中藥調(diào)控腦缺血后海馬內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生與修復(fù)的研究進(jìn)展*

高家樂，姚明江，劉建勛

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

腦卒中指各種因素引起腦內(nèi)動脈狹窄、閉塞或破裂，造成急性腦血液循環(huán)障礙及腦部供血受阻，繼而導(dǎo)致腦功能障礙，約80%的腦卒中是由于缺血性因素引起[1]。腦卒中作為多發(fā)常見的重大疾病，不僅是全球第五大死亡原因，也是導(dǎo)致成年人殘疾的主要原因，腦卒中后遺癥嚴(yán)重影響著患者的健康和生活，然而目前仍然沒有神經(jīng)保護(hù)劑作為抗缺血性腦卒中藥物被認(rèn)可，無論是已上市的藥物還是常用的治療方法都不能促進(jìn)腦卒中后的神經(jīng)修復(fù)和神經(jīng)發(fā)生[2-3]，卒中后神經(jīng)修復(fù)的機(jī)制與方法亟待研究。成年海馬神經(jīng)發(fā)生與學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能有關(guān)，神經(jīng)發(fā)生受阻會導(dǎo)致認(rèn)知和情緒障礙[4]，腦缺血會引起海馬損傷，認(rèn)知功能受缺陷，嚴(yán)重的發(fā)展為血管性癡呆。海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)顆粒下區(qū)(subgranular zone，SGZ)是成年哺乳動物腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的主要位點(diǎn)之一，成年期可以不斷地產(chǎn)生新的神經(jīng)元，有助于學(xué)習(xí)和記憶功能的維持[5]。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多層次、多途徑的綜合優(yōu)勢，通過改變神經(jīng)干細(xì)胞的微環(huán)境以及調(diào)控內(nèi)源性因素等來調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，能夠促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[6-7]。筆者總結(jié)成年海馬神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制及過程、海馬顆粒下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境對神經(jīng)發(fā)生的影響以及中藥在防治腦缺血過程中對海馬的調(diào)控作用，以期為中藥促進(jìn)腦缺血后海馬內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生與修復(fù)的相關(guān)研究提供參考。

1 海馬神經(jīng)發(fā)生機(jī)制及過程

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)具有自我更新的能力，可以分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，以構(gòu)建和維持大腦結(jié)構(gòu)和功能單位[8]，在胚胎發(fā)育和成年神經(jīng)發(fā)生過程中起著重要作用。神經(jīng)發(fā)生是對局灶性腦缺血的一種反應(yīng)，腦缺血能夠激活海馬SGZ的神經(jīng)干細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[9]。海馬SGZ成年神經(jīng)干細(xì)胞在發(fā)育為新生的顆粒神經(jīng)元并功能性整合入海馬回路之前，會經(jīng)歷幾個連續(xù)的發(fā)育階段，包括增殖、分化、遷移、軸突延伸和突觸整合[10]，受到一系列信號的調(diào)控。在不同發(fā)育階段，細(xì)胞類型有Ⅰ型細(xì)胞、Ⅱa型細(xì)胞、Ⅱb型細(xì)胞、Ⅲ型細(xì)胞以及未成熟和成熟的神經(jīng)元，其中Ⅰ型細(xì)胞是海馬SGZ中具有NSC特性的放射狀膠質(zhì)樣細(xì)胞(radial glia-like cells，RGLs)，表達(dá)巢蛋白(nestin)，可產(chǎn)生具有瞬時擴(kuò)增特性的Ⅱ型中間神經(jīng)祖細(xì)胞(neural progenitor cells，NPCs)，增殖能力增強(qiáng)，其又可以分為IIa和IIb兩種亞型，雙皮質(zhì)素(doublecortin，DCX)和巢蛋白均呈陽性，這些Ⅱ型細(xì)胞可以產(chǎn)生Ⅲ型遷移神經(jīng)母細(xì)胞，特征為DCX陽性、巢蛋白陰性以及多唾液酸型神經(jīng)細(xì)胞黏附分子陽性，遷移到顆粒細(xì)胞層，在成熟之前擴(kuò)增隨后退出細(xì)胞周期，進(jìn)入短暫的有絲分裂后階段，形成未成熟的神經(jīng)元，再過2～3周期后轉(zhuǎn)化為成熟的新生顆粒神經(jīng)元[11-12]，將軸突投射到海馬CA3區(qū)，樹突投射到海馬DG的分子層以接受興奮性突觸輸入[13]。除了神經(jīng)元的產(chǎn)生外，還能產(chǎn)生少量膠質(zhì)細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞等。海馬內(nèi)嗅皮層經(jīng)過DG、CA3和CA1區(qū)構(gòu)成三突觸神經(jīng)回路，海馬齒狀回成年新生神經(jīng)元的增加不僅有助于三突觸神經(jīng)回路的可塑性，而且提供了海馬結(jié)構(gòu)和功能的可塑性[14]，海馬神經(jīng)回路及細(xì)胞類型見圖1。

