液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速篩查海水中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素

吳明媛,余 燾,謝宗升,龐燕飛,黃國秋,黃鸞玉,楊姝麗?

(1.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院,南寧 530021;2.廣西壯族自治區(qū)土壤肥料工作站,南寧 530007)

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是由鏈霉素產(chǎn)生的一類弱堿性抗生素,為一個(gè)內(nèi)酯環(huán)通過糖苷鍵連接一個(gè)或多個(gè)脫氧糖的結(jié)構(gòu),可通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成來發(fā)揮抗菌作用。常用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素主要有十四元環(huán)的紅霉素(ERY)、羅紅霉素(ROM)、氟紅霉素(FRM)、克拉霉素(CLM)、竹桃霉素(OLM),十五環(huán)的阿奇霉素(AZM),十六元環(huán)的泰樂霉素(TLS)、替米考星(TMC)、交沙霉素(JSM)等。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素除了可以預(yù)防和治療人類細(xì)菌感染,也被廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中,用于治療疾病、提高飼料利用率和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[1]。

大量使用的抗生素最終以原型或代謝物的形式隨排泄物進(jìn)入環(huán)境,在我國大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在環(huán)境中檢出已有較多報(bào)道。文獻(xiàn)[2]報(bào)道了在嘉興10個(gè)典型村鎮(zhèn)河道斷面均檢出大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,其質(zhì)量濃度為3.1～14.68 ng·L－1,顯著高于市區(qū)河道的最高檢出值(6.2 ng·L－1),表明養(yǎng)殖污染可能是導(dǎo)致當(dāng)?shù)乜股匚廴镜闹饕?文獻(xiàn)[3-4]調(diào)查了深圳西麗水庫和石巖水庫中10種抗生素殘留情況,其中脫水紅霉素在枯水期和豐水期均有檢出,質(zhì)量濃度為1.8～23.0 ng·L－1;文獻(xiàn)[5]在北京地區(qū)清河地表水中檢出脫水紅霉素、CLM、ROM,平均質(zhì)量濃度分別為47,118,103 ng·L－1。殘留在環(huán)境中的抗生素除了隨著食物鏈傳遞威脅人類健康外,還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性基因,進(jìn)而形成耐藥性,目前已成為全球公共安全問題。

海水基質(zhì)中含有大量鹽分,其中抗生素殘留為ng·L－1級(jí)別,需要富集后檢測(cè)。目前報(bào)道的環(huán)境中抗生素檢測(cè)主要使用固相萃取柱富集,然后用液相色譜或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)[6-11]。HLB固相萃取柱對(duì)抗生素有較好的富集效果,但由于柱流量對(duì)回收率影響較大,為了獲得更好的回收率,通常富集500 mL樣品需要用時(shí)1 h以上。而固相萃取膜由于比表面積大,對(duì)大體積水樣富集有明顯優(yōu)勢(shì),500 mL樣品10 min內(nèi)即可完成富集,提高了樣品處理效率。四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜具有可獲取一、二級(jí)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)的功能,通過提取一級(jí)全掃描譜圖中分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)就可獲得提取離子流圖,從而實(shí)現(xiàn)高通量的目標(biāo)物或非目標(biāo)物的篩查,確定的目標(biāo)物在一級(jí)全掃描的同時(shí)可以獲得二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖,得到高可靠性的確證結(jié)果。

本工作基于C18固相萃取膜技術(shù),建立了液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜法檢測(cè)海水中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的方法。該方法縮短了樣品前處理時(shí)間,所得方法的靈敏度和準(zhǔn)確度能滿足海水中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測(cè)要求,可為了解環(huán)境中抗生素污染水平提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Fisher U3000/Q Exactive 型液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀;XS205DU 型電子天平;三位固相膜萃取裝置;Empore C18固相萃取膜(直徑47 mm)。

抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L－1,稱取ERY、ROM、FRM、CLM、AZM、OLM、TLS、TMC、JSM 標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg,用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中,于－18 ℃保存。

甲醇、乙腈為色譜純;甲酸、乙酸銨為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9μm,);柱溫35 ℃;流量0.2 mL·min－1;進(jìn)樣體積20μL;流動(dòng)相A 為乙腈,B 為含0.1% (體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的0.005 mol·L－1乙酸銨溶液。梯度洗脫程序:0～5.0 min時(shí),A 為10%;5.0～6.0 min時(shí),A 由10%升至50%,保持5.0 min;11.1～13.0 min時(shí),A 由50%降至10%。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源,噴霧電壓3 200 V;鞘氣為氮?dú)?壓力275 k Pa;輔助氣為氮?dú)?壓力69 k Pa;離子傳輸管溫度320 ℃;掃描模式為一級(jí)全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描(Full MS/dd-MS2)。一級(jí)掃描:掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)150～1 000,分辨率70 000,自動(dòng)增益控制目標(biāo)(AGC target)3×106,最大注入時(shí)間200 ms;二級(jí)掃描:分辨率17 500,AGC target 2×105,最大注入時(shí)間50 ms,歸一化碰撞能量35 e V。其余質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 9種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters of 9 macrolide antibiotics

1.3 試驗(yàn)方法

取500 mL 水樣,用氨水調(diào)節(jié)pH 至10,加入5 mL異丙醇,混勻。先將固相萃取膜依次用5 mL甲醇、5 mL 水預(yù)處理,再取水樣以50 mL·min－1流量過膜,然后用10 mL水淋洗固相萃取膜,減壓抽干去除殘留水分,再用10 mL甲醇洗脫。洗脫液在40 ℃下氮吹至干,加入1 mL 20%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液,旋渦混合溶解殘?jiān)?經(jīng)0.22μm濾膜過濾后,按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取條件的選擇

樣品的酸度會(huì)影響抗生素離子化狀態(tài),從而影響抗生素與固相萃取材質(zhì)的結(jié)合效率[12]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為弱堿性化合物,pKa為7～9,在中性條件下會(huì)部分生成陽離子,與硅羥基結(jié)合較強(qiáng),難以洗脫。而大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在強(qiáng)堿性下不穩(wěn)定,當(dāng)pH 大于11時(shí)內(nèi)酯環(huán)容易破裂。因此,試驗(yàn)將過膜的海水pH 調(diào)節(jié)為7,8,9,10,添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后按照前處理方法富集洗脫,考察酸度對(duì)目標(biāo)物回收率的影響,結(jié)果見圖1。

圖1 酸度對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素富集效果的影響Fig.1 Effect of acidity on enrichment effect of macrolide antibiotics

由圖1可見:海水pH 為10時(shí),9種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率為79.4%～105%,結(jié)果最優(yōu)。故試驗(yàn)選擇海水樣品的pH 為10。

2.2 液相色譜條件的選擇

液相色譜分離抗生素,常用的流動(dòng)相主要為甲醇-水、乙腈-水體系。試驗(yàn)比較了甲醇、乙腈兩種有機(jī)相對(duì)目標(biāo)物的色譜分離及峰形的影響,發(fā)現(xiàn)甲醇-水體系中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素出峰較晚且峰形寬,在乙腈-水體系下出峰時(shí)間較短且峰形好。進(jìn)一步嘗試在水相中添加0.005 mol·L－1乙酸銨和0.1%甲酸以提高離子化效率,所得9種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素提取離子色譜圖見圖2。

由圖2可見,9種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素峰形尖銳且對(duì)稱,靈敏度高。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜具有精確質(zhì)量數(shù)的功能,按照歐盟規(guī)定,只要有準(zhǔn)分子離子和一個(gè)碎片離子的精確質(zhì)量數(shù),完成化合物確證。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素含有胺基,容易質(zhì)子化,[M＋H]＋峰響應(yīng)很好,因此在正離子模式下采用Full MS/dd-MS2模式分析。對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行一級(jí)全掃描,從一級(jí)質(zhì)譜中提取各化合物精確質(zhì)量數(shù),得到提取離子色譜圖(圖2),用于外標(biāo)法定量。

