超高效合相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測食用植物油中12種長鏈甘油三酯

楊光勇，郭蒼亭，薛 光，郭金喜

(1.新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830011；2.烏魯木齊市 疾病預(yù)防控制中心，新疆 烏魯木齊 830026)

食用植物油是人體攝取亞麻酸等生物活性物質(zhì)的重要來源，亦是醫(yī)藥、食品加工等行業(yè)獲取油脂原料的主要方式，高品質(zhì)的食用植物油是確保人體營養(yǎng)健康和產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要保證。甘油三酯(Triacylglycerols,TAGs)是植物油的主要成分，不同結(jié)構(gòu)的TAGs對人體的生理作用存在很大差別[1-2]。因此，準(zhǔn)確測定食用植物油中各TAGs的含量對于評價油脂品質(zhì)、保障消費(fèi)者飲食營養(yǎng)健康等具有重要意義。

目前，油脂中TAGs的檢測方法主要有高溫氣相色譜法[3-4]、液相色譜法[5-6]、多維色譜法[7-8]、高溫氣相色譜-質(zhì)譜法[9-10]、液相色譜-質(zhì)譜法[11-13]、高分辨質(zhì)譜直接進(jìn)樣法[14-16]等。由于多不飽和脂肪鏈在高溫下極易發(fā)生熱裂解，因此高溫氣相色譜僅能用于分離飽和度較高的TAGs。液相色譜法存在污染排放高、方法開發(fā)難度大、分析時間長、分離效率較低等問題。多維色譜法能有效改善TAGs的分離效果，但操作繁雜，當(dāng)使用兩種不同的保留機(jī)理進(jìn)行分析時，還需考慮兩維溶劑的兼容性，難以實(shí)現(xiàn)高通量分析。高分辨質(zhì)譜直接進(jìn)樣法分析速度快、通量高，但該法未對樣品進(jìn)行色譜分離，測定時各TAGs會相互干擾，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，且所用設(shè)備較為昂貴，不易普及。超高效合相色譜(Ultra performance convergence chromatography,UPC2)是以超臨界CO2為主要流動相的色譜系統(tǒng)，具有分離效率高、分析條件溫和等優(yōu)勢，可有效彌補(bǔ)以上方法的不足，已被成功應(yīng)用于TAGs的定性鑒別[17-18]、脂溶性化合物的定量分析[19-20]等方面。

食用植物油中TAGs的種類繁多，使定量檢測工作變得異常困難，因此現(xiàn)有的大多數(shù)研究均采用面積歸一化法計算各組分的相對含量。但一些研究[21-22]及本實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，TAGs分子上的脂肪酰碳鏈長度與不飽和度對其離子化效率有很大影響，如果分析時僅考慮峰面積而忽略質(zhì)譜響應(yīng)差異，則會使定量結(jié)果出現(xiàn)很大偏差，無法反映樣品中各TAGs的真實(shí)含量。針對以上情況，本文首次采用UPC2-MS/MS結(jié)合外標(biāo)法對食用植物油中12種長鏈TAGs進(jìn)行檢測和精確定量，各TAGs的分離效果良好，定量結(jié)果準(zhǔn)確，為測定食用植物油中甘油酯類化合物提供了綠色環(huán)保、準(zhǔn)確高效的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPC2-TQS超高效合相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司),XS205DU電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘油酯(PLO)、三亞油酸甘油酯(LLL)、1,2-亞油酸-3-油酸甘油酯(LLO)、1,2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯(LLP)、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯(POL)、1,2-油酸-3-棕櫚酸甘油酯(OOP)、1,2-油酸-3-亞油酸甘油酯(OOL)、三油酸甘油酯(OOO)、1,2-亞麻酸-3-亞油酸甘油酯(LLnLn)、1,2-亞油酸-3-亞麻酸甘油酯(LLLn)、1,2-亞麻酸-3-油酸甘油酯(OLnLn)、1,2-亞油酸-3-硬脂酸甘油酯(LLS)標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Nu-Chek公司、Sigma-Aldrich公司、加拿大TRC公司；正己烷、甲醇為色譜純，購自美國Thermo Fisher公司；甲酸、氨水(25%～28%)為優(yōu)級純，購自Sigma-Aldrich公司。食用植物油樣品購自市場。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 儀器條件色譜條件：色譜柱為兩支串聯(lián)的HSS C18SB柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱溫為40 ℃；流動相：A為超臨界CO2，B為甲醇(含0.1%甲酸)；流速為1.5 mL/min。洗脫梯度程序：0～1.0 min，0.2%B；1.0～9.0 min，0.2%～4.0%B；9.0～10.0 min，4.0%～20%B；10.0～13.0 min，20%B；13.0～14.0 min，20%～0.2%B。系統(tǒng)背壓為12.76 MPa；進(jìn)樣體積為5 μL。

