GC/MS法分析α，β－不飽和醛類(lèi)香料的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物

席 輝，任勝超，盧斌斌，柴國(guó)璧，曾世通，王丁眾，伍錦鳴，孫世豪*，王 華*，趙瑞峰，宗永立

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001 2.廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，廣州市荔灣區(qū)東沙環(huán)翠南路88號(hào) 510385

α，β-不飽和醛類(lèi)香料是重要香原料中的一類(lèi)，這類(lèi)香料在食品添加劑名單GB 2760—2014中收錄60多種［1］，在煙草制品中也有廣泛應(yīng)用［2-3］。這類(lèi)香料因其α，β-不飽和結(jié)構(gòu)而具有較強(qiáng)的活性，易受到環(huán)境條件的影響，該類(lèi)化學(xué)改變時(shí)常會(huì)引起香料產(chǎn)品品質(zhì)的改變以致引起安全風(fēng)險(xiǎn)的增加［4-7］。因此，了解這類(lèi)香料在環(huán)境中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，針對(duì)性建立有效檢測(cè)方法并實(shí)施有效監(jiān)測(cè)，對(duì)于該類(lèi)香料產(chǎn)品的品控具有重要意義。

通常情況下，一種化學(xué)物質(zhì)在自然存放的條件下發(fā)生化學(xué)轉(zhuǎn)化的過(guò)程緩慢，開(kāi)展相關(guān)研究通常要借助因素實(shí)驗(yàn)。因素實(shí)驗(yàn)是化學(xué)原料藥穩(wěn)定性研究中的重要方法之一。開(kāi)展因素實(shí)驗(yàn)一個(gè)重要目的就是了解影響化合物發(fā)生轉(zhuǎn)化的環(huán)境因素及可能的轉(zhuǎn)化途徑與產(chǎn)物，為建立轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析方法提供科學(xué)依據(jù)［8］。為了縮短轉(zhuǎn)化產(chǎn)物形成的過(guò)程，因素實(shí)驗(yàn)通常在較為極端的條件（例如溫度大于60℃）下進(jìn)行［9］。大量研究［10-14］顯示，溫度通常是影響一種化學(xué)產(chǎn)品在環(huán)境中發(fā)生化學(xué)轉(zhuǎn)化的重要因素。在存放條件下，香料的穩(wěn)定性也主要受溫度、濕度、含氧量、光照等環(huán)境因素影響，其中溫度是最易于發(fā)生改變的環(huán)境因素之一。

理論上，單獨(dú)存放的α，β-不飽和醛類(lèi)化合物發(fā)生化學(xué)變化主要源自于環(huán)境中氧氣引發(fā)的自身氧化反應(yīng)，產(chǎn)物主要是α，β-不飽和酸［15］。對(duì)于有機(jī)酸的分析一般采用先提取后甲酯化，再借助GC/MS分析的方式。但在這種相對(duì)劇烈的衍生化條件下，樣品中的不飽和醛可能會(huì)對(duì)不飽和酸產(chǎn)生干擾，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，需要尋找更為合適的不飽和酸分析方法。本研究中以常見(jiàn)的7種α，β-不飽和醛類(lèi)香料為研究對(duì)象，借助氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）方法考察溫度因素實(shí)驗(yàn)下α，β-不飽和醛類(lèi)香料的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并針對(duì)主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物建立定量分析方法，旨在為α，β-不飽和醛類(lèi)香料產(chǎn)品的品質(zhì)監(jiān)控提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)室室溫存放的11個(gè)香料樣品，分別由北京工商大學(xué)、河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司、上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)提供，其中，北京工商大學(xué)提供了反式-2-戊烯醛、反式-2-己烯醛、反式-2-辛烯醛、反式-2-壬烯醛和反式-2-癸烯醛5個(gè)香料樣品；河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供了反式-2-己烯醛、反式-2-十一烯醛和肉桂醛3個(gè)香料樣品；上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)也提供了反式-2-己烯醛、反式-2-十一烯醛和肉桂醛3個(gè)香料樣品。實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存樣品的初始純度和生產(chǎn)廠家與標(biāo)準(zhǔn)樣品一致。

