艾拉莫德對干燥綜合征小鼠頜下腺炎癥及NF-κB信號通路的影響①

齊 晅 田 玉 孫 超 高麗霞 郭惠芳（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，石家莊 050000）

干燥綜合征為一種自身免疫性疾病，主要侵犯外分泌腺，臨床主要表現(xiàn)為眼干、口干、內(nèi)臟系統(tǒng)損害等；干燥綜合征發(fā)病率較高，對患者的健康造成嚴(yán)重危害。干燥綜合征的病理特征為大量淋巴細(xì)胞浸潤外分泌腺，外分泌腺體炎癥細(xì)胞因子水平升高［1］。因此抑制炎癥因子產(chǎn)生及其信號通路是治療干燥綜合征的關(guān)鍵。艾拉莫德為新型小分子免疫調(diào)節(jié)藥物，具有抑制炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生、抑制免疫球蛋白形成等作用，是常用的抗風(fēng)濕藥物［2］。近年艾拉莫德在干燥綜合征治療中的作用也受到關(guān)注，如吳曉暢等［3］研究發(fā)現(xiàn)，艾拉莫德可減輕干燥綜合征小鼠下頜腺淋巴細(xì)胞浸潤程度，降低血清IL-17及IFN-γ水平。上述研究表明艾拉莫德可降低血清炎癥細(xì)胞因子水平，但其對下頜腺組織中炎癥細(xì)胞水平及其可能信號通路的影響尚不明確。核因子（nuclear factor，NF）-κB信號通路在炎癥反應(yīng)和干燥綜合征的發(fā)病中均發(fā)揮重要作用［4］。故本文對艾拉莫德對干燥綜合征小鼠下頜腺組織中炎癥因子水平及NF-κB信號通路的影響進(jìn)行研究，探討艾拉莫德在干燥綜合征中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料8周齡SPF級雌性NOD小鼠和C57BL/6小鼠購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號：SYXK（滬）2019-0003。艾拉莫德片（先聲藥業(yè)公司，批號：A17-185346）；兔抗鼠NF-κB/p50單克隆抗體、兔抗鼠NF-κB/p65單克隆抗體、兔抗鼠IκBα單克隆抗體等抗體（美國Sigma公司）；伊紅-蘇木素（HE）染液（杭州聯(lián)科生物）；IL-6、TNF-α、IFN-γ ELISA試劑盒（美國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和處理 將36只NOD小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為模型組（M組）、艾拉莫德1組（I1組）、艾拉莫德2組（I2組），12只/組，12只C57BL/6小鼠作為對照組（C組）。各組小鼠于我院動(dòng)物中心飼養(yǎng)適應(yīng)1周，I1組小鼠每天給予0.5%羧甲基纖維素+10 mg/kg艾拉莫德灌胃治療，I2組小鼠每天給予0.5%羧甲基纖維素+30 mg/kg艾拉莫德灌胃治療［3］。C組和M組小鼠每天給予等量0.5%羧甲基纖維素灌胃，給藥劑量根據(jù)動(dòng)物和人等效劑量換算表計(jì)算。共進(jìn)行8周。

1.2.2 飲水量和唾液分泌量測定 每天記錄各小鼠飲水瓶質(zhì)量，每日飲水量=前一天飲水瓶質(zhì)量-當(dāng)天飲水瓶質(zhì)量，記錄第8周末小鼠的日飲水量。次日，各小鼠禁食1 h，不禁水，測量唾液分泌量。具體方法：0.7%無巴比妥麻醉小鼠，取頭低位，稱取干的小棉球質(zhì)量，將其放入小鼠口底，收集唾液15 min，取出棉球，再次稱取小棉球質(zhì)量，計(jì)算分泌唾液量（mg），分泌唾液量=測量后小棉球質(zhì)量-測量前小棉球質(zhì)量。