圖1 海馬三突觸回路及細(xì)胞類型簡圖

2 海馬SGZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境對神經(jīng)發(fā)生的影響

神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境主要包括與神經(jīng)干細(xì)胞相鄰的細(xì)胞、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)和微血管網(wǎng)等，海馬SGZ區(qū)微環(huán)境細(xì)胞組成主要包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元以及增殖細(xì)胞[15]。星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血后的神經(jīng)發(fā)生與修復(fù)中起著雙向作用。一方面，在腦缺血發(fā)生后幾分鐘內(nèi)，缺血核心區(qū)和半暗區(qū)帶產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TGF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6等因子，觸發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，引起反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，形成膠質(zhì)瘢痕，阻礙軸突再生，還能產(chǎn)生促炎因子，增加炎癥反應(yīng)等[16]，不利于神經(jīng)發(fā)生；而另一方面，星形膠質(zhì)細(xì)胞也能分泌和釋放一些趨化因子和生長因子，到達(dá)神經(jīng)發(fā)生位點(diǎn)，促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞增殖、遷移到達(dá)缺血區(qū)[17]，另外星形膠質(zhì)細(xì)胞本身也能轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。SHEN等[18]研究表明，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通過增加巢蛋白和Pax6的表達(dá)促進(jìn)成年大鼠缺血損傷紋狀體中的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步增強(qiáng)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞分化為新的成熟神經(jīng)元，從而促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。ASRICAN等[19]研究發(fā)現(xiàn)，海馬齒狀回膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)中間神經(jīng)元釋放一種內(nèi)源性神經(jīng)肽即CCK。CCK釋放增加能夠促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸遞質(zhì)的釋放，進(jìn)而激活放射狀膠質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞中的絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1信號，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的穩(wěn)定增殖和分化。

細(xì)胞因子有成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、VEGF、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等。FGF參與血管生成，具有促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和突觸生成，保護(hù)神經(jīng)元并促進(jìn)神經(jīng)元的存活等功能[20]，其中FGF-2可促進(jìn)神經(jīng)元的軸突分支和突觸發(fā)生，在腦缺血損傷后通過增加樹突分枝和樹突棘密度來促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[21]。BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富、分布最廣泛，通過結(jié)合和激活受體酪氨酸激酶B(tyrosine receptor kinase B，TrkB)或共受體p75NTR發(fā)揮作用，其中BDNF與TrkB受體結(jié)合可顯著促進(jìn)由腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)再生，尤其是海馬SGZ區(qū)[22]。BDNF也可通過激活環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)和蛋白激酶PKA來促進(jìn)神經(jīng)元成熟和神經(jīng)發(fā)生，越來越多的研究表明，BDNF和磷酸化CREB是調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)發(fā)生和改善認(rèn)知功能的關(guān)鍵因素[23]。VEGF可促進(jìn)血管生成，血管生成是指從預(yù)先存在的血管中分支形成新的微血管，包括內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和發(fā)芽、管狀血管結(jié)構(gòu)的形成、分支和吻合，在腦缺血后4～7 d內(nèi)發(fā)生，主要在缺血核心區(qū)和周邊交界處，新生血管的生成可使阻塞微血管再通，促進(jìn)缺血半影區(qū)損傷神經(jīng)元的恢復(fù)[24-25]。血管新生和神經(jīng)發(fā)生二者密切相關(guān)，缺血后新生血管通過VEGF和laminin/β1-integrin 信號引導(dǎo)軸突發(fā)芽，通過一些胞外信號、提供營養(yǎng)物質(zhì)以及作為遷移支架等促進(jìn)海馬SGZ內(nèi)源性NSC/NPC增殖，向梗死周圍區(qū)域遷移和分化為成熟的神經(jīng)元，從而促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)重塑和功能性恢復(fù)[26]。

