miR-202-5p靶向下調SOX6表達對缺氧復氧誘導的心肌細胞氧化應激的影響研究①

秦少強 梁惠清 王曉元 張占帥 李會賢 張鵬祥 王 蕊 李方江河北北方學院附屬第一醫(yī)院心內科張家口075000

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是最常見、最嚴重的心臟病,是導致心血管疾病死亡的主要原因。心肌缺血再灌注(ischemiareperfusion,I/R)損傷是AMI后冠狀動脈恢復血液供應加重心肌損傷的重要病理過程[1]。氧化應激在I/R損傷的發(fā)病機制中起著至關重要的作用[2]。此外,在I/R損傷后心肌細胞凋亡明顯增加[3]。因此,如何有效降低氧化應激和凋亡水平對減少I/R后的心肌損傷具有重要意義。miRNA是一類通過與靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)結合調控靶基因表達的短鏈非編碼RNA,其表達異常與人類的多種心血管疾病有關,包括心肌損傷[4]。最近研究顯示,I/R大鼠模型和缺氧誘導的乳鼠原代心肌細胞中miR-202-5p表達下調,過表達miR-202-5p可減少心肌梗死面積,緩解心肌酶失調,對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用[5]。SOX6基因是Y染色體的性別決定基因相關高遷移率蛋白(SRY related HMG box gene,SOX)基因家族SOX D亞族成員,研究發(fā)現(xiàn)SOX6可調控晚期心臟分化過程中的心肌細胞增殖和凋亡[6]。此外,下調SOX6表達還可改善心梗后心肌功能[7]。生物信息學分析顯示,SOX6是miR-202-5p的潛在靶基因,但miR-202-5p能否靶向SOX6參與對I/R損傷后心肌細胞氧化應激和凋亡的調控尚未可知。因此,本研究構建缺氧復氧模型模擬心肌細胞I/R損傷過程,初步探討miR-202-5p對缺氧復氧誘導的心肌細胞氧化應激和凋亡的影響和機制,以期為預防I/R損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠胚胎心肌細胞H9C2(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco公司)；LipofectamineTM2000轉染試劑和TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；細胞計數(shù)(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒(美國APExBIO公司)；熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(美國Promega公司)；活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)檢測試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；qPCR SYBR?Green Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司)；膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素(Annexin V fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)試劑盒(美國Sigma公司)；miR-con、miR-202-5p mimics、anti-miR-con、anti-miR-202-5p、pcDNA、pcDNA-SOX6、WT-SOX6、MUT-SOX6的構建和測序(上海吉瑪制藥有限公司)；RIPA裂解液(北京百泰克生物技術有限公司)；兔源SOX6多克隆抗體、兔源Cyclin D1單克隆抗體、兔源Cleaved Caspase-3多克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(美國Abcam公司)；紫外分光光度計(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 構建心肌細胞缺氧復氧模型 采用高糖DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗)培養(yǎng)H9C2心肌細胞,培養(yǎng)條件:37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。取對數(shù)生長期心肌細胞,采用無糖DMEM培養(yǎng)基于37℃缺氧培養(yǎng)心肌細胞6 h,然后將心肌細胞用新鮮高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)6 h,記為缺氧復氧組。

1.2.2 細胞轉染和實驗分組 細胞轉染采用脂質體轉染法利用LipofectamineTM2000進行轉染,轉染48 h時進行缺氧復氧處理。將H9C2心肌細胞隨機分為以下幾組:空白組(正常培養(yǎng)的H9C2細胞)、缺氧復氧組(缺氧6 h,復氧6 h)、缺氧復氧+miR-con組(轉染miR-con后,缺氧復氧處理)、缺氧復氧+miR-202-5p組(轉染miR-202-5p mimics后,缺氧復氧處理)、缺氧復氧+miR-202-5p+pcDNA組(共轉染miR-202-5p mimics和pcDNA后,缺氧復氧處理)、缺氧復氧+miR-202-5p+pcDNA-SOX6組(共轉染miR-202-5p mimics和pcDNA-SOX6后,缺氧復氧處理)。

1.2.3 qRT-PCR檢測 利用TRIzol法提取各組H9C2細胞總RNA,采用紫外分光光度計測定RNA濃度,采用cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA,按照qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說明書配置反應體系,利用ABI 7500實時熒光定量PCR儀檢測miR-202-5p和SOX6 mRNA的相對表達量。

1.2.4 熒光素酶報告基因實驗 利用TargetScan預測miR-202-5p靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-202-5p與SOX6存在部分特異性合位點。構建含有SOX6 3′-UTR的野生型WT-SOX6和突變型MUT-SOX6熒光素酶報告基因載體,分別將WT-SOX6、MUT-SOX6與miR-202-5p mimics共轉染至H9C2心肌細胞,轉染48 h后,收集細胞并檢測各組細胞中熒光素酶活性。

1.2.5 CCK-8試劑盒檢測細胞增殖 取對數(shù)期H9C2心肌細胞按照2×103個/孔細胞密度接種于96孔板,按照實驗分組進行相應處理后,每個孔中加入10μl的CCK8溶液,培養(yǎng)箱孵育4 h,用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值(A),計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(A處理組/A對照組)×100%。

