基于轉(zhuǎn)錄組測序番茄抗南方根結(jié)線蟲相關(guān)基因的挖掘

陸秀紅，黃金玲，李紅芳，周 焰，劉志明

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實驗室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)可寄生于多種作物根系[1]，引起的番茄(Lycopersiconesculentum)根結(jié)線蟲病是番茄的重要病害之一，一般使番茄減產(chǎn)10 %～20 %，嚴(yán)重的地塊減產(chǎn)75 %以上[2]。生產(chǎn)上采用輪作和殺線劑等方法進(jìn)行根結(jié)線蟲病防治雖取得一定的防治效果，但種植抗病品種才是防治該病最經(jīng)濟(jì)有效和安全的方法。目前生產(chǎn)上使用的番茄栽培品種多為感病品種，少數(shù)抗病品種存在遺傳基礎(chǔ)狹窄及抗性單一等問題。挖掘新抗源及植物天然抗病基因，獲得具有抗根結(jié)線蟲病特性的轉(zhuǎn)基因番茄植株是一條有效的番茄育種途徑[3]。目前，番茄抗根結(jié)線蟲分子育種研究已取得一定進(jìn)展，但應(yīng)用最廣的抗病基因Mi-1存在熱不穩(wěn)定性和自然界中存在Mi-1抗性小種等局限，限制了其廣泛應(yīng)用[4]。因此，挖掘番茄與南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)侵染響應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵抗性基因，對番茄抗性基因克隆及番茄抗病分子育種具有重要意義?！厩叭说难芯窟M(jìn)展】國外育種專家早在20世紀(jì)40年代就開始番茄抗根結(jié)線蟲基因挖掘工作[5-6]，迄今已發(fā)現(xiàn)10個抗性基因(Mi-1、Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-7、Mi-8、Mi-9和Mi-HT)，這些基因均來源于野生番茄材料，其中從秘魯番茄(Solanumperuvianum)中克隆的Mi-1基因是目前番茄中唯一可利用且很有效的根結(jié)線蟲抗性基因，將其導(dǎo)入栽培番茄獲得了具有較強(qiáng)抗病性的轉(zhuǎn)基因番茄[7]。1998年，Milligan等[8]采用同位克隆方法首次克隆Mi-1基因，該基因編碼1257個氨基酸殘基，屬于NBS-LRR類抗性基因家族，其蛋白產(chǎn)物可能通過識別某些線蟲產(chǎn)物在線蟲侵染區(qū)域誘導(dǎo)發(fā)生過敏性反應(yīng)而抑制線蟲取食。Kaloshian等[9]采用重組鑒定技術(shù)成功將Mi-1基因定位于番茄6號染色體短臂上的一段小區(qū)域。Kiewnick等[10]、Brito等[11]研究認(rèn)為，Mi-1基因表現(xiàn)對溫度敏感，當(dāng)土壤溫度超過28 ℃時對根結(jié)線蟲失去抗性；Mi-1基因能有效抵抗南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)和花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)3種常見根結(jié)線蟲，但不抗北方根結(jié)線蟲(M.hapla)和象耳豆根結(jié)線蟲(M.enterolobii)，因此影響其廣泛應(yīng)用。轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出所有RNA的總和，轉(zhuǎn)錄組研究是一個發(fā)掘新功能基因的重要途徑[12-13]。李海燕等[14]對大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)侵染前后的抗病大豆品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選獲得1045個差異表達(dá)基因，其中參與苯丙胺類代謝相關(guān)的基因在接種線蟲后除1個基因下調(diào)外其余Unigenes均不同程度上調(diào)表達(dá)，而苯丙烷類代謝是植物抗病反應(yīng)中重要的代謝途徑之一，可形成植保素、木質(zhì)素和酚類化合物等次生代謝物。Das等[15]對南方根結(jié)線蟲誘導(dǎo)豇豆產(chǎn)生的取食位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)活性氧(ROS)濃度的差異及毒素的誘導(dǎo)等在豇豆對南方根結(jié)線蟲的抗性機(jī)制中發(fā)揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文第1作者前期研究發(fā)現(xiàn)，來源于廣西的野生番茄材料F5高抗南方根結(jié)線蟲[16]，但目前對其抗病基因及抗性機(jī)制的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】檢測南方根結(jié)線蟲侵染和未侵染番茄抗性材料F5樣本的轉(zhuǎn)錄組，篩選番茄抗線蟲侵染相關(guān)基因，為其克隆及番茄抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