3 中藥對腦缺血后海馬神經(jīng)發(fā)生與修復(fù)的干預(yù)作用

3.1中藥單一有效成分黃芪甲苷(astragaloside VI，AsVI)能夠改善腦缺血-再灌注大鼠的學(xué)習(xí)記憶和運(yùn)動功能，提高海馬DG區(qū)BrdU/DCX、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP陽性細(xì)胞的表達(dá)率以及上調(diào)海馬巢蛋白、p-EGFR和p-MAPK的表達(dá)，表明AsVI能夠有效激活EGFR/MAPK信號通路從而促進(jìn)NSC增殖和神經(jīng)發(fā)生[27]。在體外缺氧條件下，川芎嗪能夠促進(jìn)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖和向神經(jīng)元分化，MAPK信號通路參與這一過程，可能與ERK和p38的磷酸化有關(guān)[28]。川芎嗪硝酮(tetramethylpyrazine nitrone，TBN)是川芎嗪的合成衍生物，易于穿透血-腦屏障，研究發(fā)現(xiàn)，TBN能減輕雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷和抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/GSK3β通路保護(hù)海馬神經(jīng)元免受氧糖剝奪誘導(dǎo)的凋亡，增加軸突萌發(fā)及生長，促進(jìn)軸突的可塑性，此外還能增加腦缺血模型大鼠腦內(nèi)BDNF的表達(dá)，推測增加的BDNF與TrkB結(jié)合從而激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路[29]。天麻素能夠促進(jìn)腦缺血后海馬神經(jīng)發(fā)生，可能與PDE9-cGMP-PKG信號通路有關(guān)[30]。淫羊藿苷能夠改善雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎誘導(dǎo)的血管性癡呆大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，抑制海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失，可能與激活海馬組織BDNF/TrkB及其下游Akt和ERK/CREB信號通路有關(guān)[31]。

3.2中藥有效成分配伍梓醇和葛根素制成凍干粉后，能夠增加海馬DG區(qū)BrdU和NeuN陽性細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)小鼠缺血側(cè)海馬DG的神經(jīng)發(fā)生[32]。黃芪甲苷、三七總皂苷以及冰片三者配伍后能增加大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠海馬CA1區(qū)巢蛋白和NeuN陽性細(xì)胞的表達(dá)，促進(jìn)腦缺血-再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的增殖、神經(jīng)元的分化與成熟，且配伍后藥物效應(yīng)增強(qiáng)，顯著促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路的激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖和神經(jīng)發(fā)生[33]。

