基于效應(yīng)子E38識別與NB-LRR富集測序挖掘抗晚疫病馬鈴薯資源

段艷鳳，文國宏，Armstrong MR，李廣存，金黎平*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州 730070；3.英國鄧迪大學(xué)/詹姆斯赫頓研究所植物科學(xué)系，英國 鄧迪 DD2 5DA）

馬鈴薯是世界上繼小麥、玉米和水稻之后的第4大糧食作物，也是中國重要的糧菜飼兼用作物[1]。由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上最具毀滅性的病害[2]。目前，生產(chǎn)上對晚疫病的防治措施主要應(yīng)用殺菌劑，不僅會導(dǎo)致抗藥性菌株的產(chǎn)生，還增加了環(huán)境污染及對人類健康帶來風(fēng)險。實踐證明，培育抗病品種是防治晚疫病的根本手段[3]。然而，由于栽培馬鈴薯抗源缺乏，抗病基因（R基因）容易被高度進(jìn)化的晚疫病菌株克服，致使抗晚疫病育種進(jìn)程緩慢。因此，尋找優(yōu)異晚疫病抗源材料，挖掘新的R基因，對于促進(jìn)馬鈴薯抗晚疫病育種具有重要意義。

致病疫霉基因組容量高達(dá)240 Mb，編碼了大量的效應(yīng)蛋白，其中最大的效應(yīng)蛋白家族為RXLR類蛋白，大約有560多個[2]。目前，所有被報道的致病疫霉效應(yīng)蛋白（AVR）均屬于RXLR類蛋白，并且都排列在基因稀疏、重復(fù)序列較高的區(qū)域，例如AVR1[4]、AVR2[5]、AVR3a[6]、AVR4[7]及AVR-blb2[8]等。目前已經(jīng)克隆的馬鈴薯晚疫病R基因有近30個，均屬于NB-LRR類抗病基因[9]?；谥参锱c病菌識別的ETI理論，這些R基因編碼的蛋白可以通過識別致病疫霉中RXLR類AVR蛋白產(chǎn)生過敏性反應(yīng)（Hypersensitive response，HR），從而使馬鈴薯產(chǎn)生抗病性[10]。效應(yīng)子組學(xué)策略由Vleeshouwers等[11]在2008年提出，即通過效應(yīng)子與抗病基因的識別鑒別馬鈴薯資源中是否含有潛在抗病基因，該方法大大提高了抗病資源的評價及抗病基因的鑒定和利用效率。

近年來一種基于NB-LRR序列富集測序（Resistance gene enrichment Sequencing，RenSeq）技術(shù)發(fā)展成熟。該技術(shù)可以精確地對植物基因組中NB-LRR基因序列進(jìn)行進(jìn)一步注釋，通過該技術(shù)研究者們將馬鈴薯基因組中的NB-LRR基因數(shù)目從438個增加到了755個[12]。RenSeq技術(shù)可以快速有效地對R基因進(jìn)行定位和分離。Jupe等[12]利用該技術(shù)分別以野生種Solanum berthaultii和S.ruiz-ceballosii分離群體為材料，成功鑒定到了上述兩個群體中與晚疫病抗性位點共分離的標(biāo)記。RenSeq還可以作為一種快速診斷工具（dRenSeq），對通過磁珠富集的片段測序后與已知的R基因進(jìn)行比對，可以快速確定被檢測的材料是否含有已知的R基因[13]。

本研究所用的晚疫病菌效應(yīng)子E38由西北農(nóng)林科技大學(xué)實驗室提供，該實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯栽培品種‘隴薯12號’中過表達(dá)E38可引發(fā)過敏性壞死反應(yīng)（HR），揭示了在‘隴薯12號’中可能存在特異識別E38的抗病基因。本研究以‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’為材料，通過晚疫病抗性鑒定、效應(yīng)子識別及dRenSeq等分析，并以‘隴薯12號’與‘L05Nsr-j-1’的分離群體為材料，以期解析其抗性遺傳基礎(chǔ)，為‘隴薯12號’的利用及抗晚疫病基因克隆等后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’均為四倍體，F(xiàn)1雜交后代分離群體共計215個單株，以上材料由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所提供。試管苗在MS培養(yǎng)基（20 g/L蔗糖，5 g/L含維生素MS，8 g/L瓊脂，pH 5.8）上，23℃、16 h/8 h光暗培養(yǎng)兩周后，移植于日光溫室營養(yǎng)缽中生長，期間進(jìn)行澆水、施肥等日常管理?！]薯12號’、‘L05Nsr-j-1’及F1分離群體在移植后4～5周時選取健康、幼嫩完全展開的葉片進(jìn)行病菌效應(yīng)子分析。晚疫病菌接種鑒定在移植后8～10周時進(jìn)行。

