有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽對白頭翁五環(huán)三萜皂苷在大鼠腸道吸收的影響*

劉亞麗，徐貞權(quán)，李澤協(xié)，周明月，魏韶鋒，王萌，張凌，管詠梅，李翔，張靖，蘇丹

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 1.藥學(xué)系；2.科技學(xué)院，南昌 330004)

有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽(organic anion transporting polypeptides，OATPs)是細(xì)胞膜吸收轉(zhuǎn)運的一類重要蛋白，能大量攝取結(jié)構(gòu)各異的體內(nèi)外化合物進入細(xì)胞，對于藥物的代謝和消除有重要作用。OATPs是動物及人體內(nèi)重要的膜轉(zhuǎn)運蛋白，屬于溶質(zhì)載體超家族，廣泛分布于胃腸道、肝臟、腎臟、血腦屏障等[1]。研究發(fā)現(xiàn)在大鼠的空腸與回腸廣泛分布著OATP1和OATP3，其作用與P-糖蛋白相反，它可以將藥物從小腸黏膜端轉(zhuǎn)運到腸漿膜端從而增加藥物在小腸的吸收[2]。

白頭翁為傳統(tǒng)的“清熱解毒、涼血止痢”中藥[3]，近年來發(fā)現(xiàn)其有廣泛的抗腫瘤活性[4-6]，其中白頭翁皂苷B3、BD、B7、B10、B11為其抗腫瘤作用的活性成分[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)白頭翁皂苷在極低的生物利用度(<2.5%)情況下，白頭翁五環(huán)三萜皂苷對肝腫瘤的抑制率>60%[6]，提示白頭翁皂苷體內(nèi)抗癌活性顯著，但腸道吸收屏障作為阻礙其藥效發(fā)揮的首要因素不可忽視。

據(jù)白頭翁皂苷的結(jié)構(gòu)特征和物理特性，該類皂苷含有齊墩果烷母核，在28位均有羧酸取代基[6]，易在體液中水解形成有機陰離子。為確定有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽(organic anion transporting polypeptides，OATPs)是否可以作為轉(zhuǎn)運蛋白，通過與藥物離子的結(jié)合，以原發(fā)性主動轉(zhuǎn)運生成的羧酸離子形成的電化學(xué)勢能差為驅(qū)動力影響白頭翁皂苷的吸收，從而將白頭翁皂苷從高濃度區(qū)域轉(zhuǎn)運至低濃度區(qū)域，本研究采用大鼠在體單向腸灌流模型研究白頭翁皂苷在小腸內(nèi)的吸收動力學(xué)和吸收機制，探討各腸段的藥物吸收速度和程度與口服生物利用度之間的關(guān)系，為白頭翁皂苷藥動學(xué)和藥效學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試劑與藥品白頭翁藥材：干燥白頭翁根(購于南昌某藥店)。藥材鑒定：賴學(xué)文教授(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院)。存放地點：江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥標(biāo)本館。5 種皂苷的標(biāo)準(zhǔn)品：B3、BD、B7、B10、B11，含量 >95%。提取地點：中藥固體制造技術(shù)國家工程研究中心天然藥物部。結(jié)構(gòu)鑒定：質(zhì)譜(MS)，氫核磁共振譜(1H-NMR)，碳核磁共振譜(13C-NMR)。黃芩苷：含量 >98%，購于中國食品藥品檢定研究院(批號：110715-201318)。白頭翁總皂苷提取物的制備參照文獻[5]報道的方法。經(jīng)檢測白頭翁皂苷提取物中B3(相對分子質(zhì)量911.4)、BD(相對分子質(zhì)量794.3)、B7(相對分子質(zhì)量895.6)、B10(相對分子質(zhì)量895.5)和B11(相對分子質(zhì)量733.5)的含量分別為24.1%，7.4%，12.4%，13.5%和8.5%，占白頭翁總皂苷65.9%。OATPs抑制劑：吲哚美辛購于中國食品藥品檢定研究院(批號：100258-200904)，柚皮素購于中國廣州分析測試中心(批號：141016)，烏拉坦(批號：180818)，甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。Kreb-Ringer's 營養(yǎng)液(K-R溶液)：取氯化鈉(NaCl)7.8 g，氯化鉀(KCl)0.35 g，氯化鈣(CaCl2)0.37 g，磷酸二氫鈉(NaH2PO4)0.32 g，碳酸氫鈉(NaHCO3)1.37 g，氯化鎂(MgCl2)0.02 g，葡萄糖 1.4 g，純化水配制成 K-R 溶液1 L。

