細(xì)胞間黏附分子-1在CD4+T細(xì)胞輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體中的作用和臨床意義

趙倩，張美玉，季萍，汪佳遠(yuǎn)，王樹軍，劉帥#，王穎#

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200127；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所，上海200025

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種由抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病，好發(fā)于育齡期女性，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，多系統(tǒng)受累［1］。研究［2］顯示，B細(xì)胞過度活化產(chǎn)生的多種自身抗體可與抗原形成免疫復(fù)合物沉積于多組織臟器，是SLE發(fā)病的主要機(jī)制。由于B細(xì)胞的活化及抗體的產(chǎn)生離不開T細(xì)胞的協(xié)助和參與，因此研究T-B淋巴細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制對(duì)于闡明SLE的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族，是介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間黏附的主要黏附分子之一［1］。表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）表面的ICAM-1可通過與T細(xì)胞表面配體結(jié)合增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附，從而為T細(xì)胞表面T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）與APC表面主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）-抗原肽的相互識(shí)別提供前期準(zhǔn)備［3-4］。在多種自身免疫性疾病中，CD4+T細(xì)胞的異?；罨０殡S其表面多種分子的異常高表達(dá)，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［5］、多發(fā)性硬化癥［6］等疾病的發(fā)生均伴隨ICAM-1分子表達(dá)上調(diào)。而這些自身免疫性疾病的發(fā)生過程往往伴隨有自身抗體的產(chǎn)生。因此，作為一個(gè)重要的黏附分子，CD4+T細(xì)胞表面的ICAM-1是否參與了T-B淋巴細(xì)胞間相互作用以促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，從而造成大量免疫復(fù)合物沉積、推動(dòng)SLE疾病進(jìn)程，值得研究者們進(jìn)行更深入的探究。

本研究通過比較ICAM-1在不同人群的CD4+T細(xì)胞表面的表達(dá)水平，分析其與SLE發(fā)生的相關(guān)性，初步探討該分子參與CD4+T-B淋巴細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制及其對(duì)抗體產(chǎn)生的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及其資料收集、SLE患者分組

選取2018年10月—2020年5月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕科門診/住院的SLE患者50例（SLE組），其診斷標(biāo)準(zhǔn)符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（American College of Rheumatology，ACR）修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。選取同一時(shí)間段內(nèi)仁濟(jì)醫(yī)院體檢中心的健康人60例（健康對(duì)照組，即HC組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡為18～60歲。②既往無基礎(chǔ)疾病史。③既往無自身免疫性疾病史。

收集2組對(duì)象的年齡、性別、血紅蛋白等基本資料，以及SLE組患者的病程、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、抗 核 抗 體（antinuclear antibody，ANA）和抗雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）抗體水平、補(bǔ)體C3和C4水平、血清特異性抗體IgG和IgM水平、系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)度指數(shù)（systemiclupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）等實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)。同時(shí)，依據(jù)SLE患者活動(dòng)度的血清學(xué)指標(biāo)ESR和抗dsDNA，將SLE患者分為輕度活動(dòng)者、中度活動(dòng)者及重度活動(dòng)者。

1.2 主要試劑和儀器

淋巴細(xì)胞分離液（Axis Shield，瑞典），RPMI-1640培養(yǎng)基（Merck Millipore，德國），α-CD3/28磁珠（美天旎，德國），抗人CD3-APC-Cy7、抗人CD4-Percp、抗人CD19-PE-Cy7、抗 人ICAM-1-FITC、抗 人CD3-Percpcy5.5（Biolegend，美國），抗人CD3-Percp-cy5.5、抗人CD4-BV510（BD，美國），可溶性ICAM-1（soluble ICAM-1，sICAM-1）細(xì)胞因子檢測試劑盒（上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司），人CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞分選試劑盒（STEMCELL Technologies，加拿大）。

LSR Fortessa流式細(xì)胞儀（BD，美國），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國），無菌超凈工作臺(tái)（Labconco，美國），倒置熒光顯微鏡（Olympus，日本），低溫水平離心機(jī)（HITACHI，日本）。

1.3 研究方法

1.3.1外周血單個(gè)核細(xì)胞分離分別采集2組對(duì)象的外周 血3～5 mL，經(jīng) 乙 二 胺 四 乙 酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝后，于350×g離心5 min收集血漿，并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩⑷パ獫{后的血細(xì)胞置于離心管內(nèi)，加入5 mL淋巴細(xì)胞分離液，于800×g離心22 min，取中間云霧層樣外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）備用。