反式-2-戊烯醛（97%，北京伊諾凱科技有限公司）；反式-2-己烯醛、反式-2-癸烯醛（98%，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）；反式-2-辛烯醛（95%）、肉桂醛（99%）（北京百靈威科技有限公司）；反式-2-壬烯醛、反式-2-十一烯醛［95%，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司］；反式-2-戊烯酸（≥95.0%）、反式-2-癸烯酸（≥95.0%）、反式-2-辛烯酸（≥98.0%）、反式-2-壬烯酸（≥92.0%）、反式-3-己烯酸（≥95.0%，內(nèi)標(biāo)）（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；反式-2-己烯酸（≥98.0%，上海梯希愛(ài)化成工業(yè)公司）；反式-2-十一烯酸（≥95.0%，美國(guó)Sigma公司）；肉桂酸（≥99.0%）、二氯甲烷（色譜純）、乙醇（色譜純）（德國(guó)Merck公司）。上述標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)存條件為0～4℃避光冷藏。

Agilent 7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（上海蘇盈試驗(yàn)儀器有限公司）；AB104-S電子天平［感量0.000 1 g，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；2 mL白色色譜瓶（美國(guó)Agilent公司）；10 mL容量瓶、Transferpette S移液器（德國(guó)Brand公司）。

1.2 方法

1.2.1 因素實(shí)驗(yàn)

參照化學(xué)原料穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中因素實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行因素實(shí)驗(yàn)，具體步驟：取7種α，β-不飽和醛類(lèi)樣品各0.5 mg，分別置于2 mL無(wú)色透明色譜瓶中，置于相對(duì)濕度（RH）（60±5）%、溫度（80±2）℃的藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中，存放2（周）后取出，進(jìn)行下一步分析。

1.2.2 樣品制備及分析

α，β-不飽和醛轉(zhuǎn)化產(chǎn)物定性分析樣品的制備：取經(jīng)過(guò)因素實(shí)驗(yàn)的樣品，直接向每個(gè)色譜瓶中移入1 mL二氯甲烷，振蕩溶解后，即為α，β-不飽和醛轉(zhuǎn)化產(chǎn)物定性分析樣品。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液：取反式-3-己烯酸，以乙醇為溶劑，配制成濃度為22.0μg/mL的溶液，即為內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精確稱取一定量7種α，β-不飽和酸置于10 mL容量瓶中，以內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液為溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液；在標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液的基礎(chǔ)上，采用等比稀釋的方式配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，即為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存香料產(chǎn)品分析用樣品的制備：精確稱取實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存香料產(chǎn)品，以內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液為溶劑，配制成0.5 mg/mL溶液，采用GC/MS法進(jìn)行樣品分析。分析條件：

色譜柱：DB-WAXETR毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm i.d.×0.25μm d.f.）；載氣：He，99.999%；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量：1μL；進(jìn)樣模式：分流進(jìn)樣，分流比10∶1；升溫程序：50℃電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：280℃；溶劑延遲時(shí)間：10 min；掃描模式：定性分析采用全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍50～400 amu；定量分析采用SIM模式。各目標(biāo)物的定量和定性離子如表1所示。

表1 GC/MS分析7種α，β-不飽和酸的SIM掃描參數(shù)Tab.1 SIM parameters of GC/MS for seven α，β-unsaturated acids

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對(duì)α，β-不飽和醛類(lèi)香料的影響

通常情況下，化合物在環(huán)境中的穩(wěn)定性除受自身結(jié)構(gòu)因素影響外，還受存放環(huán)境因素影響，其中溫度是主要影響因素之一。以反式-2-己烯醛為例，其在不同溫度下存放時(shí)的質(zhì)量百分比變化如圖1所示?？梢钥闯?，在不同溫度下，反式-2-己烯醛的量均會(huì)隨存放時(shí)間的增加逐漸減少；在相同存放時(shí)間內(nèi)，溫度越高，其質(zhì)量百分比下降幅度越大。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，含有與反式-2-己烯醛類(lèi)似的α，β-不飽和醛類(lèi)香料均具有類(lèi)似特征。這表明，α，β-不飽和醛類(lèi)香料在環(huán)境存放過(guò)程中會(huì)發(fā)生化學(xué)轉(zhuǎn)化，而且，溫度對(duì)該類(lèi)香料的穩(wěn)定性有重要影響。

圖1 反式-2-己烯醛在不同溫度下存放時(shí)質(zhì)量百分比變化Fig.1 Content change of trans-2-hexenal stored at different temperatures

