姜黃素在治療骨性關(guān)節(jié)炎過程中對關(guān)節(jié)軟骨和滑膜細(xì)胞的作用機制

代萬武 黃祖權(quán) 張 波 李興艷▲

1.廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，廣西南寧 530031；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科，廣西南寧 530031

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以炎癥因子過表達、關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病，涉及軟骨、滑膜、軟骨下骨等細(xì)胞組織，臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)摩擦感或摩擦音、僵硬、運動受限等[1]。OA 的發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)，好發(fā)于負(fù)重較大的關(guān)節(jié)，如膝關(guān)節(jié)，膝骨關(guān)節(jié)炎目前被列為全球第二的高致殘率疾病[2]。目前OA 的治療主要是保守治療、物理治療、手術(shù)治療和中藥康復(fù)治療，但尚無治療方法可以完全治愈OA[3]。OA 的產(chǎn)生和進展是生物力學(xué)異常和炎癥因子共同作用的結(jié)果[4]。在OA 的發(fā)生發(fā)展過程中，許多信號通路、信號因子的激活或抑制參與其中，包括JAK2/STAT3、Wnt/β-catenin、MAPK/ERK1/2 等細(xì)胞通路以及白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1、MMP-3、誘導(dǎo)型一氧化氧合酶（iNOS）等炎癥因子的高表達。

姜黃素是從天然植物的根莖中提取的小分子藥物，廣泛分布在我國各地，自化學(xué)結(jié)構(gòu)被確定以來，發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的抗炎抗氧化作用。尤其是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，姜黃素在抗腫瘤、抗凝、抗炎、抗心肌梗死、抗氧化以及腸道性疾病等方面的藥效被深入發(fā)掘。隨著越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能有效用于OA 的治療，不良反應(yīng)少且經(jīng)濟安全?；诖?，本文就姜黃素在治療OA 過程中涉及的各種信號通路進行綜述，以期能為其下一步深入的臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

1 姜黃素對關(guān)節(jié)軟骨的作用機制

1.1 姜黃素通過介導(dǎo)JAK2/STAT3 信號通路參與軟骨保護作用

迄今為止，共發(fā)現(xiàn)蛋白酪氨酸激酶（januskinase，JAK）有JAK1、JAK2、TYK2 和JAK3 等4 個家族成員。前3 個成員主要分布于多種組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而后者僅分布于骨髓和淋巴系統(tǒng)。信號傳導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STATs）是JAK 家族產(chǎn)生的底物，包含STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B 以及STAT6 等7 個成員，直接將信號傳遞到核內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)特定基因的表達。

研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)以及細(xì)胞損傷后的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等過程[5]。其中，JAK1 和JAK3 激酶的變異與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等免疫系統(tǒng)炎癥性疾病密切相關(guān)[6]。該通路受多種細(xì)胞因子如IL（IL-2、IL-9、IL-15、IL-21）、干擾素（α、β、γ）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、血小板源生長因子（PDGF）、表皮細(xì)胞生長因子（EGF）等刺激。李旭升等[7]采用腹腔注射研究姜黃素治療Glasson 等方法誘導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎，通過觀察軟骨細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3 及Bax 蛋白表達水平的變化和軟骨細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶（SDH）、大腦組織線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶（COX）蛋白的表達情況來研究姜黃素治療OA 的機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)炎所致的p-JAK2、p-STAT3蛋白表達水平的降低以及Bax 蛋白表達水平的升高，同時加強SDH、COX 蛋白的表達水平。采用JAK抑制劑Filgotinib 抑制JAK/STAT 信號通路后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ilgotinib 可持續(xù)改善對甲氨蝶呤（MTX）不敏感的RA 患者，提高ACR20 的應(yīng)答率，且提高劑量后并未出現(xiàn)抑制劑相關(guān)的不良反應(yīng)（如貧血）。說明在OA 病程中JAK2/STAT3 信號通路被一定程度抑制，使得軟骨細(xì)胞凋亡水平增加，線粒體的抗氧化應(yīng)激能力下降，證明姜黃素可以有效激活該信號通路，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞線粒體的抗氧化應(yīng)激能力（表1）。

