大黃酸聯(lián)合紅景天對肝纖維化大鼠治療作用的研究①

位小杰，劉東璞，賈詩慧 ，薛 超，盧鳳美

(1.佳木斯大學研究生院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

肝臟纖維化的發(fā)生機制復雜多樣，肝細胞損傷原因不單一，當肝細胞發(fā)生炎癥壞死刺激后使原本具有儲脂功能的細胞肝星狀細胞活化轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，并釋放出大量細胞外基質(zhì)，和其生成和吸收之間的平衡打破,最后形成肝纖維化。因此，肝星狀細胞的活化是肝纖維化的關(guān)鍵。實驗證明大黃酸具有抗炎，抗纖維化作用。紅景天有抗氧化應激和抑制自由基的形成的功效。在本課題在前期實驗中得出大黃酸和紅景天聯(lián)合用藥對CCl4誘導的肝纖維化有較好的治療效果，現(xiàn)為探索大黃酸聯(lián)合紅景天對膽汁淤積致肝纖維化的治療作用，為臨床應用提供理論依據(jù)。本實驗采用BDL肝纖維化模型，觀察大黃酸聯(lián)合紅景天對膽汁淤積性肝纖維化治療作用并對其作用機制做初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：健康成年SD雄性大鼠40只，180～220g重。進行觀察喂養(yǎng)5d，挑出健康和營養(yǎng)狀況在同一水平的大鼠進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

將40只大鼠隨機平均分為4組。分別為：假手術(shù)組(Sham組)：膽總管游離術(shù)后利用同等體積的生理鹽水進行灌胃；模型組(Model組)：行BDL術(shù)和生理鹽水灌胃；大黃酸組(R組)：行BDL術(shù)和大黃酸灌胃；大黃酸聯(lián)合紅景天組(RR組)：行BDL術(shù)和大黃酸聯(lián)合紅景天灌胃。

1.2.2 肝纖維化模型制備

大鼠肝纖維化模型是利用膽總管雙重結(jié)扎誘導的肝纖維化模型，將大鼠用4%水合氯醛麻醉后，備皮消毒后開腹，分離膽總管，用0號線雙重結(jié)扎后從中間剪斷膽總管防止再通，生理鹽水沖洗后關(guān)腹，術(shù)后觀察后常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2.3 藥物治療

BDL術(shù)后24h后，R組和RR組在造模的同時，給予治療。R組：按100mg/kg劑量進行灌胃處理。方法：大黃酸用生理鹽水攪拌溶解。RR組：將大黃酸紅景天用生理鹽水溶解后按劑量大黃酸100mg/kg，紅景天400mg/kg劑量進行灌胃處理，每周3次，共4周。

1.2.4 進行生化指標的檢測

取大鼠眼內(nèi)眥靜脈血采用生化分析儀進行檢測AST、ALT、TBIL、DBIL、生化指標檢測。

1.2.5 計算大鼠肝體比

按照公式：肝臟體重(g)/大鼠抽血前體重(g)×100%計算肝體比。

1.2.6 大鼠組織病理學觀察

將大鼠肝組織用無水乙醇固定后，進行取材，脫水透明，侵蠟，做成蠟塊。將蠟塊進行切片，撈片，烘干后進行HE染色，使用普通光學顯微鏡觀察肝組織形態(tài)，任選5個視野拍照。

1.2.7采用RT-PCR測定α-SMA、Hab18G/CD147mRNA的表達

肝組織提取總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄并進行RNA的擴增。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般狀況

S組大鼠整體狀況良好，精神狀況佳，飲食正常，體重逐漸增長。二便正常，尿清，大便成形。M組大鼠在手術(shù)實施后表現(xiàn)痛苦，姿勢呈弓背狀，有明顯炸毛病態(tài)狀，精神萎靡嗜睡，飲食量減少，幾乎不活動，隨后飲食恢復，體重少量增加，大便呈白陶土樣。R組大鼠精神可，飲食可，活動量少。RR組大鼠飲食良好，精神狀況欠佳，體重持續(xù)增長。

2.2 大鼠生化指標

由表1 可以觀察到，與S組比較，M組大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和AST水平均顯著升高(P<0.05) ，提示BDL模型大鼠的膽道梗阻明顯，肝細胞受到嚴重損害。R組和RRALT、AST、TBIL和DBIL的水平與模型對照組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)。說明大黃酸和紅景天用藥能夠降低BDL誘導的肝纖維化大鼠的黃疸水平及肝損傷程度。

表1 不同處理方法對大鼠血清生化指標檢測結(jié)果的影響

2.3 大鼠肝體比

由表2可以看出，各組大鼠肝體比均較S組升高(P<0.05)，說明BDL肝纖維化模型中肝臟有不同程度的損害；R組、RR組肝體比較M組降低(P<0.05)，說明大黃酸單獨用藥和大黃酸和紅景天聯(lián)合用藥均能夠降低肝臟損害；RR組較R組肝體比降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)說明大黃酸和紅景天兩種藥物有協(xié)同治療的作用。