2.2 α，β-不飽和醛類(lèi)香料轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的定性分析

為快速了解α，β-不飽和醛類(lèi)香料轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的種類(lèi)組成，借鑒藥品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中的因素實(shí)驗(yàn)方法，在極端條件（80℃）下將α，β-不飽和醛類(lèi)香料存放2周。采用GC/MS法分析經(jīng)過(guò)因素實(shí)驗(yàn)得到的樣品，考察轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的組成特征。以反式-2-己烯醛為例，樣品經(jīng)過(guò)因素實(shí)驗(yàn)的GC/MS總離子流色譜圖如圖2所示。借助Wiley標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)比對(duì)鑒定化合物，對(duì)α，β-不飽和酸類(lèi)物質(zhì)采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)一步確認(rèn)，結(jié)果見(jiàn)表2。可以看出，進(jìn)行因素實(shí)驗(yàn)2周后，7種α，β-不飽和醛類(lèi)香料均生成多種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，主要為酸類(lèi)物質(zhì)，其中以α，β-不飽和酸為主。

顯然，這些香料分子因本身結(jié)構(gòu)存在差異，各種α，β-不飽和醛的具體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物也存在明顯差異。但進(jìn)一步比較7種α，β-不飽和醛類(lèi)香料在因素實(shí)驗(yàn)下的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可以發(fā)現(xiàn)，這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有一個(gè)共同特點(diǎn)，即主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均是與α，β-不飽和醛對(duì)應(yīng)的α，β-不飽和酸，這與理論結(jié)果一致［16］。這說(shuō)明在存放過(guò)程中，α，β-不飽和醛主要發(fā)生基于自由基鏈反應(yīng)的自身氧化反應(yīng)［17］?？梢?jiàn)，α，β-不飽和酸有望成為α，β-不飽和醛類(lèi)香料產(chǎn)品化學(xué)品質(zhì)改變的標(biāo)志物。同時(shí)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中還含有少量的脂肪酸、脂肪醛等物質(zhì)。原因可能是α，β-不飽和醛在存放過(guò)程中先經(jīng)過(guò)逆Aldol反應(yīng)生成飽和脂肪醛，這些飽和脂肪醛進(jìn)一步氧化生成飽和脂肪酸［18］。

另取一組α，β-不飽和醛類(lèi)香料樣品，在80℃下存放，每間隔1周取樣，以內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液溶解，進(jìn)行GC/MS定量分析，連續(xù)測(cè)試7周，考察α，β-不飽和醛和相應(yīng)酸質(zhì)量百分比的變化，結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢钥闯觯S存放時(shí)間的增加，樣品中α，β-不飽和酸的量呈增加趨勢(shì)，而相應(yīng)醛的量呈降低趨勢(shì)。這表明，α，β-不飽和醛和相應(yīng)酸的化學(xué)轉(zhuǎn)化關(guān)系密切，可以指示α，β-不飽和醛類(lèi)香料的化學(xué)轉(zhuǎn)化程度。

2.3 α，β-不飽和酸的GC/MS定量分析

綜上可知，α，β-不飽和酸是相應(yīng)醛類(lèi)香料在環(huán)境中化學(xué)轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)物，可以指示α，β-不飽和醛類(lèi)香料化學(xué)轉(zhuǎn)化的程度，因此，針對(duì)性建立α，β-不飽和醛類(lèi)香料中α，β-不飽和酸的檢測(cè)方法對(duì)于α，β-不飽和醛類(lèi)香料的品質(zhì)監(jiān)控具有重要意義。在本研究中，結(jié)合定性分析結(jié)果，建立了分析7種α，β-不飽和酸的GC/MS方法。

圖2 香料樣品的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of flavor samples

表2 因素實(shí)驗(yàn)條件下α，β-不飽和醛的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物Tab.2 Converted products ofα，β-unsaturated aldehyde under factor experiment conditions

圖3 在80℃條件下α，β-不飽和醛類(lèi)香料存放過(guò)程中α，β-不飽和酸和醛量的變化Fig.3 Changes ofα，β-unsaturated acid and aldehyde contents inα，β-unsaturated aldehyde flavor stored at 80℃