1.2儀器1290型超高壓液相色譜(UPLC，美國Agilent公司，配置Agilent 1290 G4220A型四元液相泵，Agilent 1290 G4226A自動進樣器，Agilent 1290 G1316C型自動恒溫箱)和Agilent 1290 QTRAP 4500型三重四級桿線性離子肼復(fù)合質(zhì)譜(Q-trap-MS，美國AB公司)，3-18K型高速冷凍離心機(德國Sigma公司)，HHS電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，VORTEX GENIUS3渦旋儀(IKA儀器設(shè)備有限公司)，KQ-250 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，AUW-220D 型電子分析天平(日本 Shimadzu 公司，感量：0.01 mg)。

1.3實驗動物清潔級SD雄性大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購于江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK(贛)2017-0004。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±2)℃，濕度(50±20)%。自然光-暗循環(huán)飼養(yǎng)3 d。

1.4液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquidchromatography-massspectrometry，LC-MS)方法①色譜條件，色譜柱：Agilent C18(100 mm×4.6 mm，2.7 μm，Agilent公司)，流動相A 為甲醇，B為1.0 mmol·L-1醋酸銨溶液，梯度洗脫，洗脫方式見表1。運行時間10 min。柱溫：30 ℃，進樣量10 μL。

ESI 質(zhì)譜源參數(shù)：干燥氮氣流速10 L·min-1；干燥氣體溫度350 ℃；噴霧器壓力344.75 kPa(50 psi)；毛細(xì)管電壓-4000 V。多反應(yīng)檢測模式(multi reaction detection mode，MRM)進行定量分析。各待測成分的 MRM 參數(shù)：B3m/z911.4→603.2，BDm/z749.3→471.5，B7m/z895.6→733.6，B10m/z895.5→733.5，B11m/z733.5→455.4，黃芩苷m/z446.1→157.2。B3、BD、B7、B10、B11和黃芩苷的毛細(xì)管傳輸電壓(DP)和碰撞能量(CE)分別為-232，-218，-237，-288，-60，-80 V和(-113.6，-147.2，-104.0，-115.2，-152.0，-56.0)×10-19J(-71，-92，-65，-72，-95，-35 eV)。

②專屬性實驗：儀器操控、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析在MassHunter workstation software(revision B.04.00)上進行。在LC-MS方法下，白頭翁皂苷和黃芩苷色譜圖選擇性較好，色譜峰良好，內(nèi)源性物質(zhì)無干擾。

③樣品處理：取腸吸收液1.0 mL，正丁醇1.0 mL萃取，混勻，靜置取上層正丁醇溶液，氮氣(N2)吹干，采用含有黃芩苷0.908 μg·mL-1的甲醇20 μL復(fù)溶，漩渦振蕩1 min，15 000 r·min-1離心 10 min(r=5.0 cm)，取上清液。

④標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精密稱定各標(biāo)準(zhǔn)品分別溶解于甲醇中制成5種白頭翁皂苷成分的貯備液，B3為518 μg·mL-1，BD為410 μg·mL-1，B7為719 μg·mL-1，B10為620 μg·mL-1，B11為420 μg·mL-1，黃芩苷(內(nèi)標(biāo))為0.908 μg·mL-1。精密量取白頭翁皂苷儲備液適量于 10 mL量瓶中，以空白 K-R 溶液稀釋至刻度，配制成白頭翁皂苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

質(zhì)量控制樣品：采用同樣方法配制為含 B3(10.18，40.72，162.87 ng·mL-1)，BD(6.67，26.66，106.62 ng·mL-1)，B7(9.15，36.60，146.40 ng·mL-1)，B10(4.08，16.31，65.22 ng·mL-1)，B11(2.93，11.71，46.83 ng·mL-1)的系列溶液。

取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，照“1.4③”項的方法處理。按照“1.4①” 項的LC-MS法，取 2 μL 注入 UPLC-MS/MS 供分析。

記錄白頭翁皂苷 B3、BD、B7、B10、B11 與內(nèi)標(biāo)的峰面積比。以待測成分的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6個濃度水平，各濃度測定3次，重復(fù)測定3 d。待測物質(zhì)的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