表2 不同處理方法對大鼠肝體比檢測結(jié)果的影響

2.4 大鼠組織病理學觀察

切片進行HE染色后，觀察假手術(shù)組大鼠切片，肝小葉排列整齊，肝細胞形態(tài)正常，未發(fā)生纖維化。模型組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝條索間隙增寬，排列紊亂，伴肝細胞脂肪變，肝小葉間大量纖維膠原大量增生，向小葉間插入，形成纖維變形。大黃酸組肝小葉間有纖維膠原增生，肝細胞大小均一，有少量的脂肪變，纖維化程度減輕。大黃酸聯(lián)合紅景天組纖維組織明顯減少，肝組織纖維化程度最輕。上述結(jié)果由兩名資深病理科醫(yī)師診斷判定。見圖1。

圖1 各組大鼠組織學觀察(×100)

2.5 實驗大鼠肝組織細胞因子α-SMA、Hab18G/CD147 mRNA 表達

為了證實大黃酸聯(lián)合紅景天抗 BDL引起的肝纖維化作用和α-SMA，Hab18G/CD147表達有關(guān)，我們測定了大鼠肝組織中的 α-SMA 、Hab18G/CD147m RNA 水平。由表3可以看出與S組相比，各組α-SMA、Hab18G/CD147mRNA 水平顯著增高(P<0.05)；與M組相比，R組、RR組α-SMA、Hab18G/CD147mRNA表達顯著降低；RR組較R組α-SMA、Hab18G/CD147mRNA表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 大鼠肝組織中細胞因子表達情況

3 討論

膽汁淤積性肝損傷是威脅人們健康的重要原因之一。慢性膽石癥、膽汁淤積性肝炎等均可發(fā)展為膽汁淤積性肝纖維化，其特點是以膽管增生、肝細胞壞死、肝臟纖維化為特征的病理過程，目前臨床上尚未有行之有效的方法[1,2]。BDL誘導的肝纖維化模型與人類膽汁淤積性肝纖維化病變特點有極大的相似之處，具有造模時間短，成功率高，成活性高等特點。由于膽汁淤積及膽汁酸長期作用于肝臟，肝細胞可出現(xiàn)進行性損傷。膽汁淤積性損傷是肝纖維化、肝硬化的誘發(fā)因素[3,4]。在實驗中進行膽總管結(jié)扎后，出現(xiàn)黃疸，膽管增生，肝細胞壞死，纖維結(jié)締組織增生等病理變化。大黃酸聯(lián)合紅景天給藥四周干預后，大鼠肝纖維化程度明顯好轉(zhuǎn)。說明大黃酸聯(lián)合紅景天給藥對肝纖維化有一定的治療作用。

肝臟炎癥會引起肝實質(zhì)的損害，當肝臟受到慢性肝損傷的侵害時，肝臟會啟動修復的機制，肝纖維化物質(zhì)會增加，而降解該物質(zhì)的細胞因子不足或者活性受到抑制從而引起肝纖維化，但是肝纖維化是任何一種肝病走向肝硬化的必經(jīng)之路，有研究證明肝纖維化是可逆轉(zhuǎn)的[5]。肝纖維化的過程中，檢測血清生化指標如 AST、ALT 等都能不同程度地體現(xiàn)出肝臟病變的水平[6]。在實驗中我們觀察到在肝纖維化造模構(gòu)造期間，大鼠肝體比，AST，ALT水平與空白組比較均明顯升高。說明造模過程中肝細胞損害嚴重。TBIL、DBIL為膽汁淤積的血清生化指標，與S組相比，M組大鼠TBIL、DBIL值較高，證實膽總管結(jié)扎后引起了進行性的肝臟損害。給藥四周后，大黃酸組、大黃酸紅景天聯(lián)合用藥組與模型組比較，上述指標均降低，肝纖維化程度有所改善。說明在藥物的作用下肝臟有一定的自愈能力。肝纖維化過程中，肝星狀細胞活化是關(guān)鍵步驟，活化的肝星狀細胞表達于α-SMA，BDL肝纖維化類型α-SMA主要表達在門脈區(qū)[7]。而有研究證明Hab18G/CD147能夠激活肝星狀細胞，并在肝星狀細胞中表達[8]。使肝組織中膠原纖維增生，細胞外基質(zhì)分泌和降解平衡被打破，是造成肝纖維化密切相關(guān)。當大黃酸和紅景天用藥后，α-SMA、Hab18G/CD147mRNA 的表達均明顯降低，說明大黃酸和紅景天作用的基質(zhì)可能與降低α-SMA、Hab18G/CD147mRNA表達有關(guān)。綜上所述，大黃酸聯(lián)合紅景天對BDL誘導的大鼠肝纖維化有一定的治療作用。