高脂飲食誘導肥胖小鼠白色脂肪組織中IL-33的表達及意義①

開 悅 劉 虎 王文茜 宋苗苗 王玉冰 謝 赟 馬藝源 唐 穎 宋向鳳新鄉(xiāng)醫(yī)學院免疫學教研室新鄉(xiāng)453003

肥胖是由遺傳、飲食、生活方式和環(huán)境等多種因素相互作用而引起的一種綜合征[1]。近年來肥胖人數(shù)在全球范圍內(nèi)逐年升高,免疫平衡失調(diào)是其發(fā)病機制之一[2]。脂肪是人體的重要組成部分,按分布部位的不同可將其分為皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪,它們的作用不完全一樣,一般認為內(nèi)臟脂肪的含量與代謝性疾病的關系更為密切[3-4]。IL-33是新發(fā)現(xiàn)的IL-1家族的細胞因子,誘導Th2細胞、ILC2細胞、Treg細胞、M2型巨噬細胞和嗜酸性粒細胞分泌IL-4、IL-5和IL-13[5-6]。近年來一些研究報道IL-33與肥胖發(fā)生的關系,但結(jié)果并不完全一致,而不同類型的白色脂肪組織內(nèi)IL-33的表達情況還未見報道。本研究探討在肥胖發(fā)生發(fā)展中IL-33的表達水平和意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 小鼠胚胎成纖維細胞(前脂肪細胞)3T3-L1細胞株購于北京協(xié)和細胞資源中心。

1.1.2 實驗動物 6～8周齡的C57BL/6雄性小鼠(22～25 g)購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。在恒定的環(huán)境條件下,12 h的明暗交替周期飼養(yǎng),動物自由攝食及飲水。

1.1.3 試劑與儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司,胰島素購于江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司,IL-33 ELISA試劑盒購于美國Biolegend公司,小鼠高脂飼料購于美國Research diets公司,Western blot所用抗體購于美國Abways公司和Proteintech公司,RT-PCR所用試劑盒購于日本TaKaRa公司。倒置顯微鏡購于日本Nikom公司,化學發(fā)光成像儀購于法國Vilber lourmat公司,實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific,Quant-Studio5)購于美國Thermo Fisher Scientific公司,酶標儀(SpectraMax iD3)購于美國Molecdar Devices公司。

1.1.4 基因引物序列 RT-PCR所用的引物堿基序列由上海生工合成,序列如下:β-actin:上游:5′-GAAATAGTGCGTGACATCAAAG-3′,下游:5′-TGTAGTTTCATGGATGCCACAG-3′；IL-33:上游:5′-CGGATCCACTTCACTTTTAACACAGTC-3′,下游:5′-GAGATCTTTAGATTTTCGAGAGCTTA-3′。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及誘導分化 3T3-L1前脂肪細胞按常規(guī)方法培養(yǎng)在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中。誘導分化的誘導劑為含地塞米松、IBMX、胰島素和10%胎牛血清的高糖DMEM。細胞培養(yǎng)和誘導分化條件均為5%CO2和37℃。

1.2.2 實驗動物及造模 6～8周齡的C57BL/6雄性小鼠在SPF級別的動物飼養(yǎng)室中正常飲食適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為對照組(ND)和高脂組(HFD),每組5只小鼠,分別給予充足的正常飼料和高脂飼料飼養(yǎng)10周。在此期間每隔1周稱重,記錄2組小鼠的體重變化。高脂飲食誘導的肥胖小鼠造模成功的標志為HFD組小鼠體重為ND組體重的130%以上。

1.2.3 全自動生化分析儀測血糖血脂 小鼠禁食10 h,麻醉后眼球取血,室溫靜置1 h,待血液自然凝固,分離血清,用全自動生化分析儀檢測小鼠空腹血糖和血脂。

1.2.4 ELISA 按1.2.3方法分離小鼠血清,取2倍稀釋后的血清50μl,按說明書檢測小鼠血清中的IL-33,用雙波長法測定OD值,再根據(jù)標準曲線換算出濃度。

1.2.5 Western blot 小鼠禁食10 h,麻醉后頸椎脫臼法處死小鼠,20 min內(nèi)解剖腹部取出皮下和內(nèi)臟脂肪組織,分別取0.1 g組織在液氮中研磨,用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解組織中的總蛋白,總蛋白變性后電泳、電轉(zhuǎn),封閉后用稀釋1 000倍的一抗孵育過夜,再用5 000倍稀釋后的HRP標記的二抗孵育1 h,化學發(fā)光成像儀檢測總蛋白中目的蛋白的含量。

