃取方式、萃取時間和萃取溫度進行了條件篩選，最終確定運用甲醇超聲60 min萃取結果最佳，方法回收率為86%～110%，RSD為2.9%～3.2%，OPEOs和NPEOs檢出限為3.4 mg·kg-1和3.7 mg·kg-1。高效液相色譜/二極管陣列檢測器可對APEOs進行定量分析。

Cheng等[13]選取臺灣當地大型超市中的集中洗滌劑和洗衣粉，先溶于甲醇后過膜，采用HPLC/FLD檢測其中NPEOs的含量，得到41%的洗滌劑中均含有不同濃度的NPEOs，后來又用LC/MSI/MS進行驗證其含量，得出該方法可以檢測NPEOs的含量。Li等[14]同樣采用HPLC/FLD方法檢測河水中的NP和OP的含量，前處理方法中添加了BCEC-Cl進行衍生化，從而增加了分析物的疏水性、靈敏性，減小了雜質干擾，該方法回收率為82%～92%，RSD為6.4%～8.8%，LOD為0.03 μg·L-1，LOQ為0.1 μg·L-1。Lou等[15]采用新型固相萃取柱進行萃取、用HPLC/FLD分析檢測地表水中的NP，線性范圍為10～200 μg·L-1，相關系數為0.999 5，LOD和LOQ分別為0.44 μg·L-1和1.47 μg·L-1。該方法提供了一種新的萃取方式，為今后的研究建立了基礎。

APEOs的分子量比較大，揮發(fā)性較差，比較適合用高效液相色譜進行測定。然而用液相色譜檢測APEOs存在一些不足，即反相高效液相色譜不能區(qū)分不同聚合度的APEOs，而正相高效液相色譜不能區(qū)分同一聚合度的不同結構，因此，目前很少使用單一的高效液相色譜來檢測APEOs及其代謝產物的含量，一般采取與質譜或者其他檢測器聯(lián)用的方法來進行檢測。

1.2.2 LC/MS法

LC/MS法具有靈敏度高、選擇性較好等優(yōu)點，用來分析測定APEOs，可對不同聚合度的APEOs定性和定量[30-38]。

Salgueiro-González等[39]利用LC/MS法檢測河水、飲用水和海水中的NP和OP，并且對MASE萃取方式的萃取參數(包含萃取劑、萃取溫度、萃取時間)進行優(yōu)化，得到在正己烷、溫度為40 ℃、時間60 min時萃取效果最佳，接著比較了不同基質對APs回收率檢測的影響，最后對該方法進行了驗證。該方法回收率和相對標準偏差均符合要求，從而得到應用于水中APs的前處理和儀器分析的最佳方法。

蒲愛軍等[23]以甲醇為溶劑經超聲波萃取、采用高效液相色譜/質譜法來檢測紡織染整助劑產品中殘留的APEOs，并對色譜分析條件(包含流動相、色譜柱、柱溫以及監(jiān)測離子)和前處理條件(主要是萃取劑)進行優(yōu)化，得出用甲醇萃取、流動相為甲醇/水=85/15、柱溫為40 ℃時，分離效果較好。

Chen等[28]用QuEChERS法結合UPLC/MS分析檢測了蜂蜜、花粉和蜂蠟中的OPEO3-13和NPEO3-13，NPEOs和OPEOs的平均檢測限分別為0.56 μg·kg-1和0.44 μg·kg-1，實際樣品中檢出NPEOs濃度為26～10 239 μg·kg-1。林琴[25]利用SPE法結合LC/MS分析茶葉基質中的APEO3-20，該方法篩查出市售茶葉中的OPEO3-20和NPEO3-20的含量范圍分別為0.03～12.9 μg·kg-1和0.3～215.9 μg·kg-1，而市售茶飲料中APEOs的含量則均低于LOQ。

另外王成云等[16]、王愛霞等[17]和王金成等[18]也通過LC/MS分別來檢測紡織品、內墻涂料和海水中的APEOs。LC/MS法可有效應用于定性定量分析測定多種基質中的APEOs及其代謝產物，檢測方法簡便、快速、靈敏度高、結果穩(wěn)定。