1.3.2 PBMCs中CD4+T細(xì)胞的活化取10例健康人PBMCs（1×106/100μL），按照1（磁珠數(shù)）∶4（細(xì)胞數(shù)）的比例向其中加入α-CD3/28磁珠，混勻后添加至96孔U板，并以完全培養(yǎng)基補(bǔ)充體積至200μL/孔。將刺激活化時(shí)間設(shè)置為24、48、72 h，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中行細(xì)胞培養(yǎng)，而后收集該3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞及上清液待用。

1.3.3外周血CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)檢測將去血漿后的血細(xì)胞（“1.3.1”中獲得）置于1.5 mL離心管中，向管內(nèi)加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，于4℃避光孵育10 min，4 000×g離心2 min，棄上清液；加入1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），離心后洗滌2次；加入50μL經(jīng)PBS稀釋后的抗體工作液（含抗人CD3-APC-Cy7、抗人CD4-Percp、抗人CD19-PE-Cy7及抗人ICAM-1-FITC），4℃避光孵育30 min后離心，棄上清液后向每管加入200μL PBS重懸混勻，于BD LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀上進(jìn)行檢測，采用FlowJo軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。同樣地，針對(duì)從“1.3.2”中收集的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的CD4+T細(xì)胞，其表面ICAM-1的表達(dá)也采用上述方法進(jìn)行檢測。

1.3.4血清中sICAM-1含量檢測按照sICAM-1細(xì)胞因子檢測試劑盒說明書的操作流程，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測18例SLE患者和26例健康人血清以及10例健康人的PBMCs（經(jīng)α-CD3/28刺激后）培養(yǎng)上清中sICAM-1的含量。

1.3.5 CD4+T細(xì)胞-B細(xì)胞體外共培養(yǎng)及其分組按照人CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞分選試劑盒說明書，從5例健康人PBMCs中分選獲得B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞。取2×106/100μL CD4+T細(xì)胞，按照1∶1的比例加入α-CD3/28磁珠，以完全培養(yǎng)基補(bǔ)充體積至200μL，而后將其置于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h。分別取經(jīng)α-CD3/28磁珠刺激和未刺激的CD4+T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105/mL；將分選的B細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，按照以下方案設(shè)置CD4+T-B細(xì)胞共培養(yǎng)體系組：①刺激組：經(jīng)α-CD3/28磁珠刺激的CD4+T細(xì)胞50μL+B細(xì)胞50μL。②對(duì)照組：未經(jīng)α-CD3/28磁珠刺激的CD4+T細(xì)胞50μL+B細(xì)胞50μL+同型對(duì)照抗體（終濃度為5μg/mL）。③阻斷抗體處理組：α-CD3/28磁珠刺激的CD4+T細(xì)胞+B細(xì)胞50μL+ICAM-1阻斷抗體（終濃度為5μg/mL）。每孔補(bǔ)充培養(yǎng)基至200μL，混勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d后，收集上清液待用。

1.3.6上清液中IgG檢測按照人IgG檢測試劑盒說明書的操作流程檢測刺激組、對(duì)照組、阻斷抗體處理組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IgG的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)后，符合正態(tài)分布的以x±s表示，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)比較；不符合正態(tài)分布的以M（Q1，Q3）表示。采用Pearson和Spearman相關(guān)系數(shù)對(duì)SLE患者CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)水平（ICAM-1+CD4+T/%）、sICAM-1含量與外周病理因子（包括ESR、ANA、抗dsDNA抗體、補(bǔ)體C3和C4、血清IgG和IgM、SLEDAI）水平進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的基本資料、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及SLE患者分組

2組研究對(duì)象的基本資料及SLE患者的實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)具體見表1。同時(shí)，根據(jù)ESR、抗dsDNA等指標(biāo)，將SLE患者分為輕度活動(dòng)者（ESR為0～30 mm/h、dsDNA為0～30 U/mL）、中度活動(dòng)者（ESR為31～60 mm/h、dsDNA為31～60 U/mL）及重度活動(dòng)者（ESR為61～100 mm/h、dsDNA為61～100 U/mL）。

表1 2組對(duì)象的基本資料和實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)Tab 1 Basic data and laboratory test indexes of the two groups

2.2 2組對(duì)象的外周血CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1水平分析

我們首先采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)2組對(duì)象的外周血CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1水平進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖1）顯示，與健康人比較，SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)水平及ICAM-1在CD4+T細(xì)胞表面的平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）均 較 高（P=0.034，P=0.001）；根據(jù)SLE患者的活動(dòng)度進(jìn)一步分組后發(fā)現(xiàn)，隨著疾病活動(dòng)度的增加，患者外周血CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)水平呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，但3組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)水平與外周病理因子水平的相關(guān)性分析