1.2.6 RT-PCR 按1.2.5方法取出皮下和內(nèi)臟脂肪組織,分別取0.1 g組織在液氮中研磨,TRIzol法提取出組織中的總RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR,檢測出擴增基因片段的Ct值,用2-ΔΔCt法計算出其相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗結(jié)果均采用Graphpad Prism Version 8.1軟件分析,結(jié)果用3次獨立實驗的描述,用Student′st-test比較差異,P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1細胞誘導分化后IL-33的自我調(diào)節(jié)3T3-L1細胞加誘導劑誘導分化10 d后,細胞內(nèi)的IL-33含量明顯升高(圖1A,P＜0.05),但ELISA檢測的細胞培養(yǎng)上清中IL-33含量無顯著變化(圖1B,P＞0.05),與蛋白水平相反的是,細胞在誘導分化后IL-33 mRNA表達下調(diào)(圖1C,P＜0.05)。

2.2 高脂飲食對小鼠脂肪組織的影響 C57BL/6小鼠7周齡開始高脂飲食誘導肥胖模型,高脂飲食HFD小鼠從高脂飲食2周時體重就明顯高于ND小鼠,10周后,HFD小鼠體重遠遠超過ND小鼠(圖2A,P＜0.05)。兩組小鼠的皮下脂肪組織(subcutaneous adipose tissue,SAT)和內(nèi)臟脂肪組織(visceral adipose tissue,VAT)重量也都存在顯著的統(tǒng)計學差異(圖2B,P＜0.05)。

2.3 高脂飲食促使小鼠糖代謝及脂代謝紊亂 高脂飲食10周后,取小鼠血清用比色法檢測空腹血糖和血清脂代謝指標,結(jié)果顯示與ND組的小鼠相比,NFD組的肥胖小鼠空腹血糖水平明顯升高,血清中膽固醇(TC)和高密度脂蛋白(HDL)含量升高(圖3,P＜0.05),但血清中三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白(LDL)無顯著變化。

2.4 高脂飲食誘導的小鼠血清中IL-33水平升高ELISA測定結(jié)果顯示,與ND組的小鼠相比,NFD組肥胖小鼠血清中IL-33含量顯著升高(圖4,P＜0.05)。

2.5 高脂飲食誘導的肥胖小鼠不同類型的白色脂肪組織中IL-33的水平 Western blot的結(jié)果證明,與ND組的小鼠相比,NFD組的肥胖小鼠SAT組織中IL-33的蛋白表達水平升高(圖5A,P＜0.05),而RT-PCR的結(jié)果顯示,HFD小鼠的SAT中IL-33 mRNA的表達反而降低(圖5B,P＜0.05)。與SAT組織相反,HFD小鼠的內(nèi)臟脂肪組織中IL-33的蛋白表達水平比ND小鼠顯著降低(圖5C,P＜0.05),而RT-PCR的結(jié)果顯示,HFD小鼠的VAT中IL-33 mRNA的表達升高(圖5D,P＜0.05)。

圖1 3T3-L1細胞誘導分化對IL-33的影響Fig.1 Effect of 3T3-L1 cells induced differentiation on IL-33

圖2 高脂飲食誘導對小鼠體重和白色脂肪組織的影響Fig.2 Effects of high-fat diet on body weight and white adipose tissue in mice

圖3 高脂飲食誘導的小鼠空腹血糖、血清脂代謝指標的變化Fig.3 Changes of fasting blood glucose and serum lipid metabolism in high-fat diet induced mice

圖4 高脂飲食誘導的小鼠血清中IL-33的水平Fig.4 Serum IL-33 concentrations in high-fat diet induced mice

圖5 高脂飲食誘導的肥胖小鼠不同白色脂肪組織中IL-33的水平Fig.5 IL-33 expression in different white adipose tissue of mice induced by high-fat diet