1.2.6 檢測ROS、MDA、GSH-Px水平 收集進行相應處理的各組H9C2心肌細胞,加入RIPA裂解液,冰上裂解30 min,4℃12 000 r/min離心15 min,收集上清液,按照試劑盒說明書檢測ROS、MDA、GSHPx水平。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集進行相應處理的各組H9C2心肌細胞,用預冷的PBS洗滌3次,離心后棄上清液。用1×binding buffer重懸細胞,調整細胞濃度為1×105個/ml。取100μl的細胞懸液加入流式管內,分別加入5μl的Annexin VFITC和10μl的PI溶液,混勻后,避光孵育15 min,補加PBS至500μl后,流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡情況。

1.2.8 Western blot檢測 收集進行相應處理的各組H9C2心肌細胞,加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白,BCA試劑盒檢測蛋白濃度,取30μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離細胞蛋白,經濕法轉膜、封閉后,加入各蛋白已稀釋的Ⅰ抗,洗膜后,分別加入稀釋的Ⅱ抗,ECL顯影后,放入自動凝膠成像系統(tǒng)拍照,Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理 用SPSS18.0進行統(tǒng)計學分析,所有數(shù)據(jù)均用表示,采用t檢驗進行組間比較,采用單因素方差分析進行多組間比較,以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 缺氧復氧處理對心肌細胞miR-202-5p和SOX6表達的影響 與空白組相比,缺氧復氧組心肌細胞miR-202-5p的表達水平顯著降低,SOX6 mRNA和SOX6蛋白的表達水平顯著升高(P＜0.05),見圖1。

圖1 缺氧復氧處理心肌細胞影響miR-202-5p和SOX6表達Fig.1 Hypoxia-reoxygenation treatment affects miR-202-5p and SOX6 expression in cardiomyocytes

2.2 上調miR-202-5p表達促進缺氧復氧處理心肌細胞增殖 與空白組相比,缺氧復氧組心肌細胞miR-202-5p的表達水平顯著降低,Cyclin D1的表達水平顯著降低,細胞存活率顯著降低；與缺氧復氧+miR-con組比較,缺氧復氧+miR-202-5p組心肌細胞miR-202-5p的表達水平顯著升高,Cyclin D1的表達水平顯著升高,細胞存活率顯著升高(P＜0.05),見圖2。

2.3 上調miR-202-5p表達抑制缺氧復氧處理心肌細胞凋亡 與空白組相比,缺氧復氧組心肌細胞Cleaved Caspase-3蛋白的表達水平顯著升高,細胞凋亡率顯著增加；與缺氧復氧+miR-con組比較,缺氧復氧+miR-202-5p組心肌細胞Cleaved Caspase-3蛋白的表達水平顯著降低,細胞凋亡率顯著降低(P＜0.05),見圖3。

2.4 上調miR-202-5p表達抑制缺氧復氧處理心肌細胞氧化應激 與空白組相比,缺氧復氧組心肌細胞ROS水平顯著升高,MDA的含量顯著升高,GSHPx的含量顯著降低；與缺氧復氧+miR-con組比較,缺氧復氧+miR-202-5p組心肌細胞ROS水平顯著降低,MDA的含量顯著降低,GSH-Px的含量顯著升高(P＜0.05),見圖4。

圖2 上調miR-202-5p促進缺氧復氧處理心肌細胞存活率和Cyclin D1蛋白表達Fig.2 Up-regulation of miR-202-5p promotes the survival rate and Cyclin D1 protein expression of cardiomyocytes treated with hypoxia and reoxygenation

2.5 miR-202-5p靶向調控SOX6的表達 生物信息學軟件在線預測顯示,miR-202-5p和SOX6存在部分連續(xù)互補的核苷酸序列,見圖5A。與miR-con和WT-SOX6共轉染組比較,miR-202-5p和WT-SOX6共轉染組心肌細胞的熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05)；與miR-con和MUT-SOX6共轉染組比較,miR-202-5p和MUT-SOX6共轉染組心肌細胞的熒光素酶活性無顯著變化,見圖5B。與miR-con組比較,miR-202-5p組心肌細胞SOX6蛋白表達水平顯著降低；與anti-miR-con組比較,anti-miR-202-5p組心肌細胞SOX6蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05),見圖5C。

圖3 上調miR-202-5p抑制心肌細胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達和心肌細胞凋亡Fig.3 Up-regulation of miR-202-5p inhibits Cleaved Caspase-3 protein expression and cardiomyocyte apoptosis in cardiomyocytes

圖4 上調miR-202-5p對缺氧復氧處理心肌細胞ROS水平、GSH-Px和MDA的含量的影響Fig.4 Up-regulation of miR-202-5p on ROS level，GSHPx and MDA content in myocardial cells treated with hypoxia and reoxygenation

圖5 miR-202-5p靶向調控SOX6表達Fig.5 miR-202-5p targets and regulates SOX6 expression

圖6 上調SOX6部分逆轉miR-202-5p對缺氧復氧處理心肌細胞的保護作用Fig.6 Up-regulation of SOX6 partially reverses protective effect of miR-202-5p on myocardial cells treated with hypoxia and reoxygenation