番茄抗南方根結(jié)線蟲材料F5為第1作者在廣西柳州市郊區(qū)采集的野生番茄材料，經(jīng)抗性鑒定屬于高抗材料[14]。供試南方根結(jié)線蟲采自廣西南寧市郊區(qū)蔬菜大棚，經(jīng)單卵塊純化后接種于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院網(wǎng)室內(nèi)番茄苗上繁殖備用。試驗時在解剖鏡下挑取南方根結(jié)線蟲卵囊，于25 ℃恒溫箱中孵化為二齡幼蟲。

1.2 線蟲接種與樣本采集

將番茄材料播種于育苗盆中，置于溫室內(nèi)(平均氣溫25.63 ℃，平均相對濕度49.36 %，平均光照強(qiáng)度9930.00 lx)培養(yǎng)，待苗長至4片真葉時移栽于裝有無根結(jié)線蟲土壤的花盆(直徑20 cm，高12 cm)中，每盆種植3株，重復(fù)4次，共12株。移栽后10 d接種南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲，每盆接種含有1500頭二齡幼蟲的線蟲液。對照接種等量清水。接種24 h后分別取番茄植株根尖組織3 cm約500 mg，液氮冷凍后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取與檢測

對照組(LE-root)和試驗組(LE-rootm)番茄根尖組織總RNA由北京諾禾致源科技股份有限公司提取，以Nanodrop分光光度計檢測RNA純度，采用Agilent 2100核酸分析儀對提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測。

1.4 文庫構(gòu)建及測序

對檢測合格的總RNA用帶有Oligo(dT)的磁珠進(jìn)行mRNA富集，然后加入Fragmentation Buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA Polymerase Ⅰ合成二鏈cDNA，隨后對雙鏈cDNA進(jìn)行純化、末端修復(fù)、加尾并連接測序接頭，最后進(jìn)行片段大小選擇和PCR富集獲取cDNA文庫。文庫檢測合格后進(jìn)行Illumina HiSeqTM4000。

1.5 測序數(shù)據(jù)處理與分析

測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別(Base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(Original sequence)。對原始數(shù)據(jù)(Raw reads)進(jìn)行過濾，去除帶接頭和N比率大于10 %及低質(zhì)量的Reads，得到高質(zhì)量序列(Clean reads)。將Clean reads與番茄參考基因組數(shù)據(jù)庫(https://solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersi-coides/genome)進(jìn)行比對后進(jìn)行分類注釋和分布情況統(tǒng)計。

1.6 差異表達(dá)基因篩選

對測序得到的原始Reads進(jìn)行評估，經(jīng)TMM標(biāo)準(zhǔn)化處理后，獲得對照組(LE-root)和試驗組(LE-rootm)的基因表達(dá)量。根據(jù)模型進(jìn)行假設(shè)檢測概率計算，最后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗校正得到PDR值，并以|log2(Fold change)|>1和q-value<0.005為標(biāo)準(zhǔn)對差異表基因進(jìn)行篩選。

1.7 差異表達(dá)基因本位數(shù)據(jù)庫(GO)和Pathway顯著性富集(KEGG)分析

基于GO，分別從分子功能(Molecular function)、生物過程(Biological process)和細(xì)胞組成(Cellular component)3個部分對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋；以KEGG數(shù)據(jù)庫中的Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比在差異表達(dá)基因中顯著性富集的Pathway，采用Fisher進(jìn)行精確檢驗，通過Bonferroni校正法進(jìn)行校正，得到差異基因顯著富集的GO功能類和代謝通路，從中篩選顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行重點(diǎn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄根尖組織總RNA的檢測結(jié)果