對(duì)SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞ICAM-1表達(dá)水平與外周病理因子水平的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）顯示CD4+T細(xì)胞ICAM-1表達(dá)水平與ESR呈顯著正相關(guān)（P=0.004，r=0.457），與SLEDAI、血清IgG和IgM含量無明顯相關(guān)性。

圖1 SLE組和HC組外周血CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1的表達(dá)分析Fig 1 Expression of ICAM-1 on peripheral blood CD4+T cells in the SLE group and HC group

圖2 SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)水平與外周病理因子水平的相關(guān)性分析Fig 2 Correlation between ICAM-1 expression on the surface of CD4+T cells and peripheral pathological factors in SLE patients

2.4 2組對(duì)象的血清sICAM-1水平分析

采用ELISA法檢測18例SLE患者和26例健康人血清中sICAM-1含量，結(jié)果（圖3）顯示，與健康人比較，SLE患者血清中sICAM-1的平均含量較高（P=0.001）；在不同活動(dòng)度的SLE患者間，血清sICAM-1含量隨疾病活動(dòng)度增加而升高，其中輕度活動(dòng)者與重度活動(dòng)者的血清sICAM-1含量間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.039）。

圖3 SLE組和HC組血清sICAM-1含量分析Fig 3 Analysis of serum sICAM-1 levels in the SLE group and HC group

2.5 SLE患者血清sICAM-1與病理因子的相關(guān)性分析

對(duì)SLE患者血清sICAM-1含量與外周病理因子水平的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4）顯示sICAM-1的含量與抗dsDNA抗體、IgG水平呈正相關(guān)（均P＜0.05）。

圖4 SLE患者血清sICAM-1含量與外周病理因子水平的相關(guān)性分析Fig 4 Correlation between serum sICAM-1 level and peripheral pathological factors in SLE patients

2.6 健康人PBMCs中CD4+T細(xì)胞活化后ICAM-1及sICAM-1的表達(dá)水平

為進(jìn)一步探討SLE患者外周ICAM-1的表達(dá)升高與CD4+T細(xì)胞活化之間的關(guān)系，本研究采用α-CD3/28磁珠刺激健康人PBMCs以模擬SLE患者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞異常活化的現(xiàn)象，隨后通過流式細(xì)胞術(shù)和ELISA法分別檢測CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)水平和上清液中sICAM-1的含量。結(jié)果（圖5）顯示，隨著刺激時(shí)間的增加，活化的CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)水平逐漸上升，其中刺激48、72 h后ICAM-1的表達(dá)百分比高于刺激24 h（P=0.002，P=0.001）；同時(shí)，上清液中sICAM-1的含量也隨著刺激時(shí)間的延長呈逐步升高的趨勢(shì)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。上述結(jié)果表明，CD4+T細(xì)胞的活化可顯著增加細(xì)胞表面ICAM-1的表達(dá)及sICAM-1水平，與我們?cè)赟LE患者中觀察到的CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)水平和sICAM-1含量升高相一致。

圖5不同刺激時(shí)間下CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1的表達(dá)水平和培養(yǎng)上清液中sICAM-1的含量Fig 5 Expression of ICAM-1 on the surface of CD4+T cells and the content of sICAM-1 in culture supernatant with different stimulation time

2.7 ICAM-1對(duì)活化CD4+T細(xì)胞輔助B細(xì)胞產(chǎn)生IgG的影響

和本課題組既往研究［8］一致，我們對(duì)刺激組、對(duì)照組和阻斷抗體處理組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IgG水平進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖6）顯示，刺激組上清液中的IgG水平高于對(duì)照組（P=0.033），但是加入ICAM-1阻斷抗體后，上清液中IgG水平有所下降（P=0.041）。上述結(jié)果表明，活化24 h后的CD4+T細(xì)胞可以促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，而阻斷ICAM-1的表達(dá)后則可減弱該促進(jìn)作用。

3 討論

SLE作為一種典型的抗體介導(dǎo)的自身免疫病，以T細(xì)胞和B細(xì)胞的過度活化以及自身抗體的產(chǎn)生為主要發(fā)病機(jī)制之一。因此，了解T細(xì)胞-B細(xì)胞間相互作用、B細(xì)胞分化機(jī)制將為SLE致病機(jī)制的闡明和新的干預(yù)策略的提出打開局面。本研究結(jié)果顯示，SLE患者的CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1的表達(dá)水平較高，和健康人CD4+T細(xì)胞被活化后的升高相一致；本研究還發(fā)現(xiàn)，活化的CD4+T細(xì)胞可促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG，阻斷ICAM-1的表達(dá)則可減低IgG的水平。從上述結(jié)果我們推測，活化CD4+T細(xì)胞或可通過上調(diào)ICAM-1的表達(dá)以促進(jìn)B細(xì)胞的活化從而導(dǎo)致IgG的分泌增多。

