廣東省甘蔗褐斑病菌(Cercospora longipes)的生物學特性

高小寧 孫輝 李婷 齊永文

摘要：以廣東省甘蔗褐斑病菌（Cercospora longipes）CL12分離株為對象，研究了溫度、pH值、培養(yǎng)基種類、不同碳源和氮源對菌株菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的影響，為進一步研究甘蔗尾孢引起的褐斑病的發(fā)生規(guī)律和防治藥劑篩選奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，CL12分離株的菌絲在供試的10種培養(yǎng)基上都可以生長，但表現(xiàn)出較大差異;其中PDA和PSA培養(yǎng)基有利于菌絲生長，而MS和N6培養(yǎng)基不適合該菌生長。以Czapek培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，果糖作為碳源、牛肉膏和酵母粉作為氮源最適宜病菌的菌絲生長。菌絲生長的溫度范圍為5～35 ℃，最適溫度為25 ℃;菌絲生長最適pH值為5，在pH值為4.0～10.0均可生長;分生孢子萌發(fā)的溫度范圍為15～35 ℃，pH值為4.0～10.0，最適萌發(fā)條件為 25 ℃，pH值為6.0。

關(guān)鍵詞：甘蔗;甘蔗尾孢菌;培養(yǎng)特性;孢子萌發(fā);碳源;氮源

中圖分類號：S435.661 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）07-0115-04

收稿日期：2020-07-15

基金項目：廣東省科學院研究所績效考核引導專項（編號：2020GDASYL-20200302005）;廣東省甘蔗劍麻產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目（編號：2019KJ104-05）;廣東省重點領(lǐng)域研發(fā)計劃（編號：2019B020238001）

作者簡介：高小寧（1978—），女，陜西岐山人，博士，副教授，從事甘蔗病害研究。Tel：（020）34397561;E-mail：gxn336@126.com。

通信作者：齊永文，博士，研究員，從事甘蔗遺傳育種研究。Tel：（020）84178036;E-mail：yongwen2001@163.com。

甘蔗（Saccharum spp.）是我國最重要的糖料作物，而病害是影響甘蔗生產(chǎn)的重要因素。目前世界上已經(jīng)報道的甘蔗病害達130種，我國記錄的甘蔗侵染性病害已超過50種[1]，其中由真菌引起的褐銹病（brown rust）、梢腐?。╬okkah boeng）、褐條?。╞rown stripe）、褐斑?。╞rown spot）等葉部病害在我國蔗區(qū)發(fā)生普遍，對甘蔗生產(chǎn)造成了嚴重威脅。由甘蔗尾孢（Cercospora longipes E. E. Butler）引起的甘蔗褐斑病[2]于1906年首次在印度發(fā)現(xiàn)，目前在世界甘蔗產(chǎn)區(qū)廣泛分布。褐斑病主要危害甘蔗葉片，發(fā)病初期受害葉片呈黃色小斑點，隨后擴大形成具有黃色暈圈的長梭形紅褐色病斑，田間濕度較大時，葉片背面產(chǎn)生灰色霉層，嚴重發(fā)病可導致葉片提前枯死，呈現(xiàn)“火燒”狀，從而給甘蔗生產(chǎn)造成嚴重損失[3]。褐斑病作為甘蔗的主要葉部病害之一，前期研究人員對該病害在我國不同蔗區(qū)的分布和危害情況進行了大量的調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)該病害在我國蔗區(qū)廣西、云南、廣東、貴州、海南等地廣泛分布，常年危害，對甘蔗正常生長產(chǎn)生了一定的影響[4-8]，并評價了幾種化學藥劑對該病害的防治效果，發(fā)現(xiàn)苯甲·嘧菌酯對甘蔗褐斑病表現(xiàn)出良好的防效[5]。然而，已有研究中缺少對其病原菌生物學特性的相關(guān)報道。

了解病菌的生物學特性是深入理解病害發(fā)生規(guī)律的基礎(chǔ)，進而為病害的有效防控提供理論依據(jù)。在前期研究中，筆者從廣東省翁源縣采集甘蔗褐斑病病樣并對其病菌進行分離鑒定和致病性測定，獲得1株甘蔗尾孢（C. longipes）分離株CL12。因此，本研究以分離株CL12為對象，研究溫度、pH值以及營養(yǎng)條件對其菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的影響，以期為進一步研究病害發(fā)生流行規(guī)律，制定防治技術(shù)方案奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：甘蔗尾孢（C. longipes）CL12分離株，按常規(guī)方法在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上繁殖、保存?zhèn)溆?。菌株CL12生物學特性測定試驗于2019年在廣東省科學院生物工程研究所進行。