⑤回收率實驗：精密量取質(zhì)量控制溶液50 μL，用空白腸吸收液稀釋至1.0 mL，按照“1.4③”項下方法處理。取上清液20 μL進樣測定，計算各待測化合物經(jīng)提取后得到峰面積與未經(jīng)提取直接進樣獲得的色譜峰面積的比值，計算提取回收率。內(nèi)標(biāo)物質(zhì)同法測定。

白頭翁皂苷B3、BD、B7、B10和B11的平均提取回收率為74.8%～92.1%，RSD ≤ 8.1%。內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的平均提取回收率為(82.7±3.4)%。

⑥精密度和準(zhǔn)確度實驗：精密量取低、中、高濃度的質(zhì)量控制樣品溶液50 μL，用空白腸吸收液稀釋至1.0 mL，按照“1.4③”項的方法處理。各濃度制備6份，連續(xù)進樣6次，求日內(nèi)精密度。重復(fù)操作，連續(xù)3 d測定并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求日間精密度。準(zhǔn)確度通過比較樣品的實際濃度與理論濃度，用相對回收率和相對誤差來表征。

日間和日內(nèi)精密度分別為-5.78%～10.09%和2.47%～10.73%，方法準(zhǔn)確度為-7.51%～8.92% 和3.31%～11.23%。

⑦基質(zhì)效應(yīng)實驗：取空白 K-R 溶液 1.2 mL，按照“1.4③ ”項處理方法至氮氣吹干，殘渣中加入含有內(nèi)標(biāo)溶液的質(zhì)量控制溶液 20 μL，復(fù)溶，LC-MS分析，5 個待測化合物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值記錄為A1。另同法操作，用純化水替代空白K-R溶液，5 個待測化合物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值記錄為A2。基質(zhì)效應(yīng)=A1/A2×100%。

5種白頭翁皂苷基質(zhì)效應(yīng)的均值為85.6%～98.8%，RSD≤4.5%。說明在本方法下，內(nèi)源性物質(zhì)對 5 種被測化合物的離子化無干擾。

⑧穩(wěn)定性實驗：待測物置37 ℃ 恒溫水浴中，分別于0，2，4，6，8，16，24 h取樣，并測定峰面積，與零時刻的峰面積比較，樣品溶液在各個時間點的峰面積基本保持不變，RSD≤9%，該方法穩(wěn)定性符合要求。

1.5大鼠在體腸吸收實驗分別考察未添加抑制劑(對照組)時各腸段白頭翁皂苷的吸收情況和添加抑制劑吲哚美辛、柚皮素對白頭翁皂苷吸收的影響。稱取吲哚美辛適量置于250 mL量瓶中，用含K-R液的白頭翁提取物溶液(0.25 g·L-1)稀釋至刻度，混勻，超聲溶解，分別配制成含低、中、高濃度吲哚美辛(0.1，0.5，1.0 mmol·L-1)的白頭翁灌流液(吲哚美辛低、中、高濃度組)。稱取柚皮素適量于250 mL量瓶中，用含K-R液的白頭翁提取物溶液(0.25g·L-1)稀釋至刻度，混勻，超聲溶解，配制成含低、中、高濃度柚皮素(0.1，0.25，0.5 mmol·L-1)的白頭翁灌流液(柚皮素低、中、高濃度組)。大鼠在體單向腸灌流實驗方法參考文獻[8]。

1.6數(shù)據(jù)處理采用重量法計算吸收速率常數(shù)Ka和滲透系數(shù)Peff。

公式中：Qin和Qout分別為腸段灌入的灌流液和收集液的體積(mL)(假定灌流液和收集液的密度均為1.0 g·mL-1)，Cin和Cout分別為灌流液和收集液的質(zhì)量濃度(g·L-1)，Q為灌流速度，V為灌流腸段的體積(cm3)，l和r分別為灌流腸段的腸度(cm)和橫截面半徑(cm)。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 7.00版軟件，使用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1腸壁物理吸附的考察剪取0.9%氯化鈉溶液清洗過的大鼠十二指腸、空腸、回腸各段10 cm，置于白頭翁皂苷K-R液中，于37 ℃振蕩孵育2 h，孵育前后分別取樣(n=3)，按照“1.4③”項下方法操作，求算白頭翁皂苷的濃度，見表 3。大鼠各腸段腸壁對白頭翁皂苷無明顯物理吸附。