1.2 晚疫病菌株及抗性鑒定

用于接種的晚疫病菌株為428-2、T30-4、90128和CN152（表1），其中CN152可以克服很多已知的抗晚疫病基因，包括廣譜抗病基因Rpi-blb1/RB，被稱為“超級生理小種”。晚疫病菌株于液氮保存，待接種時于黑麥培養(yǎng)基上活化?；罨木暝诿咕囵B(yǎng)箱18℃黑暗培養(yǎng)7～14 d，待菌絲長滿培養(yǎng)皿時加適量無菌水于4℃誘導(dǎo)游動孢子3～6 h，利用血球計數(shù)器統(tǒng)計游動孢子數(shù)量并稀釋到接種濃度，準(zhǔn)備接種。

接種方法采用離體葉片法[16]，并略加改動。從植株頂部計起，選取第3～5片展開葉，背面朝上置于雙層濕潤滅菌濾紙上，在每個葉片背面主葉脈兩側(cè)各接種1滴濃度為5×104個游動孢子/mL的孢子懸浮液，每滴10μL。接種后將容器封好，置于18℃培養(yǎng)箱內(nèi)，在每日光照16 h，黑暗8 h，相對濕度100%條件下培養(yǎng)。接種后6～7 d調(diào)查發(fā)病情況。對于接種的每個菌株，每份材料從3個植株上各選取一個葉片進(jìn)行接種，每個接種試驗重復(fù)3次。本研究以‘CPH1-14’為抗病對照，‘Desiree’為感病對照。

表1 晚疫病抗性鑒定所用菌株Table 1 Isolates used for late blight resistance evaluation

1.3 重組質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒pMDC83-E38由西北農(nóng)林科技大學(xué)實驗室提供；pBINPLUS-R3a和pK7WG2-Avr3a重組質(zhì)粒由荷蘭瓦赫寧根大學(xué)實驗室提供；空載體pMDC83由本實驗室保存（表2）。將以上質(zhì)粒通過凍融法[17]轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101中。將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的農(nóng)桿菌分別在含有相應(yīng)抗生素的LB平板培養(yǎng)基上活化，28℃靜置培養(yǎng)2 d。挑取單克隆接入1 mL含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28℃，200 r/min，培養(yǎng)過夜，菌液DNA進(jìn)行PCR驗證，經(jīng)過驗證的菌液加20%滅菌甘油保存在-80℃冰箱。

R3a[18]和Avr3a[19]特異引物序列來源于參考文獻(xiàn)，E38和pMDC83引物序列通過軟件Primer premier 5.0設(shè)計（表3）。PCR反應(yīng)體系：菌液DNA模板1μL、上游引物（5μmol）0.3μL、下游引物（5μmol）0.3μL、2×Taq mix 8μL、ddH2O 6.4μL。PCR反應(yīng)程序：94℃變性30 s，Tm退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)。第一個循環(huán)之前94℃預(yù)變性5 min，最后72℃延伸7 min。

1.4 基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時表達(dá)分析(Agroinfiltrationassay)

采用Vossen等[20]的方法，每個植株選取3片幼嫩、健康和完全展開的葉片進(jìn)行基因瞬時表達(dá)分析，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。將于-80℃貯存的農(nóng)桿菌菌液在含有相應(yīng)抗生素的3 mL LB液體培養(yǎng)基中28℃過夜培養(yǎng)。第2 d，將這些培養(yǎng)物接種到含有相應(yīng)抗生素的15 mL YEB培養(yǎng)基中（1 L蒸餾水中添加5 g牛肉浸膏、5 g蛋白胨、5 g蔗糖、1 g酵母提取物及2 mL 1 mol MgSO4），另加10μL/L 200 mol乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）及1 000μL/L 1 mol 2-氮嗎啉乙烷磺酸[2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid，MES]，28℃，200 r/min，培養(yǎng)過夜。第3 d，16℃、4 000 r/min離心8 min收集細(xì)胞，用MMA緩沖液（1 L蒸餾水中添加20 g蔗糖、5 g MS及1.95 g MES，用NaOH調(diào)節(jié)pH至5.6，另外添加1 mL/L 200 mol溶于DMSO的AS）重懸浮至OD600達(dá)到0.2。將含有R3a和Avr3a基因懸菌液1∶1混合，室溫靜置3 h后，用1 mL無針頭注射器以點注射方式（直徑1 cm左右）在葉片上注射作為陽性對照。空載體pMDC83、農(nóng)桿菌GV3101為陰性對照。3～4 d后觀察、統(tǒng)計表型。試驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次試驗重復(fù)。