供試培養(yǎng)基及其配方：PDA（200 g/L馬鈴薯、20 g/L 葡萄糖、15 g/L瓊脂粉）、PSA（200 g/L馬鈴薯、20 g/L蔗糖、15 g/L瓊脂粉）、MEA（30 g/L麥芽浸粉、3.0 g/L大豆蛋白胨、15 g/L瓊脂粉）、CAM（2.0 g/L玉米浸粉、15 g/L瓊脂粉）、Czapek（3 g/L NaNO3、1 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O、0.5 g/L KCl、0.01 g/L FeSO4、30 g/L蔗糖、15 g/L瓊脂粉）、LBA（10 g/L NaCl、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、15 g/L瓊脂粉）、YPD（20 g/L葡萄糖、20 g/L 蛋白胨、10 g/L酵母粉、15 g/L瓊脂粉）、N6[2 830 mg/L KNO3、463 mg/L （NH4）2SO4、166 mg/L CaCl2·2H2O、185 mg/L MgSO4·7H2O、400 mg/L KH2PO4、27.8 mg/L FeSO4·7H2O、4.4 mg/L MnSO4·4H2O、1.6 mg/L ZnSO4·7H2O、0.8 mg/L H2BO3、1.6 mg/L KI、2 mg/L甘氨酸、0.5 mg/L煙酸]、MS[1 900 mg/L KNO3、1 650 mg/L （NH4）2SO4、170 mg/L KH2PO4、370 mg/L MgSO4·7H2O、440 mg/L CaCl2·2H2O、0.83 mg/L KI、6.2 mg/L H2BO3、22.3 mg/L MnSO4·4H2O、8.6 mg/L ZnSO4·7H2O、0.25 mg/L Na2MoO4·2H2O、0.25 mg/L CuSO4·5H2O、0.025 mg/L CoCl2·6H2O、37.25 mg/L Na2EDTA、27.85 mg/L FeSO4·7H2O、100 mg/L肌醇、2 mg/L甘氨酸、0.5 mg/L 煙酸、0.5 mg/L鹽酸吡哆醇、0.1 mg/L鹽酸硫胺素、30 g/L蔗糖、15 g/L瓊脂粉]、WA（15 g/L瓊脂）。上述培養(yǎng)中的N6和MS購自Sigma公司，其他培養(yǎng)基均按照配方進行配制;配制好的培養(yǎng)基于滅菌鍋中121 ℃濕熱高壓滅菌20 min后備用。

1.2 營養(yǎng)條件對菌絲生長的影響

1.2.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 在培養(yǎng) 20 d 的分離株CL12菌落邊緣，用滅菌打孔器取直徑5 mm的菌餅，分別轉(zhuǎn)接于PDA、PSA、MEA、CAM、Czapek、LBA、YPD、N6、MS和WA等10種不同培養(yǎng)基制成的平板中央。將培養(yǎng)皿置于25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫避光培養(yǎng)，每處理3次重復。采用“十”字交叉法每7 d測量菌落直徑，觀察并記錄菌落形態(tài)[9]。

1.2.2 不同碳源對菌絲生長的影響 以Czapek培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，分別以等量的葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、可溶性淀粉、麥芽糖、山梨醇和肌醇替代其中的蔗糖，制成不同碳源培養(yǎng)基。按照“121”節(jié)所描述的方法進行病菌的接種、培養(yǎng)、觀察菌落生長情況并測量菌落直徑。每處理重復3次。

1.2.3 不同氮源對菌絲生長的影響 以Czapek培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，分別以等量的牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、甘氨酸、NH4Cl、NH4NO3和Ca（NO3）2替代其中NaNO3，制成不同氮源培養(yǎng)基。按照“1.2.1”節(jié)所描述的方法進行病菌的接種、培養(yǎng)、觀察菌落生長情況并測量菌落直徑。每處理重復3次。

1.3 培養(yǎng)條件對菌絲生長的影響

1.3.1 溫度對菌絲生長的影響 以PDA作為培養(yǎng)基，將接菌的培養(yǎng)皿分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃下培養(yǎng)。按照“1.2.1”節(jié)所描述的方法進行病菌的接種、培養(yǎng)、觀察菌落生長情況并測量菌落直徑。每處理重復3次。

1.3.2 pH值對菌絲生長的影響 用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH，將PDA培養(yǎng)基的pH值調(diào)制成4、5、6、7、8、9、10。按照“1.2.1”節(jié)所描述的方法進行病菌的接種、培養(yǎng)、觀察菌落生長情況并測量菌落直徑。每處理重復3次。