1.2.3 頜下腺指數(shù)和脾臟指數(shù)測定 飲水量和唾液分泌量測定結(jié)束后，稱取小鼠重量，脫臼法處死小鼠，摘取雙側(cè)頜下腺和脾臟稱重，頜下腺指數(shù)=頜下腺重量/小鼠體重，脾臟指數(shù)=脾臟重量/小鼠體重。

1.2.4 頜下腺組織HE染色 將部分頜下腺組織固定于福爾馬林，石蠟包埋，切成5μm厚切片，常規(guī)HE染色，鏡下拍照并觀察頜下腺組織的病理形態(tài)學(xué)變化。參照CUTZLER等［5］提出的方法評價(jià)下頜腺病理學(xué)評分：偶見淋巴細(xì)胞浸潤為0分，2～3個(gè)散在淋巴細(xì)胞浸潤為1分，中度淋巴細(xì)胞浸潤伴輕度實(shí)質(zhì)損傷為2分，偶見0～1個(gè)淋巴細(xì)胞浸潤灶伴中度實(shí)質(zhì)損傷為3分，2～3個(gè)淋巴細(xì)胞浸潤灶伴中度實(shí)質(zhì)損傷為4分。

1.2.5 ELISA測定頜下腺組織IL-6、TNF-α、IFN-γ水平 取各小鼠0.1 g下頜腺組織剪碎，置入無菌管，加入生理鹽水2 ml，勻漿1 min，3000 r/min離心20 min，取上清液，ELISA測定下頜腺上清液中IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。

1.2.6 Western blot測定下頜腺組織NF-κB/p50、NF-κB/p65、IκBα蛋白水平 取下頜腺組織加入裂解液裂解、勻漿，提取總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗：兔抗鼠NF-κB/p50單克隆抗體（1：300）、兔抗鼠NF-κB/p65單克隆抗體（1：300）、兔抗鼠IκBα單克隆抗體（1：300），過夜孵育，加入二抗（1：5 000）孵育2 h，顯影、定影、沖洗、晾干，掃描膠片，采用Image J軟件分析NF-κB/p50、NF-κB/p65、IκBα蛋白水平，以β-actin為內(nèi)參照，目標(biāo)蛋白水平=目標(biāo)條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件分析，每日飲水量、唾液分泌量、頜下腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、病理評分、頜下腺組織IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及下頜腺組織NF-κB/p50、NF-κB/p65、IκBα蛋白水平以±s表示，采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠每日飲水量和唾液分泌量比較 與C組相比，M組小鼠每日飲水量增多，唾液分泌量降低（P＜0.05）；與M組相比，I組小鼠每日飲水量減少，唾液分泌量升高（P＜0.05），其中I2組小鼠每日飲水量低于I1組，唾液分泌量高于I1組（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠每日飲水量和唾液分泌量比較（±s，n=12）Tab.1 Comparison of daily drinking water and saliva secretion in each group of mice（±s，n=12）

表1 各組小鼠每日飲水量和唾液分泌量比較（±s，n=12）Tab.1 Comparison of daily drinking water and saliva secretion in each group of mice（±s，n=12）

Note：Compared with C group，1）P＜0.05；compared with M group，2）P＜0.05；compared with I1 group，3）P＜0.05.

Saliva secretion（mg）6.65±0.76 3.64±0.581）4.35±0.621）2）5.24±0.671）2）3）46.230 0.000 Groups C M I 1 I2 F P Daily drinking water（g/d）4.25±0.41 6.62±0.491）5.73±0.541）2）4.97±0.481）2）3）53.933 0.000

2.2 各組小鼠頜下腺指數(shù)和脾臟指數(shù)比較 與C組相比，M組小鼠頜下腺指數(shù)降低，脾臟指數(shù)升高（P＜0.05）；與M組相比，I組小鼠頜下腺指數(shù)升高，脾臟指數(shù)降低（P＜0.05），其中I2組小鼠頜下腺指數(shù)高于I1組，脾臟指數(shù)低于I1組（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠頜下腺指數(shù)和脾臟指數(shù)比較（±s，n=12，mg/g）Tab.2 Comparison of submandibular gland index and spleen index in each group of mice（±s，n=12，mg/g）

表2 各組小鼠頜下腺指數(shù)和脾臟指數(shù)比較（±s，n=12，mg/g）Tab.2 Comparison of submandibular gland index and spleen index in each group of mice（±s，n=12，mg/g）

Note：Compared with C group，1）P＜0.05；compared with M group，2）P＜0.05；compared with I1 group，3）P＜0.05.