1.2.3 GC法

20世紀30年代，舒夫坦和尤肯發(fā)展了氣固色譜法。接著詹姆斯和馬丁提出氣液色譜法，而現在氣相色譜法有時主要指氣液色譜法。氣相色譜法主要應用于環(huán)境保護、石油工業(yè)、藥物學、臨床化學和食品工業(yè)等。張洛紅等[12,40-43]和馮琳等[44]都建立毛細管內固相萃取/氣相色譜檢測方法，用優(yōu)化后的毛細管固相萃取柱對APs進行萃取后進行氣相色譜檢測。該方法能夠對ppb級別殘留量的檢測。氣相色譜法具有檢測靈敏度高、分離效率高、選擇性和樣品用量少等優(yōu)點。而缺點是在定性、定量分析時，必須用已知物或已知數據比對和校正，因此，在同時檢測多種APEOs時并不適用。

1.2.4 GC/MS法

GC/MS法的研究開始于60年代，后來隨著80年代新的質譜技術出現，越來越廣泛地被應用。GC/MS是利用氣相色譜的分離能力和質譜的鑒定能力達到對目標分子定性定量的目的。GC/MS法適合分析測定分子量較小、揮發(fā)性較好的APs與短鏈APEOs，不適合聚合度較高的難揮發(fā)的APEOs。

蔡素婷等[20]和Li等[30]均采用GC/MS法分別對水和尿液中的短鏈APEOs進行檢測。運用二氯甲烷、甲醇作為萃取劑，用液-液萃取、固相萃取來檢測。然而尿液中和飲用水中的NP含量明顯差異很大，Li等[30,45-47]通過兒童和成人的對比，并且研究運用塑料杯和陶瓷杯來飲用水情況下尿液中NP的含量，從而對兒童健康和日常飲食提出了寶貴建議。相關研究為GC/MS對短鏈APEOs檢測提供了范例，也為今后進一步的研究奠定了基礎。

GC/MS法可以同時定性、定量檢測，優(yōu)點是分辨率較高、分離效率高、選擇性比較好和檢測速度快[48]。但運用GC/MS法檢測APEOs時，由于其揮發(fā)性較差，用氣相色譜質譜測定之前必須進行衍生化反應，衍生化時間甚至長達12 h[19]，前處理過程耗時長、操作較繁瑣，并且GC/MS分析對象局限于APs和APEO1-2，因此，目前該方法并不能廣泛運用。

2 小結與展望

目前色譜類分析方法已經得到了廣泛應用，是檢測APEOs及其代謝產物的重要手段。以往的研究中主要是針對紡織品和水中的APEOs和APs的檢測，并且不同方法之間的差異較大，單一的色譜法往往檢測限比較高，并不適合濃度較低的基質中的痕量檢測，而且不能準確地定量檢測。因此，色譜與其他檢測器聯(lián)用是分析檢測APEOs和APs的常規(guī)方法，其中使用較多的是色譜質譜聯(lián)用法。相對于單一的色譜法，色譜質譜聯(lián)用方法具備簡便、快速、靈敏度高、定性定量效果好等優(yōu)點。但其缺點是分析和檢測受場地限制，無法在現場進行快速檢測。

因此，優(yōu)化和改進不同基質中APEOs和APs的分析檢測方法是勢在必行的。首先，需要優(yōu)化前處理步驟和儀器檢測條件，使得色譜類分析方法操作更加簡便。簡化操作方法，才能節(jié)約時間和成本。其次，開發(fā)其他基質如農藥、植物基質和動物基質等的分析檢測方法。目的是簡化現有方法的同時，拓寬可檢測范圍。最后，還可以開發(fā)一些新的方法如生物學方法，快速檢測試劑盒等來檢測APEOs和APs，開發(fā)便攜的、能超快速檢測的儀器和其他類新的方法也是今后的發(fā)展趨勢之一。