3 討論

肥胖及其相關疾病的發(fā)病率在世界各地不斷上升。根據(jù)世界衛(wèi)生組織和經(jīng)濟合作與發(fā)展組織的流行病學報告,肥胖是全球第五大死亡原因之一[1]。肥胖及其相關的代謝性疾病已經(jīng)成為目前科學研究的熱點。現(xiàn)在人們已經(jīng)認識到肥胖的心血管風險更多的與身體脂肪分布有關,而不是全身脂肪總量。據(jù)報道中心型肥胖的人比婦臀大肌、外周或女性肥胖的人患肥胖相關疾病的風險更大[3]。與皮下區(qū)域的脂肪不同,出現(xiàn)在胸腔、腹腔、盆腔臟器周圍的脂肪稱為內(nèi)臟脂肪,性腺、腎臟、腸系膜等周圍的脂肪組織均屬VAT。SAT與VAT的脂肪細胞類型、內(nèi)分泌功能、脂解活性和對胰島素及其他激素的反應不同。與SAT相比,VAT具有更多的細胞性、血管性、神經(jīng)支配性,脂肪細胞代謝活性更強,對胰島素更有抵抗力,比SAT更能預測死亡率[3]。所以更多的研究者把目光聚焦在VAT中炎癥與肥胖及其相關代謝性疾病的關系上[4-8]。前期研究也發(fā)現(xiàn)了肥胖可以使VAT內(nèi)的炎癥持續(xù)存在[2]。與VAT不同,SAT表現(xiàn)出一些保護內(nèi)分泌和炎癥的特性,這也許可以解釋為什么有些人長期肥胖卻仍然代謝健康[9]。由此可見,不同部位脂肪組織對肥胖所致慢性炎癥的影響是截然不同的。

IL-33(又稱IL-1F11)是新發(fā)現(xiàn)的IL-1家族的第11位成員,是具有雙效型的炎癥早期誘導劑。IL-33表達在多種細胞類型中,當細胞受應激或炎癥刺激后,會被動釋放或主動分泌IL-33,通過NF-κB和MAPK途徑,可刺激包括Th2細胞、Treg細胞、ILC2細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞在內(nèi)的多種免疫細胞分泌IL-4、IL-5、IL-13[10-13]。IL-33在肥胖過程中對脂肪組織炎癥的發(fā)生起保護作用[6]。據(jù)報道,在肥胖Wistar大鼠和高脂飲食誘導的C57BL/6J肥胖小鼠脂肪組織中IL-33 mRNA表達升高[14-15]。在肥胖小鼠脂肪組織中,IL-33的表達并沒有升高,而肥胖Zucker大鼠脂肪組織中IL-33的mRNA水平反而降低[15-16]。從以上研究可以看出,IL-33在肥胖狀態(tài)下的表達有著不同的結(jié)果,推測這些不同結(jié)果的原因可能是小鼠品系的差別和脂肪組織的類型不同。

本研究探討了IL-33在肥胖發(fā)生中的變化。前脂肪細胞誘導分化后的成熟脂肪細胞IL-33蛋白水平升高,細胞培養(yǎng)上清中IL-33含量無明顯變化,所以細胞在誘導成熟過程中合成的IL-33并沒有分泌至胞外,而是貯存在細胞內(nèi),待細胞應激或損傷后作為警報素釋放出來[8,17]。3T3-L1細胞內(nèi)組成性表達的IL-33隨著脂質(zhì)的增多不斷積累,其mRNA的表達反而下降,這說明IL-33在細胞儲存脂質(zhì)的過程中,存在自身基因水平的負反饋調(diào)節(jié)。利用高脂飲食誘導C57BL/6成年雄性小鼠10周,建立小鼠肥胖模型,與同周齡正常飲食的小鼠相比,肥胖小鼠的體重、SAT和VAT的重量均明顯升高,代謝指標紊亂。實驗數(shù)據(jù)表明IL-33在肥胖小鼠血清和皮下脂肪組織中含量增多,這與細胞實驗結(jié)果一致,說明肥胖時機體能通過上調(diào)IL-33來糾正其帶來的炎癥代謝紊亂。VAT中的IL-33含量下降,證明了VAT在肥胖的炎癥中起到與SAT正好相反的促進作用[3,9]。另外,皮下和內(nèi)臟脂肪組織中IL-33的mRNA相對表達水平與其蛋白水平的趨勢相反,這與細胞實驗結(jié)果正好吻合,說明脂肪組織內(nèi)部也存在負反饋機制,以調(diào)節(jié)IL-33蛋白水平的表達失衡。

總之,在肥胖狀態(tài)下IL-33在不同類型的白色脂肪組織內(nèi)表達是不同的,這與脂肪沉積的部位有關,而且在脂肪組織中存在的負反饋機制可能對肥胖及其相關疾病的發(fā)生起到抑制的作用。