表1 姜黃素治療骨性關(guān)節(jié)炎過程中參與的信號通路

1.2 姜黃素通過介導(dǎo)Wnt/β-catenin 信號通路參與軟骨保護作用

Wnt 信號通路廣泛分布于細(xì)胞中，調(diào)控著細(xì)胞分化、免疫、應(yīng)激、凋亡等生命過程，該通路的激活和抑制可以調(diào)控軟骨細(xì)胞的移行、分化和增殖以及關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的形成和分解[22]。Wnt/β-catenin 信號通路被認(rèn)為是骨骼、軟骨和關(guān)節(jié)發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在包括間充質(zhì)干細(xì)胞的凝結(jié)和分化，維持成熟的軟骨表型，軟骨內(nèi)骨化過程中的肥大性成熟以及組織變性和再生中起著至關(guān)重要的作用[23]。

在骨關(guān)節(jié)分化和損傷修復(fù)過程中，Wnt/β-catenin通路起著至關(guān)重要的作用。在誘導(dǎo)干細(xì)胞（如脂肪干細(xì)胞）向軟骨方向分化過程中[24]，Wnt 通路前期促進脂肪干細(xì)胞快速增殖，上調(diào)Sox9 促進成軟骨分化，后期下調(diào)Sox9 表達，削弱成熟軟骨表型，促進軟骨肥大和早期軟骨骨化，并且Sox9 的過表達會反饋抑制Wnt 通路活性，維持軟骨表型，延遲軟骨肥大和早期成骨進展。體內(nèi)體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，力學(xué)的異常壓迫（如肥胖）也會誘導(dǎo)激活Wnt/β-catenin 信號通路和抑制E-cadherin 與β-catenin 之間的物理蛋白相互作用來促進終板軟骨變性，導(dǎo)致軟骨破壞[25]。馬勇等[8]采用兔軟骨體外研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L 的姜黃素能夠促進Wnt2 和β-catenin 蛋白水平的表達，抑制GSK-3β 的蛋白水平的表達，推測姜黃素可以通過該通路促進軟骨細(xì)胞增殖。舒子震等[9]采用SD 大鼠模型造模后予以灌胃療法發(fā)現(xiàn)姜黃素可以有效促進β-catenin 蛋白水平的表達，證明姜黃素可通過Wnt 通路中改善關(guān)節(jié)炎以及抵抗關(guān)節(jié)軟骨損傷。

1.3 姜黃素通過介導(dǎo)NF-κB 信號通路參與軟骨保護作用

核因子活化B 細(xì)胞κ 輕鏈增強子（NF-κB）廣泛存在于所有動物細(xì)胞類型中，是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與機體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)。NF-κB 信號通路的過度激活，可導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病。依賴NF-κB 的信號傳導(dǎo)是OA 的重要調(diào)節(jié)劑，在人OA 軟骨細(xì)胞中G 蛋白偶聯(lián)受體激酶5（G protein-coupled receptor kinase，GRK5）基因的抑制導(dǎo)致OA 相關(guān)炎癥因子（IL-6、MMP-13）的表達和NF-κB 的轉(zhuǎn)錄（ADAMTS-4）均下調(diào)。可見GRK5可通過參與分解代謝反應(yīng)來調(diào)控軟骨細(xì)胞的降解進而調(diào)節(jié)NF-κB 途徑，是OA 治療的潛在靶標(biāo)。另外，在IL-1β 誘導(dǎo)的OA 進程中，伴隨有miR-27a-3p 的上調(diào)，而MAPK 和NF-κB 信號通路的激活能夠抑制其進一步上調(diào)，延緩OA 的進一步發(fā)展[26]。

