基于生物信息學(xué)分析探究盤狀紅斑狼瘡的關(guān)鍵通路、基因及免疫細胞浸潤①

魏姍姍 閆 璐 邱賢文 賴 寬 米向斌 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院皮膚科廣州510280

紅斑狼瘡(lupus erythematosus,LE)是一種自身免疫性疾病,其發(fā)病機制尚不清楚,主要分為盤狀紅斑狼瘡(discoid lupus erythematosus,DLE)、亞急性皮膚型LE和系統(tǒng)性LE,其中DLE是較常見的類型,占皮膚型LE的50%～85%。DLE病因不明,可能與免疫學(xué)改變、遺傳、紫外線照射等多種因素相關(guān),主要表現(xiàn)為頭面、頸部等出現(xiàn)邊界清楚的盤狀紅斑或斑塊,伴輕度瘙癢,部分患者可出現(xiàn)輕度關(guān)節(jié)疼痛及光過敏等癥狀[1]。目前臨床上多采用糖皮質(zhì)激素、抗瘧藥等對癥治療,雖然取得了一定療效,但仍存在皮膚黏膜萎縮、感染和復(fù)發(fā)等風(fēng)險,影響患者免疫功能、外觀和生活質(zhì)量,極少數(shù)患者演變?yōu)槠渌つw惡性腫瘤[2]。隨著高通量研究方法的應(yīng)用,高通量數(shù)據(jù)分析及信息篩選成為重要研究手段[3]。本文通過挖掘NCBI的基因表達匯編(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫中DLE的基因芯片數(shù)據(jù)(GSE81071),將微陣列技術(shù)與生物信息學(xué)分析相結(jié)合,篩選差異表達基因(differential expressed genes,DEGs),采用DAVID、STRING、CIBERSORT等數(shù)據(jù)庫進行DLE相關(guān)DEGs的功能富集分析、信號通路分析及核心基因識別[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)DLE發(fā)病與局部免疫細胞浸潤密切相關(guān),傳統(tǒng)的DEGs研究方法側(cè)重于單個基因,本文首次采用CIBERSORT對其進行22種免疫細胞浸潤分析,旨在更深入地了解DLE的發(fā)病機制,為尋找其治療靶點和預(yù)防新方案提供方向。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù) 從GEO數(shù)據(jù)庫GSE81071獲取數(shù)據(jù)集,基于GPL19983平臺([HuGene-2_1-st]Affymetrix Human Gene 2.1 ST Array),由Berthier CC等提交,包括60個樣本,其中DLE皮膚組織47例和正常皮膚組織13例。

1.2 DEGs篩選 采用R語言對芯片數(shù)據(jù)進行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化、匯總和探針質(zhì)量控制,下載注釋包進行ID轉(zhuǎn)換,提取表達矩陣,加載limma包,以P＜0.05、|logFC|＞1.5為標(biāo)準(zhǔn)篩選DEGs,繪制熱圖和火山圖。

1.3 功能富集分析 采用DAVID在線工具對DEGs進行功能富集分析,上傳DEGs至列表后,得到生物學(xué)過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細胞成分(cellular component,CC)及KEGG通路的富集分析結(jié)果。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 采用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建DEGs相應(yīng)PPI,綜合得分＞0.7的蛋白具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用生物信息學(xué)繪圖軟件Cytoscape(3.7.2)中的CytoHubba插件計算各蛋白節(jié)點的連接程度并進行多種算法評分,采用5種算法篩選核心基因[5-6]。

1.5 免疫細胞浸潤矩陣分析 采用R軟件和CIBERSORT(https://cibersort.stanford.edu/)及其提供的22種免疫細胞轉(zhuǎn)錄特征矩陣得到DLE表達譜矩陣[7]。對其進行1 000次模擬計算,獲得22種免疫細胞浸潤分布。篩選P＜0.05的樣本進行后續(xù)分析。

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選 共篩選出214個DEGs,其中上調(diào)基因178個,下調(diào)基因36個。采用R語言繪制熱圖,見圖1。

2.2 GO功能富集和KEGG通路分析 GO分析顯示,DEGs主要富集的BP:免疫應(yīng)答、固有免疫應(yīng)答、防御反應(yīng)、對其他生物的防御反應(yīng)和對外界生物刺激的反應(yīng)；主要富集的CC:細胞膜外側(cè)面、膜側(cè)、細胞表面、循環(huán)系統(tǒng)免疫球蛋白復(fù)合物和血液微粒；主要富集的MF:dsRNA結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合、2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性、趨化因子活性和CXCR3趨化因子受體結(jié)合,見表1。