質(zhì)譜參數(shù):電噴霧電離源，正離子(ESI+)、多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；離子源溫度:150 ℃；去溶劑氣：流速750 L/h，溫度300 ℃；毛細(xì)管電壓為2.0 kV；補(bǔ)償液為97%甲醇水溶液(含0.2%氨水)，流速為0.3 mL/min。12種TAGs的保留時間、母離子和子離子見表1。

表1 12種TAGs的保留時間、母離子及子離子Table 1 Retention times,parent ions and daughter ions of the 12 kinds of TAGs

*quantitative ion

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液：準(zhǔn)確稱取12種TAGs標(biāo)準(zhǔn)品各50.0 mg，分別用正己烷制成10 g/L的單標(biāo)儲備液；再準(zhǔn)確吸取各單標(biāo)儲備液1 mL至100 mL容量瓶中，用正己烷稀釋并定容至刻度，制成各組分質(zhì)量濃度均為100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。上述溶液保存于-18 ℃冰箱。

樣品溶液：稱取充分混勻的食用植物油0.1 g(精確至0.000 1 g)，用正己烷溶解并定容至100 mL，再準(zhǔn)確吸取該溶液1 mL，用正己烷稀釋至100 mL，過0.22 μm濾膜。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇12種TAGs均為長鏈脂肪酸酯，各TAGs之間的結(jié)構(gòu)和極性極為相似，多個化合物的母離子及部分子離子的質(zhì)荷比(m/z)均相同，給選擇色譜柱帶來一定難度。實(shí)驗(yàn)考察了3種填料的UPC2色譜柱：HSS C18SB(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、Torus 1-AA(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)、BEH(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)對12種TAGs分離效果的影響。其中HSS C18SB色譜柱是經(jīng)過改進(jìn)的反相色譜柱，對酯類化合物具有很好的保留能力；Torus 1-AA色譜柱的填料為鍵合1-氨基蒽的硅膠顆粒，可提供偶極、誘導(dǎo)偶極、π-π等多種作用，具有較好的選擇性；BEH色譜柱填裝了亞乙基橋雜化顆粒，對各TAGs單體間的極性差異較為敏感。結(jié)果表明，選用BEH色譜柱時各組分的色譜峰均互相包埋或形成肩峰；Torus 1-AA色譜柱無法分離互為位置異構(gòu)體的目標(biāo)化合物；HSS C18SB色譜柱對各TAGs的分離效果最為明顯，但經(jīng)優(yōu)化其他色譜條件后仍無法實(shí)現(xiàn)POL和PLO的基線分離。因此，實(shí)驗(yàn)選擇串聯(lián)兩支HSS C18SB色譜柱(總長度為200 mm)進(jìn)行測定。