Spleen index 2.97±0.28 4.12±0.431）3.85±0.371）2）3.41±0.461）2）3）20.014 0.000 Groups CMI 1 I2 FP Submandibular gland 0.77±0.15 0.39±0.121）0.48±0.131）2）0.62±0.141）2）3）18.071 0.000

2.3 各組小鼠頜下腺組織形態(tài)學(xué)和病理評分比較C組小鼠頜下腺腺泡大小規(guī)則，排列緊密，未見導(dǎo)管擴(kuò)張和淋巴細(xì)胞浸潤；M組小鼠頜下腺腺泡大小不一，排列不規(guī)則，導(dǎo)管明顯擴(kuò)張，見大量淋巴細(xì)胞浸潤；I組小鼠下頜腺腺泡大小不一和形態(tài)不規(guī)則明顯改善，導(dǎo)管擴(kuò)張減輕，淋巴細(xì)胞浸潤減少，其中與I1組相比，I2組小鼠下頜腺組織病理改善更顯著。見圖1。與M組相比，I組小鼠病理評分降低（P＜0.05），其中I2組小鼠病理評分低于I1組（P＜0.05），見表3。

圖1 各組小鼠頜下腺組織HE染色（×200）Fig.1 HE staining of submandibular gland of each group of mice（×200）

表3 各組小鼠病理評分比較（±s）Tab.3 Comparison of pathological scores of mice in each group（±s）

表3 各組小鼠病理評分比較（±s）Tab.3 Comparison of pathological scores of mice in each group（±s）

Note：Compared with M group，1）P＜0.05；compared with I1 group，2）P＜0.05.

Pathological scores 3.14±0.62 2.31±0.581）1.42±0.511）2）27.155 0.000 Groups M I 1 I 2 n 12 12 12 F P

2.4 各組小鼠頜下腺組織IL-6、TNF-α、IFN-γ水平比較 與C組相比，M組小鼠頜下腺組織IL-6、TNFα、IFN-γ水平升高（P＜0.05）；與M組相比，I組小鼠頜下腺組織IL-6、TNF-α、IFN-γ水平降低（P＜0.05），其中I2組小鼠頜下腺組織IL-6、TNF-α、IFN-γ水平低于I1組（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠頜下腺組織IL-6、TNF-α、IFN-γ水平比較（±s，n=12，ng/L）Tab.4 Comparison of IL-6，TNF-αand IFN-γlevels in submandibular gland of mice in each group（±s，n=12，ng/L）

表4 各組小鼠頜下腺組織IL-6、TNF-α、IFN-γ水平比較（±s，n=12，ng/L）Tab.4 Comparison of IL-6，TNF-αand IFN-γlevels in submandibular gland of mice in each group（±s，n=12，ng/L）

Note：Compared with C group，1）P＜0.05；compared with M group，2）P＜0.05；compared with I1 group，3）P＜0.05.