圖2 9種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of 9 macrolide antibiotics

當(dāng)設(shè)定的目標(biāo)物一級(jí)離子響應(yīng)達(dá)到閾值時(shí),儀器自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)掃描,得到二級(jí)離子全掃描譜圖,根據(jù)二級(jí)譜圖中特征子離子精確質(zhì)量數(shù)可完成化合物確證。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素由內(nèi)酯環(huán)通過糖苷鍵與1～3個(gè)脫氧糖相連構(gòu)成,主要斷裂發(fā)生在糖苷鍵,得到脫氧糖苷碎片離子[13-15]。ERY、ROM、FRM、CLM、OLM、AZM 二級(jí)質(zhì)譜的基峰為m/z158,TLS、JSM、TMC二級(jí)質(zhì)譜的基峰為m/z174,推測(cè)為C-5位 的脫氧氨基糖,分子式分別為[C8H16NO2]＋和[C8H16NO3]＋。ERY、ROM、FRM、CLM、AZM 的二級(jí)質(zhì)譜次強(qiáng)峰為脫去C-3位克拉定糖得到的[M＋H－C8H14O3]＋,OLM 的二級(jí)質(zhì)譜次強(qiáng)峰m/z544為脫去C-3 位齊墩果糖的[M＋H－C7H13O3]＋。TLS的m/z772 推測(cè)為脫去C7H12O3后,氫重排得到的[M ＋H－C7H12O3]＋。TMC 的m/z696 推測(cè)為脫去脫氧氨基糖C8H15O3N所得,JSM 的基峰m/z109推測(cè)為[C7H9O]＋。

在同樣測(cè)試條件下,陽性樣品保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間相對(duì)偏差在±5%以內(nèi),且檢測(cè)到母離子與二級(jí)碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)與理論值的相對(duì)偏差絕對(duì)值小于5.0×10－4%可以確證該化合物。母離子的精確質(zhì)量數(shù)及其與理論值之間的相對(duì)偏差、子離子的精確質(zhì)量數(shù)見表1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

用20%甲醇溶液稀釋抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,配成質(zhì)量濃度為1～500μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按照儀器工作條件測(cè)定。以9種抗生素的峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明:9 種抗生素的質(zhì)量濃度在1～500μg·L－1內(nèi)與峰面積響應(yīng)值呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.996 0,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

按照準(zhǔn)分子離子的3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比計(jì)算檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),檢出限和測(cè)定下限結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

選擇未檢出大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的海水樣品作為空白基質(zhì)樣品,分別在20,100,200 ng·L－1的3個(gè)濃度水平的抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行樣品,按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

結(jié)果表明:在3個(gè)添加水平下,9種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素平均回收率為79.0%～105%,測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于7.5%。

2.6 實(shí)際樣品分析

取2019年9月采自廣西北部灣貝類養(yǎng)殖區(qū)域的海水樣品,應(yīng)用所建立方法對(duì)25個(gè)水樣中9種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進(jìn)行檢測(cè),ROM、CLM、AZM、TMC均有不同程度地檢出,質(zhì)量濃度分別在2.71,4.25,1.22,4.17 ng·L－1以內(nèi),與其他文獻(xiàn)報(bào)道相比,處于較低水平。

本工作通過固相萃取膜技術(shù)結(jié)合液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法,建立了海水中9種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物的快速篩查的確證方法,在13 min內(nèi)完成了對(duì)9 種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物的分析。方法具有前處理簡(jiǎn)單、分析速度快、靈敏度高的特點(diǎn),準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足海水中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的快速分析需要。