王健等[10]通過Hulth 法[27]建立大鼠創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎模型后提取關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，然后利用姜黃素進行治療后，再檢測核因子κB P65 核內(nèi)外表達情況以及細(xì)胞Ⅱ型膠原、MMP-1 和MMP-13 的表達狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠通過抑制軟骨細(xì)胞核因子κB 信號通路的活化，從而抑制核因子κB P65 核轉(zhuǎn)位，進而抑制軟骨細(xì)胞釋放MMP-1、MMP-13 的表達，使得Ⅱ型膠原的含量增加，保護軟骨細(xì)胞治療OA。孫達鋒等[28]通過木瓜蛋白酶構(gòu)建兔骨性關(guān)節(jié)炎早期模型，隨后關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射姜黃素治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠有效緩解OA 的退變，推測作用機制與IL-1β/Iκβ 激酶β（IKKβ）/NF-κB/COX-2、MMP-9 兩個正反饋信號的阻斷密切相關(guān)。

1.4 姜黃素通過介導(dǎo)MAPK/ERK1/2 信號通路參與軟骨保護作用

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)的同時調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化以及凋亡等生理過程。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路通過磷酸化作用參與細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控，是與細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)的一種信號調(diào)節(jié)通路。炎癥因子刺激激活MAPKs 信號通路可以引起MMPs 表達增加和軟骨細(xì)胞破壞、凋亡等一系列反應(yīng)。通過抑制ERK 信號通路上游的靶點MEK1/2 后發(fā)現(xiàn)ERK的活化減弱，并且顯著減少了OA 中軟骨損傷。此外，在聯(lián)合沉默ERK1 和ERK2 條件下可明顯抑制IL-1β誘導(dǎo)的炎癥軟骨細(xì)胞中MMP-13、MMP-3、COX-2 以及前列腺素E2（PGE2） 等的表達水平，說明MAPK/ERK1/2 信號通路和OA 密切相關(guān)。

李曉東等[11]采用姜黃素預(yù)處理IL-1β 誘導(dǎo)的SD大鼠炎癥軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠上調(diào)炎癥軟骨細(xì)胞的自噬水平，使自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ和Beclinl 的表達增加，同時增加軟骨細(xì)胞內(nèi)ERK1/2 的磷酸化程度，抑制OA 軟骨細(xì)胞的凋亡，起到軟骨保護作用。姜黃素聯(lián)合白藜蘆醇可以有效抑制炎癥軟骨細(xì)胞中IL-1β 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和ERK1/2 的下調(diào)，這是由于激活了MEK/ERK 信號通路，證明了這是維持軟骨細(xì)胞分化和存活的途徑之一。此外有研究證明，姜黃素還可以作為AP-1 抑制劑參與抑制IL-1β 誘導(dǎo)導(dǎo)致的MMP-1 的高表達[13]。同時，姜黃素作為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）抑制劑能夠特異性抑制CBP/p300，從而降低組蛋白乙?；饔茫档虸L-6 基因的表達，因此姜黃素可以作為HAT 抑制劑用于RA 的新型表觀遺傳治療劑。

1.5 姜黃素通過介導(dǎo)Nrf2/ARE 信號通路參與軟骨保護作用

核轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系2p45 相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid-2p45 related factor 2，Nrf2）被認(rèn)為是參與調(diào)控氧化應(yīng)激中的重要因子[29]，位于細(xì)胞質(zhì)中。氧化應(yīng)激可以激活氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）同Nrf2的解離，釋放Nrf2 從而啟動抗氧化酶的表達。姜黃素可通過抑制Keap1、調(diào)控Nrf2 上游介體、調(diào)控Nrf2 和靶基因的表達以及調(diào)控Nrf2 核轉(zhuǎn)運四種方式來刺激Nrf2 信號通路。

宋永周等[30]用姜黃素治療體外過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的炎癥軟骨細(xì)胞后測定細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶、丙二醛、過氧化氫酶含量以及Nrf2 基因和蛋白的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)姜黃素預(yù)處理后的軟骨細(xì)胞存活率、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶水平升高，丙二醛水平降低，Nrf2 基因和蛋白表達水平均上升，推測姜黃素通過激活Nrf2 核轉(zhuǎn)位，激活Nrf2-ARE 信號通路有關(guān)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)[15，31]，姜黃素可以作為外源性Nrf2 激動劑誘導(dǎo)Nrf2 的釋放，使得抗氧化酶的表達增高，通過降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平來保護軟骨細(xì)胞的損傷。在研究姜黃素治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（TMJ OA）的機理中，姜黃素通過Nrf2/ARE 信號通路抑制炎癥、氧化應(yīng)激和炎性軟骨細(xì)胞的基質(zhì)降解，通路分析表明ROS/Nrf2/HO-1-SOD2-NQO-1-GCLC 是其關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸，從而保護軟骨細(xì)胞[32]。