IFN-γ 873.26±154.32 1482.34±186.491）1356.49±192.311）2）1152.47±175.941）2）3）26.831 0.000 Groups C M I 1 I2 F P IL-6 97.83±15.43 182.64±16.471）152.1615.291）2）127.8314.681）2）3）64.966 0.000 TNF-α 382.16±38.21 602.31±43.251）546.28±41.321）2）472.37±39.541）2）3）66.063 0.000

2.5 各組小鼠下頜腺組織中NF-κB信號通路蛋白比較 與C組相比，M組小鼠下頜腺組織NF-κB/p50、NF-κB/p65蛋白水平升高，IκBα蛋白水平降低（P＜0.05）；與M組相比，I組小鼠下頜腺組織NF-κB/p50、NF-κB/p65蛋白水平降低，IκBα蛋白水平升高（P＜0.05），其中I2組小鼠下頜腺組織NF-κB/p50、NF-κB/p65蛋白水平低于I1組（P＜0.05），IκBα蛋白水平高于I1組（P＜0.05），見表5、圖2。

表5 各組小鼠下頜腺組織NF-κB/p50、NF-κB/p65、IκBα蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.5 Comparison of NF-κB/p50，NF-κB/p65 and IκBα protein levels in submandibular gland of mice in each group（±s，n=12）

表5 各組小鼠下頜腺組織NF-κB/p50、NF-κB/p65、IκBα蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.5 Comparison of NF-κB/p50，NF-κB/p65 and IκBα protein levels in submandibular gland of mice in each group（±s，n=12）

Note：Compared with C group，1）P＜0.05；compared with M group，2）P＜0.05；compared with I1 group，3）P＜0.05.

IκBα 0.79±0.14 0.18±0.051）0.35±0.061）2）0.47±0.081）2）3）99.128 0.000 Groups C M I 1 I2 F P NF-κB/p50 0.10±0.03 0.72±0.091）0.53±0.081）2）0.29±0.061）2）3）186.105 0.000 NF-κB/p65 0.19±0.02 0.51±0.061）0.44±0.051）2）0.31±0.041）2）3）119.062 0.000

圖2 各組小鼠下頜腺組織NF-κB/p50、NF-κB/p65、IκBα蛋白水平Fig.2 NF-κB/p50，NF-κB/p65 and IκBαprotein levels in submandibular gland of mice in each group

3 討論

干燥綜合征的治療方法主要包括系統(tǒng)性治療和局部治療，系統(tǒng)性治療主要應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑等藥物延緩和控制由自身免疫反應(yīng)引起的組織器官損害；局部治療是主要以改善眼干、口干及其他部位干燥癥狀為目的的治療［6］。但干燥綜合征目前尚不能根治，藥物治療主要控制疾病發(fā)展，且免疫抑制劑及激素等藥物長期應(yīng)用可引起一系列副作用。艾拉莫德為臨床上用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的抗風(fēng)濕藥物，為一種新藥，具有抑制炎癥因子產(chǎn)生和抑制Ig合成的作用，在治療干燥綜合征中也具有較好效果［7-10］。如王雪等［11］研究發(fā)現(xiàn)，艾拉莫德可有效改善干燥綜合征患者病情，調(diào)節(jié)B細(xì)胞亞群、降低免疫球蛋白水平。NOD小鼠早期出現(xiàn)飲水量增加、口干等臨床表現(xiàn)，且血清中自身抗體升高，外分泌腺存在淋巴細(xì)胞浸潤，為理想的自發(fā)性干燥綜合征模型小鼠。本文采用NOD小鼠作為干燥綜合征小鼠模型，發(fā)現(xiàn)干燥綜合征小鼠每日飲水量升高、唾液分泌量降低、頜下腺指數(shù)降低、脾臟指數(shù)升高、下頜腺病理評分升高；給予艾拉莫德治療后，模型組小鼠每日飲水量降低、唾液分泌量升高、頜下腺指數(shù)升高、脾臟指數(shù)降低、下頜腺病理評分降低。表明艾拉莫德可有效改善干燥綜合征小鼠的臨床癥狀，減輕下頜腺的病理損傷，且呈劑量依賴性。