KEGG分析顯示,DEGs主要富集于麻疹、甲型流感病毒、單純皰疹感染、細胞因子-細胞因子受體相互作用、丙型肝炎和Toll樣受體信號通路,見表1。

圖1 DEGs熱圖Fig.1 Heatmap of DEGs

2.3 PPI分析 共篩選115個節(jié)點蛋白,499條邊,綜合得分＞0.7,P＜1.0E-16,采用5種算法對PPI網(wǎng)絡(luò)進行計算與篩選,選取各算法前10位基因,見表2。采用韋恩圖取5種算法結(jié)果交集,最終篩選出STAT1和OAS1 2個核心基因,STAT1網(wǎng)絡(luò)結(jié)節(jié)點數(shù)為32,OAS1網(wǎng)絡(luò)節(jié)點數(shù)為31,均＞30,說明2個基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中與其他基因的聯(lián)系更強,因此較其他基因可能發(fā)揮更關(guān)鍵的作用。

2.4 免疫細胞浸潤分布 通過CIBERSORT反卷積法計算并最終得到48個可信樣本,見圖2A,左邊5個為正常組,其余43個為DLE組。免疫細胞浸潤分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),M0型巨噬細胞在各組織中均不表達。圖2B(左邊5個為正常組,其余43個為DLE組)進一步展示了22種免疫細胞的浸潤比例(對應(yīng)顏色模塊大小表示占總免疫細胞比例),其中活化的NK細胞、M2型巨噬細胞及CD8+T細胞在兩組中占總免疫細胞的比例均較高。

2.5 免疫細胞浸潤差異分析 免疫細胞浸潤差異分析顯示,活化的CD4+記憶T細胞(P=0.014)、M1型巨噬細胞(P=0.005)在DLE中表達顯著上升,而活化的DCs表達顯著降低,見圖3。

表1 DEGs GO富集分析和KEGG通路分析結(jié)果Tab.1 GO enrichment and KEGG pathway analysis results of DEGs

表2 5種算法獲得的排名前10的核心基因Tab.2 Top 10 hub genes from five centrality methods

圖2 DLE及正常組皮膚組織中免疫相關(guān)細胞的浸潤組成Fig.2 Infiltration composition of immune-associated cells in DLE and normal skin tissues

圖3 DLE組與正常組免疫細胞浸潤分析Fig.3 Infiltration analysis of immune cells in DLE group and normal group

3 討論

隨著高通量芯片技術(shù)的應(yīng)用,生物信息學(xué)方法可以更加快速、高效地篩選出與疾病發(fā)生發(fā)展機制相關(guān)的核心基因,為疾病的診斷、治療及新藥物設(shè)計提供了依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集于細胞膜外側(cè)面、膜側(cè)和細胞表面中,通過調(diào)節(jié)dsRNA結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合與活性等參與免疫應(yīng)答、固有免疫應(yīng)答、防御反應(yīng)等BP,與DLE的發(fā)病機制相關(guān)[8-9]。既往研究發(fā)現(xiàn),DLE皮損區(qū)炎癥細胞因子(如IL-1、IFN-γ、IL-6)及細胞內(nèi)黏附分子、趨化因子高表達,促進免疫細胞募集至皮膚[9]。KEGG信號通路分析顯示,DEGs主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用、Toll樣受體、病毒感染等信號通路。細胞因子-細胞因子受體相互作用通路中表皮巨噬細胞、T細胞和其他細胞相互作用產(chǎn)生IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-17等多種細胞因子和趨化因子,通過多種途徑放大炎癥因子效應(yīng),導(dǎo)致固有免疫和適應(yīng)性免疫相互干擾,參與DLE發(fā)生發(fā)展[9-10]。Toll樣受體信號通路中,Toll樣受體通過巨噬細胞、T細胞等免疫細胞對先天性和后天性免疫應(yīng)答起重要作用,研究表明DLE可通過Toll樣受體通路促進功能性CD11c+NK等新興淋巴細胞生成引發(fā)強大的先天免疫應(yīng)答[11]。

目前關(guān)于麻疹和LE的研究較少,部分報道稱麻疹患者LE發(fā)病率較健康對照組提高,但具體機制需進一步研究[12]。研究顯示,與對照組相比,狼瘡小鼠在甲型流感病毒急性感染過程中產(chǎn)生更多的特異性T細胞,雖然感染期間不會加快疾病進展,但病毒清除后持續(xù)的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致病情加重[13]。