2.1.2 色譜柱溫度及系統(tǒng)背壓的選擇色譜柱溫度和系統(tǒng)背壓的變化會改變超臨界CO2的密度，從而影響其洗脫能力。通常情況下，隨著柱溫升高、背壓減小，流動相的密度變小，化合物的保留時間延長，但柱溫升高會增大分子的能量，縮短化合物的保留時間。因此，柱溫對化合物的保留行為具有雙重影響。分別考察了不同柱溫(20、30、40、50、60 ℃)、不同背壓(12.07、12.76、13.45、14.13 MPa)對12種TAGs分離效果的影響。結(jié)果表明，隨著柱溫升高，各TAGs的分離趨勢增加，當(dāng)柱溫超過40 ℃后，分離趨勢反而降低;各組分的分離效果并未隨系統(tǒng)背壓的改變而出現(xiàn)明顯變化。綜合考慮分離度、系統(tǒng)壓力極限等因素，選取柱溫為40 ℃，系統(tǒng)背壓為12.76 MPa。

2.1.3 流動相改性劑的選擇為改變超臨界CO2對化合物的溶解和洗脫能力，需在流動相中引入適量甲醇、乙腈等溶劑作為改性劑。常用改性劑在UPC2中的洗脫能力大小為：甲醇>異丙醇>乙腈。為獲得最佳色譜峰形，實(shí)驗(yàn)選用洗脫強(qiáng)度較高的甲醇作為改性劑。同時，為消除游離脂肪酸等化合物與未鍵合硅醇羥基的氫鍵作用，降低其色譜峰拖尾對TAGs測定的干擾，在甲醇改性劑中加入0.1%甲酸，并進(jìn)一步優(yōu)化洗脫梯度。

圖1 12種TAGs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(5 mg/L) 的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion current chromatogram of the 12 kinds of TAGs mixed standard solution(5 mg/L) peak numbers denoted were the same as those inTable 1

圖2 補(bǔ)償液中氨水(A)和純水(B)的體積分?jǐn)?shù) 對2種TAGs峰高的影響Fig.2 Effects of volume fraction of ammonium hydroxide(A) and water(B) in compensation solution on the peak heights of the 2 kinds of TAGs the numbers denoted were the same as those inTable 1

在優(yōu)化色譜條件下，利用UPC2-MS/MS對12種TAGs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(5 mg/L)進(jìn)行掃描，其提取離子流色譜圖見圖1。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 采集參數(shù)的確定將各標(biāo)準(zhǔn)儲備液用含0.2%氨水的甲醇溶液適當(dāng)稀釋后，依次注入三重四極桿質(zhì)譜儀，開啟儀器自動優(yōu)化功能，采用自動優(yōu)化所得的錐孔電壓、碰撞能量和駐留時間等參數(shù)。

2.2.2 補(bǔ)償液組成及流速的優(yōu)化補(bǔ)償液由柱塞泵輸送至色譜柱后端，主要用于傳輸化合物至質(zhì)譜儀，并促使其離子化。補(bǔ)償液不參與色譜分離，但其流速和組成對化合物的色譜峰形、離子化效率等均有較大影響。為獲得較好的響應(yīng)強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)選用質(zhì)子化試劑甲醇作為補(bǔ)償液，并在甲醇中加入添加劑以促進(jìn)TAGs離子加合物的形成。張星河等[18]的研究證實(shí)，TAGs的銨加合物具有較好的質(zhì)譜響應(yīng)。因此，實(shí)驗(yàn)以不飽和度差異最大的LLnLn和OOP為研究對象，考察了含不同體積分?jǐn)?shù)氨水(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)的甲醇補(bǔ)償液在不同流速(0.1、0.2、0.3、0.4 mL/min)下對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)補(bǔ)償液流速為0.3 mL/min，氨水體積分?jǐn)?shù)為0.2%時，目標(biāo)化合物的色譜峰形和響應(yīng)達(dá)到最佳(見圖2A)。