干燥綜合征為一種以血清中含多種自身抗體和高度淋巴細(xì)胞浸潤為特征、侵犯淚腺、唾液腺等外分泌腺的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為其主要病理學(xué)機(jī)制為：在大量T淋巴細(xì)胞作用下，B淋巴細(xì)胞功能紊亂，產(chǎn)生多種免疫復(fù)合物、自身抗體、多克隆免疫球蛋白，導(dǎo)致分泌腺產(chǎn)生炎癥性病變，并導(dǎo)致分泌腺發(fā)生破壞性改變。Th17細(xì)胞在干燥綜合征中發(fā)揮重要作用，Th17細(xì)胞可產(chǎn)生IL-6、TNF-α、IL-17等炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)干燥綜合征的發(fā)生發(fā)展。IL-6由T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生，可影響T淋巴細(xì)胞增殖活化，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，影響粒細(xì)胞分化和殺傷細(xì)胞的能力［12-13］。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞和活化的單核細(xì)胞產(chǎn)生，具有促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬、抗感染、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化等作用，為重要的炎癥因子，在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［14］。IL-6和TNF-α在干燥綜合征中水平升高，TNF-α可誘導(dǎo)IL-6等細(xì)胞因子釋放，形成放大連鎖反應(yīng)，引起干燥綜合征的外分泌腺體損傷［15］。IFN-γ可通過促進(jìn)Th1細(xì)胞的活化和增殖，抑制Th2細(xì)胞的活化和增殖，從而參與免疫調(diào)節(jié)過程，IFN-γ在干燥綜合征患者外分泌腺體和血清中水平顯著升高，并可誘導(dǎo)IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子高表達(dá)，促進(jìn)干燥綜合征的進(jìn)展［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)干燥綜合征小鼠下頜腺組織中IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高，表明IL-6、TNFα、IFN-γ參與干燥綜合征下頜腺的損傷過程，艾拉莫德可抑制干燥綜合征小鼠下頜腺組織IL-6、TNFα、IFN-γ水平，表明艾拉莫德可能通過抑制下頜腺組織的炎癥反應(yīng)發(fā)揮對下頜腺的保護(hù)作用。

NF-κB在真核細(xì)胞中普遍存在，為炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的核心物質(zhì)，NF-κB信號通路在多種自身免疫性疾病和感染性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB和NF-κB抑制蛋白IκB形成復(fù)合物，在細(xì)胞質(zhì)中以無活性的形式存在，IκB的主要功能為抑制NF-κB活化，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞外信號（如IL-6、TNF-α等）刺激時(shí)，可降解IκB，激活NF-κB，活化的NF-κB進(jìn)一步增強(qiáng)IL-6、TNF-α等炎癥因子釋放，IL-6、TNF-α等炎癥因子進(jìn)一步激活NF-κB，形成正反饋機(jī)制，NF-κB激活時(shí)，具有免疫活性的NF-κB/p50和NF-κB/p65大量表達(dá)，和其調(diào)控因子一起參與疾病的病理損傷過程［18］。NF-κB在干燥綜合征的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用［19］。艾拉莫德可通過NF-κB信號通路發(fā)揮對疾病的治療作用［20］，如黃穎等［21］研究發(fā)現(xiàn)艾拉莫德通過NF-κB信號通路發(fā)揮對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用。介于NF-κB在干燥綜合征中發(fā)揮重要作用，艾拉莫德可通過NF-κB信號通路發(fā)揮作用，故推測艾拉莫德可能通過NF-κB信號通路發(fā)揮對干燥綜合征小鼠的保護(hù)作用。本文對該推測進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)干燥綜合征模型小鼠下頜腺組織NF-κB/p50、NF-κB/p65蛋白水平升高，IκBα蛋白水平降低；與模型組小鼠相比，I組小鼠下頜腺組織NF-κB/p50、NF-κB/p65蛋白水平降低，IκBα蛋白水平升高。表明NF-κB信號通路激活參與干燥綜合征小鼠的下頜腺病理損傷過程，艾拉莫德可能通過抑制NF-κB信號通路激活抑制干燥綜合征小鼠下頜腺的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對下頜腺的保護(hù)作用。