在定性分析α，β-不飽和酸時(shí)，發(fā)現(xiàn)使用DBWAXETR色譜柱時(shí)，α，β-不飽和酸的色譜峰形較好。為盡可能避免衍生化反應(yīng)過(guò)程，簡(jiǎn)化分析方法，將獲取的樣品直接進(jìn)行GC/MS分析。結(jié)果顯示，在優(yōu)化的色譜條件下，7種待測(cè)α，β-不飽和酸類(lèi)物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)化合物在30 min內(nèi)即能流出，分析時(shí)間短，分離效果好。采用優(yōu)化后的色譜條件考察了系列濃度的α，β-不飽和酸標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，7種α，β-不飽和酸類(lèi)物質(zhì)的典型色譜圖如圖4所示。

以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（y）對(duì)相應(yīng)濃度（x，μg/mL）進(jìn)行回歸，得到各目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性范圍；對(duì)最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液重復(fù)分析10次，計(jì)算結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），分別以3倍SD和10倍SD計(jì)算方法的檢出限（LODs）和定量限（LOQs）；采用本方法重復(fù)5次測(cè)試因素實(shí)驗(yàn)樣品，以測(cè)試結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示方法的精密度。結(jié)果（表3）表明，本方法的線性、精密度和靈敏度良好，能夠滿足分析要求。

圖4 采用GC/MS-SIM法獲取的7種α，β-不飽和酸的色譜圖Fig.4 Chromatograms of sevenα，β-unsaturated acids by GC/MS-SIM

表3 7種α，β-不飽和酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Tab.3 Calibration equations，correlation coefficients，linear ranges，LODs and LOQs of sevenα，β-unsaturated acids

2.4 實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存α，β-不飽和醛類(lèi)香料檢測(cè)結(jié)果

收集不同實(shí)驗(yàn)室在常溫下存儲(chǔ)的α，β-不飽和醛類(lèi)香料樣品，以內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液為溶劑，配制0.5 mg/mL乙醇溶液，采用本方法進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表4。可以看出，從各實(shí)驗(yàn)室收集到的α，β-不飽和醛類(lèi)香料樣品中均檢測(cè)出相應(yīng)的α，β-不飽和酸類(lèi)物質(zhì)，各種α，β-不飽和酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于15.8～450.6 mg/g之間。這表明，常溫下，實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存的α，β-不飽和醛類(lèi)香料產(chǎn)品均會(huì)發(fā)生一定程度的化學(xué)變化。

進(jìn)一步比較來(lái)源于不同實(shí)驗(yàn)室的反式-2-己烯醛、反式-2-十一烯醛、肉桂醛等香料中α，β-不飽和酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以看出，儲(chǔ)存時(shí)間與α，β-不飽和酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)密切相關(guān)，對(duì)于同一香料樣品而言，存放時(shí)間越長(zhǎng)，α，β-不飽和酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高。這與因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，也進(jìn)一步提示，α，β-不飽和酸是對(duì)應(yīng)醛類(lèi)香料產(chǎn)品化學(xué)品質(zhì)變化的指標(biāo)性產(chǎn)物，可作為標(biāo)志物用于α，β-不飽和醛類(lèi)香料樣品化學(xué)品質(zhì)的評(píng)價(jià)。

表4 實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存的11個(gè)α，β-不飽和醛類(lèi)香料樣品中α，β-不飽和酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.4 Contents ofα，β-unsaturated acids in 11α，β-unsaturated aldehyde flavor samples stored in laboratories

3 結(jié)論

①α，β-不飽和酸類(lèi)物質(zhì)是α，β-不飽和醛類(lèi)香料的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，α，β-不飽和酸或可作為α，β-不飽和醛類(lèi)香料化學(xué)品質(zhì)變化的標(biāo)志物。②建立的不飽和烯酸類(lèi)物質(zhì)的GC/MS分析方法的靈敏度高（LODs＜0.12μg/mL）、精密度好（RSDs＜4.5%），適用于α，β-不飽和烯醛類(lèi)香料樣品中α，β-不飽和酸的檢測(cè)。③對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存的11個(gè)α，β-不飽和醛類(lèi)香料樣品抽樣檢測(cè)結(jié)果顯示，溫度因素實(shí)驗(yàn)樣品和實(shí)驗(yàn)室存放樣品中α，β-不飽和酸類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與存放時(shí)間均呈正相關(guān)關(guān)系。