此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在含0.2%氨水的甲醇補(bǔ)償液中加入適量純水可進(jìn)一步提高方法的靈敏度，比較了添加不同含量(1%、2%、3%、4%、5%、6%)純水時目標(biāo)化合物的峰高(圖2B)，可知純水的最佳含量為3%；當(dāng)純水含量超過5%后，系統(tǒng)壓力波動明顯，設(shè)備不穩(wěn)定，可能因?yàn)樗母弑葻崛菔瓜到y(tǒng)動態(tài)背壓閥無法正?？販?，或管路中形成雙相流動相所致。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量下限用正己烷配制各組分質(zhì)量濃度均為0.030、0.035、0.10、0.25、0.75、2.5、5.0、10、20 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)UPC2-MS/MS測定后，以目標(biāo)物的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，12種TAGs在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)≥0.990 2。稱取適量樣品，按“1.2.2”處理后進(jìn)行測定，以測試溶液中各目標(biāo)化合物的信噪比(S/N)分別為3和10時計算檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，12種TAGs的LOD和LOQ分別為1.0～8.0 mg/g和3.0～25 mg/g(見表2)。

2.3.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差稱取0.05 g(精確至0.000 1 g)亞麻籽油樣品，加入適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使處理后的最終測試溶液中LLnLn、LLLn、OLnLn、OOP的加標(biāo)濃度為500 μg/L，其他TAGs的加標(biāo)濃度為50 μg/L。共制備9份加標(biāo)樣品進(jìn)行測定，得到平均回收率(n=9)為95.7%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%～4.2%(見表2)。

表2 12種TAGs的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Linear relations,LODs,LOQs,recoveries and RSDs of the 12 kinds of TAGs

y:peak area;x:mass concentration,μg/L;the numbers denoted were the same as those in
Table 1

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(500 μg/L)，按“1.2.1”方法連續(xù)進(jìn)樣6針，得到12種TAGs峰面積的RSD(n=6)為0.48%～1.9%，保留時間的RSD(n=6)為0.12%～0.96%。將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測定5 d，每天進(jìn)樣1次，得到各TAGs峰面積的RSD(n=5)為1.1%～2.7%，保留時間的RSD(n=5)為0.90%～2.3%，表明儀器的日內(nèi)和日間精密度均良好。

表3 樣品中12種TAGs的含量(mg/g)Table 3 Contents of 12 kinds of TAGs in the samples(mg/g)

-:less than LOQ;the numbers denoted were the same as those in
Table 1

2.4 實(shí)際樣品的測定

按照建立的方法對6份食用植物油樣品進(jìn)行分析，以外標(biāo)法定量。12種TAGs在菜籽油、花生油、亞麻籽油中的含量見表3。由表3可知，各品種植物油中12種TAGs含量差異較大。其中，花生油和菜籽油中OOO的含量最高，其次為OOL，而低不飽和度的甘油三酯含量較低;亞麻籽油中則含有豐富的高不飽和度甘油三酯(如OLnLn、LLnLn等)。

3 結(jié) 論

本文采用UPC2-MS/MS建立了食用植物油中12種長鏈TAGs含量的檢測方法，并對考察范圍以外的其他TAGs進(jìn)行了分析。該法快速準(zhǔn)確，靈敏度高，專屬性好，綠色環(huán)保，基質(zhì)兼容性強(qiáng)，可有效分離當(dāng)量碳數(shù)相同甚至互為位置異構(gòu)體的TAGs，較傳統(tǒng)方法極具優(yōu)勢，對保障植物油食用安全、評價其物理化學(xué)性質(zhì)及營養(yǎng)價值等具有重要意義。該法也可用于食用植物油中其他酯類化合物的測定。

圖3 亞麻籽油樣品的提取離子流色譜圖(A，m/z=869.3)及保留時間分別為4.91 min(B)、 5.03 min(C)化合物的子離子掃描圖Fig.3 Extracted current chromatogram of the flaxseed oil(A，m/z=869.3),product ion scan spectra of the compound with retention time of 4.91 min(B) and 5.03 min(C)