表3 腸壁細(xì)胞對白頭翁皂苷的物理吸附作用

2.2未添加抑制劑時各腸段白頭翁皂苷的吸收情況在十二指腸、空腸和回腸中，白頭翁皂苷5種成分在空腸和回腸的Peff差異無統(tǒng)計學(xué)意義；B3、B7、B11的Ka在空腸和回腸差異無統(tǒng)計學(xué)意義，十二指腸的Ka及Peff均顯著大于空腸和回腸，見圖1，故認(rèn)為十二指腸為該類皂苷吸收的主要部位，與此前研究結(jié)果一致[8]。

①與十二指腸比較，P<0.01；②與空腸比較，P<0.05；③與空腸比較，P<0.01；④與十二指腸比較，P<0.05。

2.3吲哚美辛對白頭翁皂苷吸收的影響結(jié)果見圖2。與對照組比較，吲哚美辛低、中、高濃度組白頭翁皂苷的Ka、Peff均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，隨著吲哚美辛濃度升高，抑制效果越強。

①與對照組比較，P<0.01；②與對照組比較，P<0.05。

2.4柚皮素對白頭翁皂苷吸收的影響結(jié)果見圖3。與對照組比較，柚皮素低、中、高濃度組白頭翁皂苷的Ka、Peff均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，隨著柚皮素濃度升高，抑制效果越強。

①與對照組比較，P<0.01；②與對照組比較，P<0.05。

3 討論

采用單向灌流模型避免了循環(huán)灌流法時間長、流速高對腸黏膜的損傷。單向灌流法具有以下優(yōu)點：①操作簡便、技術(shù)成熟、可控性強，易于控制實驗中藥物的濃度、pH值以及灌流速度，可較準(zhǔn)確地反映藥物在腸道的吸收狀況；②具有神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能，且淋巴液血液供應(yīng)完整；③避免胃腸道內(nèi)容物及胃腸運動對實驗的影響；④藥物吸收后被血液帶走可形成漏槽條件；⑤從腸腔側(cè)取樣，可排除肝臟首關(guān)效應(yīng)及藥物在腸壁組織中的代謝[6]；⑥采用重量法矯正灌流液體積，能顯著減少實驗誤差。

在十二指腸、空腸和回腸的滲透系數(shù)表明，十二指腸為白頭翁皂苷吸收的主要部位，在空腸和回腸中的吸收要低于在十二指腸，但空腸和回腸吸收能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與文獻[9]報道一致。腸滲透性是藥物進行生物藥劑分類的基本屬性之一[8]，根據(jù)其強弱將藥物分為高滲透性藥物(強吸收成分)和低滲透性藥物(弱吸收成分)[10]。根據(jù)本實驗結(jié)果，白頭翁皂苷Peff<1.8 ×10-4，應(yīng)屬于低滲透性藥物，其發(fā)揮藥效時多是滯留在腸道內(nèi)，在研究提高藥物發(fā)揮療效機制時可考慮基于腸道吸收前靶點的活性研究[11]。

據(jù)白頭翁皂苷的結(jié)構(gòu)特征和物理特性，易在體液中水解形成有機陰離子。吲哚美辛為OATP1和OATP3典型的抑制劑；柚皮素為OATP1A2和OATP2B1的典型抑制劑，OATP1、OATP2，OATP3均廣泛地分布于腸、肝、卵、巢、睪丸、脾等各組織。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠的十二指腸、空腸、回腸等不同部位均可以檢測到OATP1、OATP2和OATP3，尤以大鼠空腸中OATP1、OATP2和OATP3含量最高[12]。因此在本實驗中選用吲哚美辛和柚皮素來研究OATPs對白頭翁皂苷吸收的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，吲哚美辛和柚皮素均能顯著降低白頭翁在小腸中的滲透系數(shù)。雖然在十二指腸中吲哚美辛和柚皮素對白頭翁皂苷的吸收抑制作用比在空腸、回腸中較大，但總體上該兩種抑制劑對3個腸段均有抑制作用，因此推斷，白頭翁皂苷可能為OATP1、OATP2和OATP3的底物。腸細(xì)胞上OATPs 可將白頭翁皂苷吸收進入到細(xì)胞內(nèi)，與一元羧酸轉(zhuǎn)運體、P-糖蛋白的外排作用形成相互制衡的作用力，共同決定白頭翁皂苷的生物利用度。