表2 用于農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)的質(zhì)粒Table 2 Vectors used for agroinfiltration

表3 用于PCR驗證的引物Table 3 Primers used for PCR validation

1.5 基因組DNA提取及d RenSeq分析

采用改良的CTAB法[21]提取‘隴薯12號’及‘L05Nsr-j-1’基 因 組DNA，利 用Nanodrop ND-100型分光光度計檢測DNA的質(zhì)量及濃度。

dRenSeq分析參考Armstrong等[22]的方法進(jìn)行。利用‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’的DNA分別構(gòu)建基因組DNA測序文庫，與標(biāo)記有NB-LRR基因保守序列的磁珠雜交富集。將雜交上的DNA洗脫，并基于Illumina MiSeq測序平臺測序。將測序的reads與已知的馬鈴薯晚疫病R基因以1%和2%的錯配率進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘隴薯12號’可能含有未知晚疫病抗病基因

利用包括超級生理小種CN152（13_A2型）在內(nèi)的4個來源不同、毒力不同的晚疫病菌株對‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’進(jìn)行了接種鑒定。結(jié)果如圖1所示，‘隴薯12號’對CN152表現(xiàn)為感病，對90128、T30-4及428-2 3個菌株表現(xiàn)為抗??；‘L05Nsr-j-1’則對4個菌株均表現(xiàn)為感病。結(jié)合4個菌株的生理小種類型，推測‘隴薯12號’可能含有晚疫病抗病基因R2、R9或其他抗病基因。

2.2 病原效應(yīng)子E38可以激發(fā)‘隴薯12號’特異的HR反應(yīng)

目前，已公布的馬鈴薯R基因均是通過識別致病疫霉中一類含有RXLR結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子從而激發(fā)抗病功能。本研究采用效應(yīng)子E38分別在‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’中進(jìn)行農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)分析，結(jié)果表明‘隴薯12號’可以識別效應(yīng)子E38產(chǎn)生特異的HR，預(yù)示‘隴薯12號’存在識別E38的潛在R基因（圖2）。而‘L05Nsr-j-1’則不能識別E38，未產(chǎn)生特異的HR。

圖1 ‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’的晚疫病抗性鑒定Figure 1 Late blight resistance identification of'Longshu 12'and'L05Nsr-j-1'

圖2 效應(yīng)子E38在‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’葉片上的識別表現(xiàn)Figure2 Recognition performanceof Agrobacterium-mediated transformation of'Longshu 12'and'L05Nsr-j-1'with effector E38

2.3 dRenSeq檢測揭示‘隴薯12號’中存在未知晚疫病抗病基因

‘隴薯12號’除對“超級生理小種”CN152表現(xiàn)為感病外，對90128、T30-4及428-2 3個菌株均表現(xiàn)為抗病，‘L05Nsr-j-1’則對以上4個菌株均表現(xiàn)為感病。為確認(rèn)‘隴薯12號’的抗性是否來源于已知的NB-LRR基因，采用了R基因診斷技術(shù)dRenSeq對‘隴薯12號’進(jìn)行了富集分析，結(jié)果顯示，在容許1%和2%錯配率時，‘隴薯12號’的reads沒有完全覆蓋所檢測的任一基因（表4，圖3）。因此推測，‘隴薯12號’的抗性可能來源于這些基因外的其他基因或同源基因。