經(jīng)檢測，所提取對照組(LE-root)和試驗組(LE-rootm)番茄根尖組織樣本的總RNA濃度分別為896和1021 ng/μl，RNA質(zhì)量完整性指標(biāo)(RIN)分別為8.1和8.5，說明番茄根尖組織樣本的總RNA濃度及質(zhì)量均滿足測序要求。

2.2 HiSeq測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果

對照組(LE-root)和試驗組(LE-rootm)的原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果(表1)顯示，Raw reads數(shù)分別為58 604 202和55 241 162條，經(jīng)過濾得到Clean reads數(shù)分別為55 983 020和52 789 772條，分別占總Raw reads數(shù)的95.52 %和95.56 %，測序cDNA讀取量分別為8.40和7.92 G，滿足Q20分別為97.58 %和97.62 %，滿足Q30分別為93.84 %和93.94 %，GC含量分別為42.28 %和42.15 %。說明HiSeq測序質(zhì)量較高，能滿足進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析要求。

表1 原始圖像數(shù)據(jù)的質(zhì)控結(jié)果統(tǒng)計Table 1 Quality control of raw data

2.3 Reads與參考基因組的比對結(jié)果

Reads與參考基因組比對結(jié)果(表2)顯示，對照組(LE-root)和試驗組(LE-rootm)的Reads與參考基因組的比對效率分別為86.39 %和85.76 %，Multiple mapped reads分別為0.85 %和0.70 %，均小于1.00 %，表明測序質(zhì)量及所選基因較好，可滿足后續(xù)分析需求。

表2 Reads與參考基因組比對結(jié)果統(tǒng)計Table 2 Comparison of Reads and reference genomes

2.4 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

將對照組(LE-root)與試驗組(LE-rootm)的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析，結(jié)果(圖1)顯示有1116個基因差異表達(dá)，其中731個基因上調(diào)表達(dá)，385個基因下調(diào)表達(dá)，上調(diào)表達(dá)基因數(shù)約為下調(diào)表達(dá)基因數(shù)的1.9倍，說明接種根結(jié)線蟲后番茄中有更多的基因通過上調(diào)表達(dá)響應(yīng)根結(jié)線蟲侵染。

2.5 差異表達(dá)基因的GO功能注釋分析結(jié)果

對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，其功能歸類于生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三大類1830個條目。從圖2可看出，在分子功能中，差異表達(dá)基因富集在16個GO條目，較顯著的分子功能GO條目包括結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子激活、分子功能調(diào)控和酶活性催化等；生物過程富集在13個GO條目，較顯著的生物過程GO條目包括刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)和代謝過程等；細(xì)胞組分中所有的差異表達(dá)基因均富集在胞外區(qū)條目。從圖3可看出，生物過程、分子功能和細(xì)胞組分分別富集在15、14和1個GO條目；在分子功能中，較顯著的GO條目包括轉(zhuǎn)運(yùn)活性、過氧化物酶活性和抗氧化活性等；在生物過程中，較顯著的分子功能GO條目包括刺激應(yīng)答、壓力應(yīng)答和代謝應(yīng)答等。

2.6 差異表達(dá)基因的KEGG分析結(jié)果

對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因富集于94條KEGG代謝通路中，富集上調(diào)表達(dá)基因最多的為植物與病原互作通路，其次為類胡蘿卜素生物合成和維生素B6代謝通路，富集下調(diào)表達(dá)基因最多的為苯丙氨酸代謝通路，其次為類苯基丙烷生物合成和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。由表3可知，富集差異基因最多的是代謝途徑，共富集79個差異表達(dá)基因，其次為次生代謝物的生物合成和植物與病原互作途徑，分別富集45和18個差異表達(dá)基因。由表4可知，富集差異基因最多的是苯丙氨酸代謝和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，均富集14個差異表達(dá)基因，其次為類苯基丙烷生物合成途徑，共富集11個差異表達(dá)基因。