1.4 培養(yǎng)條件對分生孢子萌發(fā)的影響

1.4.1 溫度對分生孢子萌發(fā)的影響 用玉米葉粉碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基（MLPCA）培養(yǎng)分生孢子，用無菌水配制為每視野（10×40）20～30個分生孢子的懸浮液，采用凹孔載玻片法進行孢子萌發(fā)試驗[9]。將裝有分生孢子懸浮液的凹玻片分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃下，于3、6 h鏡檢分生孢子萌發(fā)情況，計算萌發(fā)率。每處理重復3次。

1.4.2 pH值對分生孢子萌發(fā)的影響 用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH，將無菌水配制成pH值為4、5、6、7、8、9、10共7個梯度的溶液。按照“1.4.1”節(jié)的方法進行分生孢子萌發(fā)試驗。每處理重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)條件對甘蔗尾孢CL12分離株菌絲生長的影響

2.1.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 由表1可知，甘蔗尾孢菌在供試的10種培養(yǎng)基上均可生長，但生長情況差異較大。從菌落形態(tài)和生長速度來看，PDA、PSA、YPD較適宜于甘蔗尾孢的菌絲生長，其次為CAM和MEA;在WA上菌絲極為稀疏，而MS和N6培養(yǎng)基不適合甘蔗尾孢的菌絲生長。

2.1.2 不同碳源對菌絲生長的影響 由表2可知，分離株CL12能夠利用多種單糖、多糖和可溶性淀粉作為碳源，不同碳源對其菌絲生長有一定影響。在供試的8種碳源中， 果糖是甘蔗尾孢菌的最佳碳源，葡萄糖、麥芽糖和肌醇次之，其對可溶性淀粉的利用較差。

2.1.3 不同氮源對甘蔗尾孢菌菌絲生長的影響 甘蔗尾孢菌菌絲在不同氮源培養(yǎng)基中的生長情況（表3）表明，分離株CL12能夠不同程度地利用無機氮源和有氮源，但不同氮源對病菌菌絲生長影響顯著。供試菌株最適氮源為牛肉膏和酵母粉，其次為蛋白胨，對NH4Cl和NH4NO3的利用較差。

2.2 培養(yǎng)條件對甘蔗尾孢CL12分離株菌絲生長的影響

2.2.1 溫度對菌絲生長的影響 不同溫度對甘蔗尾孢CL12分離株菌絲生長的測試結(jié)果（圖1）表明，該分離株在5～35 ℃溫度范圍內(nèi)均可生長，高于 35 ℃ 不能生長，最適生長溫度為25 ℃。

2.2.2 pH值對菌絲生長的影響 分離株CL12在4.0～10的7個pH值梯度條件下均可生長，對pH值表現(xiàn)出較廣的適應范圍，其中在pH值為5的條件下菌落直徑最大，表明該分離株比較適合偏酸的生長環(huán)境（圖2）。

2.3 培養(yǎng)條件對甘蔗尾孢CL12分離株分生孢子萌發(fā)的影響

2.3.1 溫度對分生孢子萌發(fā)的影響 甘蔗尾孢CL12分離株的分生孢子萌發(fā)率在不同溫度下存在較大差異（圖3）。該菌株分生孢子在15～35 ℃溫度范圍內(nèi)均可萌發(fā)，最適萌發(fā)溫度為25 ℃，高于 35 ℃ 或低于10 ℃均不能萌發(fā)。

2.3.2 pH值對菌絲生長的影響 甘蔗尾孢分離株CL12的分生孢子在pH值4～10的7個梯度條件下均可正常萌發(fā)（圖4），表現(xiàn)出較廣pH值適應性;其中pH值在5～9的范圍內(nèi)，分生孢子萌發(fā)率均高于85%。

3 結(jié)論與討論

尾孢菌類真菌是無性型真菌絲孢菌綱，絲孢目，由Fresenius在1863年建立[10]。尾孢菌屬（Cercospora Fresen.）是重要的植物病原菌，可危害植物的不同部位，形成明顯的壞死斑[11]。該類真菌能夠侵染多種農(nóng)作物和經(jīng)濟作物，致使受害植物出現(xiàn)葉片枯黃，提前落葉、落花、落果，嚴重影響作物生長，造成一定的經(jīng)濟損失[12]。由玉蜀黍尾孢菌（C. zeae-maydis Tehon et Daniels）引起的玉米灰斑病在我國廣泛分布，已經(jīng)成為玉米生產(chǎn)種的重要問題[13];甜菜尾孢菌（C. beticola）引起的褐斑病是甜菜生產(chǎn)中的重要葉部病害，在全世界嚴重發(fā)生[14]。由甘蔗尾孢菌（C. longipes）引起的甘蔗褐斑病在我國蔗區(qū)均有分布，是經(jīng)常發(fā)生且造成危害的主要葉部病害之一。