2.6 上調SOX6部分逆轉miR-202-5p對缺氧復氧處理心肌細胞的保護作用 與缺氧復氧+miR-202-5p+pcDNA組比較,缺氧復氧+miR-202-5p+pcDNASOX6組心肌細胞SOX6和Cleaved Caspase-3蛋白的表達水平顯著升高,Cyclin D1蛋白的表達水平顯著降低,ROS水平顯著升高,MDA含量顯著增加,GSH-Px的含量顯著降低,細胞存活率顯著降低,凋亡率顯著增加(P＜0.05),見圖6。

3 討論

經皮冠狀動脈介入治療能在最短時間內重新打開閉塞的冠狀動脈,顯著降低急性心肌梗死的死亡率,是AMI最重要的治療手段[8]。然而,AMI再灌注治療后引起的I/R問題也變得越來越突出。心肌細胞氧化應激和凋亡在I/R損傷中起著至關重要作用。本研究以大鼠心肌細胞缺氧復氧模型模擬心肌I/R損傷,探索與心肌細胞氧化應激和凋亡有關的基因,以期為治療心肌I/R損傷提供理論依據(jù)。

miR-202-5p在I/R大鼠模型模型和缺氧復氧誘導的乳鼠原代心肌細胞中表達水平顯著降低,上調miR-202-5p可降低血清中心肌酶濃度,降低心肌細胞ROS水平,減少減輕心肌細胞鈣超載,減少心肌梗死面積,減輕大鼠I/R損傷[5]。miR-202-5p在氨誘導的雞心肌細胞損傷中表達下調,并通過調控PTEN/AKT/mTOR途徑影響心臟氧化應激和自噬[9]。本研究表明在缺氧復氧條件下,心肌細胞的存活率顯著降低,細胞凋亡率顯著增加,miR-202-5p的表達水平顯著降低,上調miR-202-5p表達可顯著促進心肌細胞存活,抑制心肌細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)缺氧復氧條件下心肌細胞上清液中ROS和MDA的水平顯著升高,而GSH-Px水平顯著降低。氧化應激是ROS生成與抗氧化系統(tǒng)清除ROS能力之間的平衡失調引起的機體一系列適應性反應,過量的ROS可引起細胞不可逆損傷,導致MDA的積累,MDA含量是反應細胞氧化應激損傷程度的重要指標[10]。GSH-Px是機體重要的抗氧化酶,GSH-PX可有效清除自由基,減輕ROS對機體的進一步損傷[11]。本研究結果顯示上調miR-202-5p可顯著降低心肌細胞ROS和MDA的水平,升高GSH-Px水平。提示上調miR-202-5p可減輕缺氧復氧誘導的心肌細胞氧化應激和凋亡。此外,本研究結果顯示缺氧復氧條件下心肌細胞中Cyclin D1的表達水平顯著降低,Cleaved Caspase-3蛋白的表達水平顯著升高,而上調miR-202-5p表達后Cyclin D1表達水平升高,Cleaved Caspase-3蛋白的表達水平降低,與功能實驗結果相一致。提示上調miR-202-5p可通過減輕缺氧復氧誘導的心肌細胞氧化應激和凋亡發(fā)揮保護作用。

SOX基因家族是一種轉錄因子編碼基因,具有高度保守的HMG盒序列。SOX基因家族可分為10個亞族(A-J),SOX6是SOX D亞組的重要成員[12]。SOX6最初是從成年小鼠睪丸cDNA文庫中分離出來,在心肌細胞發(fā)育和心臟分化過程中發(fā)揮著重要作用[13-14]。在心肌細胞P19CL6分化晚期,SOX6可促進心肌細胞凋亡,miR-19b通過靶向干擾SOX6基因表達,促進P19CL6細胞的增殖抑制細胞凋亡[6,15]。脂多糖刺激可促進心肌細胞中SOX6表達,miR-499通過調控SOX6表達激活Bcl-2通路促進脂多糖誘導的心肌細胞凋亡[16]。miR-499-5p通過抑制SOX6表達還可減輕缺氧復氧誘導的心肌細胞損傷[17]。本研究結果顯示,在缺氧復氧條件下心肌細胞中SOX6的表達水平顯著降低,與SHI等[17]研究發(fā)現(xiàn)一致。同時本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗證實SOX6是miR-202-5p的靶基因,且Western blot顯示miR-202-5p可負性調控SOX6的表達。此外,進一步研究發(fā)現(xiàn)上調SOX6可部分逆轉miR-202-5p對心肌細胞增殖、凋亡和氧化應激水平的影響。提示過表達miR-202-5p通過靶向下調SOX6對缺氧復氧誘導的心肌細胞氧化應激和凋亡發(fā)揮保護作用。

綜上所述,缺氧復氧誘導的心肌細胞中miR-202-5p表達下調,SOX6表達上調。上調miR-202-5p通過靶向SOX6抑制心肌細胞氧化應激水平和缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)為心肌I/R損傷治療提供了新的思路。