2.4 F1分離群體大部分基因型對農(nóng)桿菌敏感

為了挖掘‘隴薯12號’中含有的特異識別效應(yīng)子E38的潛在抗病基因，本研究將E38在‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’雜交的F1分離群體215個單株上進(jìn)行農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)分析，理論上攜帶潛在抗病基因的個體會識別效應(yīng)子E38進(jìn)而出現(xiàn)細(xì)胞壞死的表型。結(jié)果顯示F1群體145個（67%）單株陰性對照出現(xiàn)細(xì)胞壞死，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)；70個（33%）單株陽性對照和陰性對照均正常，其中23個單株能被E38識別產(chǎn)生HR，47個單株不能被E38識別產(chǎn)生HR（圖4）。

表4 ‘隴薯12號’NLR基因的覆蓋率Table 4 NLRcoveragein'Longshu 12'

圖3 d RenSeq分析‘隴薯12號’中的NLR基因Figure 3 d RenSeq analysis of NLR genes on'Longshu 12'

圖4 效應(yīng)子E38在F1群體基因型進(jìn)行農(nóng)桿菌接種的實例Figure 4 Examples of agroinfiltration in F1 population genotypes with effector E38

3 討論

晚疫病是馬鈴薯的第一大病害，嚴(yán)重制約中國乃至世界馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。尋找優(yōu)異抗源材料，挖掘和利用新的R基因，對于促進(jìn)馬鈴薯抗晚疫病育種尤為重要。盡管國內(nèi)外研究者進(jìn)行了大量研究，在馬鈴薯中克隆了近30個晚疫病R基因[9]，但這些基因全部來自野生種，且很多抗性已經(jīng)被克服，包括R pi-blb1/RB、Rpi-sto1和Rpi-pta1[23]等一些廣譜抗性基因抗性被快速進(jìn)化的生理小種克服。馬鈴薯野生種中具有豐富的等位基因多態(tài)性，利用于遺傳育種，可以拓展育種材料的遺傳基礎(chǔ)[24]。然而，野生種與栽培種之間普遍具有雜交不親和、胚乳敗育、雄性不育等生殖障礙[25]，導(dǎo)致野生資源利用難度增大。馬鈴薯普通栽培種經(jīng)過長期的適應(yīng)性選擇，聚集了高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，其中不乏一些晚疫病抗性強(qiáng)的材料。如果能在普通栽培種中篩選到優(yōu)良抗源材料、挖掘R基因，將顯著提高馬鈴薯抗晚疫病育種效率。

本研究所用材料普通栽培種品種‘隴薯12號’植株在田間高抗晚疫病[26]，室內(nèi)接種鑒定對“超級生理小種”CN152外的其余3個菌株表現(xiàn)為高抗或免疫，通過系譜分析發(fā)現(xiàn)‘隴薯12號’含有‘小白花’、‘渭會4號’、‘中德6號’及‘大西洋’的血緣，其中‘小白花’為中國農(nóng)家品種，在1983年出版的《全國馬鈴薯品種資源編目》中記載具有較強(qiáng)晚疫病抗性。近年來，逐漸發(fā)展起來的效應(yīng)子組學(xué)策略大大提高了抗病資源的評價和篩選及R基因的鑒定和利用效率[27]。本研究中晚疫病菌效應(yīng)子E38可以激發(fā)‘隴薯12號’產(chǎn)生特異的HR反應(yīng)，dRenSeq檢測其未包含已知的R基因。然而通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)在F1群體進(jìn)行E38的識別，67%的材料出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，表明群體不適合采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)進(jìn)行效應(yīng)子識別挖掘抗病基因，這與Chen等[13]結(jié)果相符，在其研究中野生種S.verrucosum群體不適合用農(nóng)桿菌或PVX介導(dǎo)的瞬時表達(dá)進(jìn)行高通量的效應(yīng)子組學(xué)篩選和鑒定。

本研究通過晚疫病抗性鑒定、效應(yīng)子E38識別及dRenSeq等方法鑒定獲得‘隴薯12號’為含有未知R基因的優(yōu)良抗源材料，對F1群體采用效應(yīng)子E38識別挖掘抗病基因，但大部分材料出現(xiàn)背景反應(yīng)，證實并非所有材料均適合效應(yīng)子組學(xué)策略識別鑒定。本研究鑒定得到的‘隴薯12號’能夠識別效應(yīng)子E38激發(fā)過敏反應(yīng)，預(yù)示‘隴薯12號’存在潛在抗病基因，為以后克隆其抗病基因、抗病育種實踐和開展馬鈴薯與晚疫病菌分子互作奠定了基礎(chǔ)。