本研究采用5種算法計算取交集得到2個核心基因,其中OAS1又稱寡腺苷酸合成酶1,可被dsRNA激活作用于寡聚化ATP酶調(diào)節(jié)2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性。OAS1是IFN的調(diào)控基因,可通過調(diào)控IFN活性而在細胞因子-細胞因子受體相互作用、Toll樣受體、病毒感染等通路中發(fā)揮重要作用。STAT1是一種可與DNA結(jié)合的蛋白家族,可通過調(diào)控及反調(diào)控多種細胞因子和生長因子起免疫調(diào)節(jié)作用。既往研究表明,IFN-α、dsRNA可激活JAK1-STAT1通路調(diào)控LE患者T、B細胞活化、抗體分泌、自噬等。靶向JAK/STAT蛋白可同時抑制多種細胞因子(如IFN-α、IFN-γ)治療LE[14]。此外,CHONG等[15]在DLE患者皮膚組織中發(fā)現(xiàn)STAT1表達升高,且與巨噬細胞功能和活性相關(guān)。

綜上可知,DEGs與免疫應(yīng)答、固有免疫應(yīng)答、細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子等密切相關(guān),研究證實表皮中的T細胞、活化的DCs、巨噬細胞、B淋巴細胞和其他細胞相互作用產(chǎn)生多種細胞因子和趨化因子與DLE進展密切相關(guān)[9-10]。本研究采用CIBERSORT對DLE皮膚組織中的22種免疫細胞進行浸潤分析。CIBERSORT被稱為計算機流式細胞術(shù),是一種新興的基因表達譜分析方法,反卷積算法輸入模式化的細胞轉(zhuǎn)錄表達矩陣可重建組織測序中各種原始細胞類型和數(shù)量,已成功應(yīng)用于癌癥和癌旁組織免疫細胞浸潤狀態(tài)分析,揭示腫瘤異質(zhì)性對癌癥的影響[7,16]。本研究首次將CIBERSORT應(yīng)用于DLE皮膚組織的免疫細胞浸潤分析,相比于正常組織,DLE組織活化的CD4+記憶T細胞、M1型巨噬細胞數(shù)明顯增加,而活化的DCs明顯減少。LE患者血液系統(tǒng)和DLE皮膚組織中,CD4+、CD8+記憶及效應(yīng)T細胞比例均較正常組升高,DLE患者局部皮膚微環(huán)境TGF-β、IL-2、IL-17等炎癥因子可提高CD4+記憶T細胞比例和增殖活化,但由于活化性CD4+記憶T細胞獲取困難,在DLE中的報道較少[8]。M1型巨噬細胞是可高效呈遞抗原的iNOS表型特征分子,可分泌IL-1β、IL-10、TNFα等多種細胞因子,在LE發(fā)病過程中具有重要作用[17]。M1和M2型巨噬細胞可由局部免疫刺激和病原體作用而極化,如Toll樣受體和IFN-γ可誘導(dǎo)M1極化,而IL-4/IL-13、免疫復(fù)合物(M2b)、IL-10可誘導(dǎo)M2極化[18]。M1/M2的極化狀態(tài)和相互作用與機體通路、細胞因子相關(guān),DLE DEGs主要通過病毒防御和Toll樣受體信號通路影響DLE發(fā)展,同時可誘導(dǎo)巨噬細胞由M2型向M1型極化。DCs是目前功能最為強大的專職抗原提呈細胞,在LE患者中的增殖活化存在爭議,最近一項單細胞組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),LE患者血液系統(tǒng)中DCs數(shù)顯著多于對照組,且與疾病活動度相關(guān)；但也有報道稱LE患者血液系統(tǒng)中DCs比例顯著降低,且漿細胞樣DCs與LE疾病活動及狼瘡腎損傷相關(guān)[19-20]。MéNDEZREGUERA等[21]研究發(fā)現(xiàn),DLE患者皮膚組織中傳統(tǒng)DCs增加,且低表達PD-L1和高表達CCR6。本研究通過免疫細胞浸潤研究發(fā)現(xiàn)DLE患者皮膚組織中活化的DCs較正常組減少,其具體機制尚不清楚,可能由于表皮中活化的CD4+記憶T細胞或巨噬細胞可誘導(dǎo)DCs凋亡,或分泌的細胞因子抑制DCs產(chǎn)生、成熟和聚集。

綜上所述,本研究采用多種生物信息學(xué)方法探討了DLE可能的發(fā)病機制,DEGs主要通過細胞因子-細胞因子受體相互作用、病毒防御等調(diào)控局部炎癥反應(yīng),進而作用于M1巨噬細胞和活化的CD4+記憶T細胞和DCs參與DLE發(fā)生發(fā)展。本研究篩選出的2個核心基因STAT1、OAS1和3個免疫細胞,后續(xù)將采用前瞻性大樣本研究進一步篩查DLE的高靈敏性、特異性的診斷標(biāo)記物以減少創(chuàng)傷性檢查,為DLE的早期診斷和靶向藥物研究提供參考。