表3 番茄根尖組織樣本間上調(diào)表達(dá)基因的KEGG分析結(jié)果Table 3 The KEGG annotations analysis of up-regulated genes in tomato root tip samples

表4 番茄根尖組織樣本間下調(diào)表達(dá)基因的KEGG分析結(jié)果Table 4 The KEGG annotations analysis of down-regulated genes in tomato root tip samples

2.7 差異表達(dá)的抗病相關(guān)基因

為研究番茄抗性材料對南方根結(jié)線蟲的抗性響應(yīng)，對接種24 h后差異表達(dá)的基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)22個植物與病原物互作相關(guān)基因差異表達(dá)。其中，18個抗病相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，包括12個Ca+-CaM/CML信號相關(guān)基因(11個類鈣調(diào)蛋白CML、1個鈣調(diào)蛋白CaM)、3個WRKY轉(zhuǎn)錄因子、1個環(huán)核酸門控離子通道(CNGCS)蛋白、1個熱激蛋白和1個RBOH蛋白；差異表達(dá)最明顯的是Solyc11g071760.1、Solyc11g071750.1和Solyc02g09 4000.1 3個鈣調(diào)蛋白CML，差異倍數(shù)分別為4.73，3.50和3.34(表5)；3個WRKY轉(zhuǎn)錄因子分別為WRKY22、WRKY26和WRKY33A，分別上調(diào)表達(dá)2.61、2.32和1.90倍；1個環(huán)核酸門控離子通道(CNGCS)蛋白為CNGC15b-lik，上調(diào)表達(dá)294倍。說明Ca+-CaM/CML信號、WRKY轉(zhuǎn)錄因子和環(huán)核甘酸門控離子通道是番茄抗性材料F5對南方根結(jié)線蟲抗性反應(yīng)的重要機(jī)制。

表5 上調(diào)表達(dá)的抗病相關(guān)基因Table 5 Up-regulation of disease-resistant genes

3 討 論

番茄抗根結(jié)線蟲基因的挖掘工作始于20世紀(jì)40年代，迄今已發(fā)現(xiàn)了10個抗性基因，其中Mi-1基因是目前唯一被應(yīng)用的抗病基因，但Mi-1基因具有熱不穩(wěn)定性，且自然界中存在部分或全部打破Mi-1基因抗性的線蟲群體。因此，從番茄材料中尋找新的抗病相關(guān)基因，將有利于加快抗病育種進(jìn)程，促進(jìn)抗病品種在生產(chǎn)上應(yīng)用。本研究采用高通量測序技術(shù)對南方根結(jié)線蟲侵染和未侵染番茄抗性材料F5樣本的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檢測，鑒定并挖掘與線蟲響應(yīng)相關(guān)的基因，共分離獲得1116個差異表達(dá)基因，其功能歸類于生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三大類1830個條目，顯著富集于94條KEGG代謝通路；對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，植物與病原互作相關(guān)的22個基因差異表達(dá)，其中18個抗性相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，上調(diào)表達(dá)明顯的抗性基因包括11個類鈣調(diào)蛋白、1個鈣調(diào)蛋白、3個WRKY轉(zhuǎn)錄因子和1個環(huán)核甘酸門控離子通道蛋白。