然而，尾孢菌在人工培養(yǎng)基上生長緩慢，導致對甘蔗褐斑病的研究僅停留在對病害的田間調(diào)查，缺少對其病菌的生物學特性的研究，從而限制了對該病害侵染過程和發(fā)病規(guī)律的認識。因此，本試驗通過對甘蔗尾孢CL12分離株的培養(yǎng)形狀、溫度、pH值的適應性以及不同營養(yǎng)利用情況的研究，明確其基本生物學特性。研究結(jié)果表明，CL12分離株對溫度有較廣的適應性，5～35 ℃均可生長，但其20～25 ℃ 的最適生長溫度相同，這與甘蔗生長及其褐斑病發(fā)生區(qū)域的氣候條件相一致。但與劉可杰等報道的玉米尾孢病菌在10～30 ℃范圍內(nèi)均可生長[15]，略有不同。同時，研究發(fā)現(xiàn)該病菌對不同營養(yǎng)的利用差異顯著。CL12分離株在PDA、PSA、YPD等培養(yǎng)基上生長良好，菌落生長速度較快，菌絲致密;在WA培養(yǎng)基上雖然菌落擴展速度最快，但菌絲非常稀疏，其生長特性與已經(jīng)報道的玉米灰斑病菌基本一致[15]。同時，研究發(fā)現(xiàn)果糖、牛肉膏和酵母粉是甘蔗尾孢CL2分離株最適合的碳源、氮源;而對于玉米尾孢病菌，可溶性淀粉和麥芽糖是其最佳碳源，說明不同的尾孢菌的營養(yǎng)利用情況有較大差異。本試驗通過對甘蔗褐斑病菌生物學特性的研究，基本明確了甘蔗尾孢菌適宜的培養(yǎng)條件和營養(yǎng)條件。然而，由于本試驗只針對從廣東省分離獲得的1株甘蔗尾孢菌的培養(yǎng)特性進行分析，那么病菌群體的不同菌株間、不同地區(qū)的菌株間是否存在差異，還須進一步研究。

參考文獻：

[1]魯國東，黎常窗，潘崇忠，等. 中國甘蔗病害名錄[J]. 甘蔗，1997，4（4）：19-23.

[2]郭英蘭，劉錫琎. 中國真菌志（第二十四卷：尾孢屬） [M]. 北京：科學出版社，2005.

[3]李增平，張樹珍. 海南甘蔗病蟲害診斷圖譜[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2014：18-19.

[4]韋金菊，鄧展云，黃誠華，等. 廣西甘蔗主要真菌病害調(diào)查初報[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，2012，43（9）：1316-1319.

[5]龍友華，劉洋洋，吳小毛，等. 貴州甘蔗真菌病害初步調(diào)查及褐斑病防治藥劑篩選[J]. 植物保護，2015，41（4）：186-190.

[6]尹 炯，李文鳳，羅志明，等. 云南甘蔗病蟲害發(fā)生危害新特點及防控對策[J]. 中國農(nóng)學通報，2018，34（32）：119-124.

[7]熊國如，李增平，趙婷婷，等. 海南蔗區(qū)甘蔗病害種類及發(fā)生情況[J]. 熱帶作物學報，2010，31（9）：1588-1595.

[8]黃鴻能. 廣東蔗區(qū)甘蔗病害種類和分布的調(diào)查及其主要病害的防治[J]. 甘蔗糖業(yè)，1987（5）：50-52.

[9]方中達. 植病研究方法[M]. 3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：140-154.

[10]Chupp C. A monograph of the fungus genus Cercospora[M]. New York：Ithaca，1954：1-667.

[11]Agrios G N. Plant Pathology[M]. 5th ed. New York：Elsevier Academic Press，2005：385-614.

[12]謝學文，趙 倩，郭英蘭. 尾孢菌屬和假尾孢菌屬新紀錄種[J]. 菌物學報，2017，36（8）：1164-1167.

[13]劉慶奎，秦子惠，張小利，等. 中國玉米灰斑病病原菌的鑒定及其基本特征研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2013，46（19）：4044-4057.

[14]鄒鋒康，丁廣洲，賈海倫，等. 甜菜褐斑病及種質(zhì)資源抗性研究進展[J]. 中國糖料，2019，41（4）：63-69.

[15]劉可杰，徐 婧，胡 蘭，等. 引起玉米灰斑病的2種尾孢菌生物學特性比較[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2016，47（3）：342-346.