圖6 CD4+T細(xì)胞-B細(xì)胞體外共培養(yǎng)上清液中IgG的表達(dá)水平Fig 6 Expression of IgG in the supernatant of CD4+T cells-B cells co-culture in vitro

細(xì)胞黏附是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用的一個(gè)重要的生物學(xué)行為。介導(dǎo)黏附的黏附分子家族可以參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［9］、免疫應(yīng)答［10］及控制腫瘤惡化、轉(zhuǎn)移［4］等多種生理病理過程。研究顯示，ICAM-1在APC輔助T細(xì)胞的活化及分化［11］、淋巴細(xì)胞的伸展和移動(dòng)［12］中發(fā)揮重要作用，如該分子可通過與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）作用增加細(xì)胞間的黏附從而促進(jìn)T細(xì)胞的活化［13］。在B細(xì)胞的活化過程中，位于生發(fā)中心的濾泡輔助性T細(xì)胞（follicular helper T cell，Tfh）表面的LFA-1可通過與B細(xì)胞表面的ICAM-1相結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化［14］，繼而表明LFA-1-ICAM-1分子可促進(jìn)T-B細(xì)胞的相互作用及抗體的產(chǎn)生。在多種以自身抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病如SLE［15］、天皰瘡［16］、橋本氏甲狀腺炎［17］中，CD4+T細(xì)胞均呈現(xiàn)活化的狀態(tài)。而我們的研究結(jié)果也顯示，無論是SLE患者來源的還是健康對(duì)照者來源的CD4+T細(xì)胞，經(jīng)過TCR/CD28活化后其表面ICAM-1和sICAM-1的水平均有顯著增加；同時(shí)，在SLE病理狀態(tài)下，患者CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1與反映疾病活動(dòng)度ESR指標(biāo)呈顯著正相關(guān)性，sICAM-1與抗dsDNA抗體、IgG水平亦呈顯著的正相關(guān)性。由此可見，不同形式的ICAM-1可能都是SLE發(fā)病進(jìn)程中的重要效應(yīng)分子，而存在于血清中的sICAM-1相較細(xì)胞表面的ICAM-1具有更為穩(wěn)定、便于檢測的優(yōu)勢(shì)，因此其或?qū)⒊蔀樵u(píng)估SLE患者疾病活動(dòng)度的重要生物標(biāo)志物。

在本研究中，我們利用CD4+T細(xì)胞-B細(xì)胞體外共培養(yǎng)系統(tǒng)，模擬CD4+T細(xì)胞-B細(xì)胞的相互作用。結(jié)果顯示，體外活化的CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞共培養(yǎng)12 d后，可明顯提高培養(yǎng)上清液中的IgG水平，而加入ICAM-1阻斷抗體后，上清液中IgG水平顯著下降；繼而表明活化的CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1分子在促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG中發(fā)揮了重要的作用。來自于小鼠的研究表明，B細(xì)胞的活化、分化均依賴于T-B細(xì)胞相互作用中的多種分子，如CD40-CD40L［18］、ICOS-ICOSL［19］等。

本研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞活化后其表面ICAM-1分子表達(dá)發(fā)生上調(diào)，該上調(diào)的分子可通過增加CD4+T細(xì)胞與B細(xì)胞間的相互作用促進(jìn)B細(xì)胞分泌IgG；一旦這種相互作用被阻斷，B細(xì)胞產(chǎn)生IgG的能力則會(huì)顯著下降。綜合上述結(jié)果可推斷，在SLE病理?xiàng)l件下，相較于未活化的CD4+T細(xì)胞，經(jīng)過自身抗原識(shí)別激活后的CD4+T細(xì)胞通過上調(diào)其表面ICAM-1分子表達(dá)或可獲得與B細(xì)胞競爭結(jié)合優(yōu)勢(shì)。然而由于實(shí)驗(yàn)的局限性，有關(guān)ICAM-1促進(jìn)T-B細(xì)胞間相互作用的確切分子機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究顯示ICAM-1可通過增加CD4+T細(xì)胞-B細(xì)胞間的相互作用，促進(jìn)抗體IgG的分泌。因此，阻斷CD4+T細(xì)胞表面ICAM-1分子，或可為尋找SLE治療的潛在靶點(diǎn)打開新思路。

參·考·文·獻(xiàn)

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