Tuteja和Mahajan[17]、White和Broadley[18]研究認(rèn)為，鈣調(diào)蛋白和類鈣調(diào)蛋白是Ca+-CaM/CML信號系統(tǒng)的重要組分，其與Ca2+結(jié)合后所形成的復(fù)合體能快速激活一系列蛋白，從而調(diào)控植物對不良環(huán)境和其他生物干擾的反應(yīng)。CAMTA(CaM-binding Transcription activator)是CaM調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活因子家族之一，Rahman等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CAMTA3參與調(diào)控油菜對菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)的免疫和抗性過程需要結(jié)合CaM。本研究中，接種南方根結(jié)線蟲后24 h，18個上調(diào)表達(dá)的抗病相關(guān)基因中有12個Ca+-CaM/CML信號通路相關(guān)基因，其中有1個鈣調(diào)蛋白和11個類鈣調(diào)蛋白，上調(diào)表達(dá)最高達(dá)4.73倍，表明番茄抗性材料F5在響應(yīng)南方根結(jié)線蟲侵染過程中，Ca+-CaM/CML信號通路可能參與調(diào)控番茄對線蟲的抗性反應(yīng)，與Rahman等[19]的研究結(jié)果一致，但這些CaM/CML在番茄響應(yīng)線蟲侵染反應(yīng)中的功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需進(jìn)一步探究。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物的抗病防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用，可通過與抗病相關(guān)蛋白基因啟動子區(qū)W-box相結(jié)合激活下游抗病基因表達(dá)，從而開啟植物的抗病防衛(wèi)系統(tǒng)[20-21]。大量研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病調(diào)控中的作用大多依賴于茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)[20-22]。Bhattarai等[23]利用基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，在Mi基因介導(dǎo)的番茄抗根結(jié)線蟲反應(yīng)中WRKY轉(zhuǎn)錄因子SlWRKY72a/SlWRKY72b上調(diào)表達(dá)，沉默SlWRKY72a/SlWRKY72b可降低番茄對根結(jié)線蟲的抗性。Chinnapandi等[24-25]研究發(fā)現(xiàn)，SlWRKY45可能通過激活依賴于SA的信號傳導(dǎo)路徑調(diào)控抗線蟲反應(yīng)，SlWRKY3通過激活脂質(zhì)和激素介導(dǎo)的防御信號通路，對爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)起正向調(diào)控作用。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，接種南方根結(jié)線蟲后24 h，有3個WRKY轉(zhuǎn)錄因子(WRKY22、WRKY26和WRKY33A)上調(diào)表達(dá)，上調(diào)倍數(shù)分別為2.61、2.32和1.90倍，說明這3個WRKY轉(zhuǎn)錄因子在番茄抗性材料F5響應(yīng)南方根結(jié)線蟲侵染過程中發(fā)揮了一定作用，但其抗線蟲調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

植物的環(huán)核甘酸門控離子通道能直接被激活，也可以通過與環(huán)核甘酸(cAPM/cGMP)可逆性結(jié)合被激活，參與調(diào)控植物細(xì)胞的離子運(yùn)轉(zhuǎn)、病原體防御應(yīng)答和生長發(fā)育等[26-27]。Balague等[28]研究顯示，擬南芥AtCNGC4可通過參與病程相關(guān)蛋白(PR)基因的組成表達(dá)，增強(qiáng)對強(qiáng)毒性病原體的廣譜抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，接種南方根結(jié)線蟲后24 h，1個環(huán)核甘酸門控離子通道蛋白基因上調(diào)表達(dá)，上調(diào)表達(dá)倍數(shù)為2.94倍，說明該基因可能參與調(diào)控番茄抗性材料F5對南方根結(jié)線蟲的防御應(yīng)答，但其是否與AtCNGC4一樣可通過與其他抗性相關(guān)基因間組成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)增強(qiáng)F5對線蟲的抗性還需進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

Ca+-CaM/CML信號、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、環(huán)核甘酸門控離子通道是番茄抗性材料F5對南方根結(jié)線蟲抗性反應(yīng)的重要機(jī)制，可作為深入探索根結(jié)線蟲與番茄互作及挖掘番茄關(guān)鍵抗性相關(guān)基因的參考依據(jù)。