3.3中藥復(fù)方研究表明，補(bǔ)陽還五湯通過星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)對海馬神經(jīng)元的樹突復(fù)雜性以及樹突棘可塑性產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為海馬神經(jīng)元樹突長度、節(jié)點(diǎn)數(shù)、終末分支數(shù)以及樹突棘密度大體呈增長趨勢，CA1、CA3和DG區(qū)以CD31表達(dá)量來計算的微血管密度表達(dá)水平均升高，從而促進(jìn)腦缺血-再灌注后修復(fù)期的神經(jīng)元修復(fù)和血管再生[34]。升降散能夠呈劑量依賴性地促進(jìn)慢性腦缺血血管性癡呆大鼠海馬組織的病理性損傷修復(fù)及VEGF和巢蛋白的表達(dá)，上調(diào)海馬組織 Wnt 信號通路關(guān)鍵蛋白 p-LRP，p-GSK3β 和 β-catenin 蛋白水平，促進(jìn)血管新生和神經(jīng)干細(xì)胞分化，可能與激活Wnt信號通路活性有關(guān)[35]。當(dāng)歸芍藥散能夠增加小鼠腦缺血后海馬DG區(qū)Ki67、DCX陽性細(xì)胞以及BrdU/DCX、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP陽性細(xì)胞的數(shù)量，可能通過增加Akt/GSK3β/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來促進(jìn)腦缺血后海馬DG神經(jīng)發(fā)生[36]。參歸三圣散提取物能夠增強(qiáng)MCAO大鼠感覺運(yùn)動功能和識別記憶能力，改善腦血流量和梗死面積，促進(jìn)腦缺血后海馬神經(jīng)發(fā)生，可能與調(diào)節(jié)BMP2/4和Notch1/Hes5信號通路有關(guān)[37]。頤腦解郁復(fù)方可能通過上調(diào) Notch通路中的Notch1和Hes1基因表達(dá)，增加海馬DG神經(jīng)元數(shù)量和抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活，動態(tài)調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)發(fā)生，對卒中后抑郁大鼠起到治療作用[38]。

由此，中藥可通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活、促進(jìn)神經(jīng)元的存活，增加細(xì)胞因子如VEGF和BDNF的表達(dá)，促進(jìn)血管新生等來改善腦缺血后海馬顆粒下區(qū)微環(huán)境，從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化等，有利于海馬內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生。然而中藥促進(jìn)腦缺血后海馬內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生涉及的信號通路復(fù)雜，單一的中藥有效成分可能涉及不同通路，不同的中藥有效成分涉及的通路也可能相同，中藥配伍以及對應(yīng)通路間的復(fù)雜作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

以上中藥研究情況匯總見表1。

表1 中藥調(diào)節(jié)腦缺血后海馬神經(jīng)發(fā)生與修復(fù)的作用機(jī)制

4 結(jié)束語

腦缺血后誘發(fā)的機(jī)體內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生是一種代償性反應(yīng)，絕大多數(shù)增殖后的神經(jīng)細(xì)胞會死亡，故提高腦缺血后新生神經(jīng)細(xì)胞的存活率非常重要。人類海馬始終保持產(chǎn)生新生神經(jīng)元的能力，如果在腦缺血后能夠最大程度地激活海馬顆粒下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞，并提高其增殖后存活的數(shù)量，促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生，可能對神經(jīng)功能的修復(fù)有很大貢獻(xiàn)。中藥能夠改善腦缺血后的微環(huán)境，對海馬神經(jīng)發(fā)生與修復(fù)起到促進(jìn)作用，而其中機(jī)制復(fù)雜，仍需進(jìn)一步探究。此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元，但轉(zhuǎn)化不當(dāng)會引起神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的比例失調(diào)紊亂，導(dǎo)致神經(jīng)功能異常，而腦缺血后會引起星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，對神經(jīng)發(fā)生有利有弊，中藥能否通過促進(jìn)營養(yǎng)因子的分泌等促使星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元，并維持這種轉(zhuǎn)化的平衡，以達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的作用，值得進(jìn)一步研究。另外，在神經(jīng)發(fā)生的不同階段，用來識別和確定不同特征的亞群細(xì)胞的分子標(biāo)記物繁雜，不同腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞適宜的標(biāo)記物也有所差別，故在今后的研究中應(yīng)該慎重選取具有代表性的標(biāo)記物，或同時采用多個標(biāo)記物來確定某一特定類型的細(xì)胞，以便更好探究中藥促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)發(fā)生與修復(fù)的作用機(jī)制。