1.6 姜黃素通過介導(dǎo)PI3K/Akt/mTOR 信號通路參與軟骨保護作用

mTOR 信號通路參與機體包括生長、增殖、血管生成、代謝和自噬等病理生理過程。關(guān)節(jié)軟骨的衰老與自噬的減少密切相關(guān)。PI3K/AKT/mTOR 信號通路參與RA 大鼠的軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和自噬過程。藤黃酸通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路抑制RA 大鼠的炎癥反應(yīng)。Zhang 等[16]應(yīng)用自發(fā)和手術(shù)誘導(dǎo)OA 模型后研究姜黃素通過自噬相關(guān)途徑治療OA 的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素治療后關(guān)節(jié)軟骨自噬增加（LC3 和Be clin1）、凋亡減少（caspase-3 和Bax/Bcl2）和軟骨基質(zhì)降解減少（MMP13、ADAMTS-5、Col2a1 和聚集蛋白聚糖），證明了姜黃素可以通過調(diào)節(jié)Akt/mTOR 途徑促進自噬保護軟骨。

2 姜黃素對關(guān)節(jié)滑膜的作用機制

在骨性關(guān)節(jié)炎的病程進展中，關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨板和滑膜組織增生是主要的病理改變，滑膜組織增生參與OA 的進展。Bcl-2/bax 信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要通路，參與細(xì)胞及線粒體膜穩(wěn)定性調(diào)控，其激活可以加速細(xì)胞凋亡。姜黃素可以通過對線粒體途徑中的bax 和bcl-2 蛋白表達的調(diào)節(jié)來調(diào)控caspase-3、CytC、PARP 降解以及BID 斷裂從而誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡[17]，下調(diào)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞NFκB 的表達和活性，抑制其增殖[18]，這和Kloesch[33]的研究中認(rèn)為姜黃素能夠抑制NF-κB 的活化，誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡的觀點一致。此外，姜黃素還可以通過調(diào)控滑膜細(xì)胞的OPG/RANKL 信號通路，降低RANKL 表達，提高OPG 表達來治療OA[20]。代謝組學(xué)研究姜黃素在RA 滑膜中的作用機制發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以一定程度上逆轉(zhuǎn)TNF-α 引起的代謝紊亂，推測是由于氨基酸和脂肪酸代謝的中間體恢復(fù)導(dǎo)致的，這表明姜黃素預(yù)防關(guān)節(jié)發(fā)炎的作用可能與氨基酸代謝產(chǎn)物水平的恢復(fù)有關(guān)，如瓜氨酸或甘氨酸等。另有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以通過靶向Akt1-mTOR 途徑來抑制Akt1 的表達水平，減輕RA 引起的炎癥和滑膜增生[19]。此外，姜黃素還可以通過蛋白激酶Cδ（PKCδ）/JNK/c-Jun 途徑抑制滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中PKCδ 磷酸化下調(diào)MMP-1 和MMP-3 的表達，同時減少滑膜和軟骨細(xì)胞中炎癥因子的表達從而達到治療OA 的效果。

3 姜黃素的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，姜黃素的研究仍主要集中在細(xì)胞和動物層面上，如小鼠、兔、狗等動物，在臨床上的應(yīng)用相對較少，且主要集中在國外。治療方案以膠囊口服為主，暫無關(guān)節(jié)腔注射和敷貼治療。Goel 等[34]為姜黃素治療活動性RA 患者的安全性和優(yōu)越性提供了第一個證據(jù)，但缺點是參與的臨床患者病例數(shù)較少。隨后，Henrotin等[35]采用雙盲多中心隨機安慰劑對照三臂方案研究150 例膝骨關(guān)節(jié)炎患者接受姜黃素治療后連續(xù)隨訪90 d，對患者的疾病活動進行整體評估和觀察患者的血清sColl2-1（軟骨降解的生物標(biāo)志物），結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素可以下調(diào)軟骨的分解代謝，減慢軟骨結(jié)構(gòu)的進程，且安全且耐受性良好，無嚴(yán)重不良反應(yīng)。Appelboom 等[36]回顧性研究820 例臨床患者口服新姜黃提取物（Flexofytol）4~6 粒/d，連續(xù)治療6 個月以上后發(fā)現(xiàn)，該提取物耐受性極好，對關(guān)節(jié)活動度、疼痛和生活質(zhì)量具有快速益處，且一定程度上可以減少鎮(zhèn)痛藥和抗炎藥的使用。另外一項雙盲前瞻性隨機臨床試驗發(fā)現(xiàn)，把姜黃素作為雙氯芬酸在原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎的輔助治療中具有一定效益但無統(tǒng)計學(xué)意義[37]。但是其他研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素植物體磷脂酰復(fù)合物（Meriva）能夠有效減輕骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛并改善了關(guān)節(jié)功能，且比硫酸軟骨素更快地起效并改善結(jié)局。隨后的100 例OA 研究發(fā)現(xiàn)，Meriva 還可以改善一系列炎癥標(biāo)志物和沉降速率，因此他們認(rèn)為姜黃提取物在治療OA 方面似乎與布洛芬一樣有效，且消化道不良事件較少。最新的一項研究給予患者每天口服姜黃素復(fù)合物膠囊3 次，連續(xù)12 周后，觀察患者的關(guān)節(jié)痛指數(shù)、晨僵、身體機能以及對疾病的嚴(yán)重程度進行整體評估后發(fā)現(xiàn)，在12 周后即可減輕OA 患者的疼痛相關(guān)癥狀[38]。

關(guān)于姜黃素的治療劑量，許多研究認(rèn)為姜黃素在人體臨床試驗和系統(tǒng)評價中被認(rèn)為是安全可耐受的，且長期研究未顯示有毒性[39]。但在一些較高劑量（8~12 g）使用情況下發(fā)現(xiàn)部分受試者有輕度的惡心或腹瀉現(xiàn)象[40]?？偟膩碚f，當(dāng)改善骨關(guān)節(jié)炎所需的劑量低于2 g/d 時，尚未見有副作用的報告。

4 總結(jié)與展望

目前，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展機制尚未完全明確，是一個極其交錯復(fù)雜的過程，但研究發(fā)現(xiàn)，諸如生長因子、炎性細(xì)胞因子、機械生物力學(xué)異常、氧化應(yīng)激和信號通路分子等許多因素都參與該過程。幸運的是，分子醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和交叉學(xué)科的快速發(fā)展為軟骨修復(fù)、軟骨再生提供了理論基礎(chǔ)。藥物在治療OA 過程中涉及許多信號通路的參與，并非是具有抗炎抗氧化作用就可以用于OA 的治療，應(yīng)該尋找具有特異性靶向作用的小分子藥物。未來的研究方向可以針對性地尋找安全有效的藥物來調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，預(yù)防或抑制OA 中的炎癥因子以及軟骨細(xì)胞修復(fù)、凋亡。

綜上所述，姜黃素是一種療效相對明確的天然藥物，近些年的多項臨床宏觀研究展現(xiàn)出了其較傳統(tǒng)藥物在鎮(zhèn)痛和功能恢復(fù)等方面的優(yōu)勢。另外，基礎(chǔ)實驗的微觀機制研究也表明了姜黃素可以通過多條信號通路參與骨性關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的調(diào)節(jié)。但在目前的機制研究中，尚未有報道姜黃素在鎮(zhèn)痛方面的機制探討。因此，應(yīng)將臨床和基礎(chǔ)研究充分結(jié)合，再輔以生物支架等組織工程學(xué)的多學(xué)科領(lǐng)域研究，為今后姜黃素在進一步的臨床廣泛應(yīng)用中提供理論基礎(chǔ)。