小麥抗條銹基因 Yr10的抗病通路研究

高花雨，何 琪，賈勁松，丁 焱，王亞茹，王曉靜，康振生

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

小麥條銹病是由條形柄銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.triticii)引起的一種世界性氣傳真菌病害。該病害發(fā)生歷史久遠(yuǎn)，危害范圍廣，病原菌可隨氣流遠(yuǎn)距離傳播，且極易發(fā)生變異，也是我國小麥危害最為嚴(yán)重的一類病害。該病害多次在全國大流行，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失，直接影響我國糧食安全[1]。利用抗病品種是防治小麥條銹病最根本和有效的措施，但條銹菌毒性變異頻繁，已導(dǎo)致我國90%以上的小麥生產(chǎn)品種“喪失”抗銹性，對小麥生產(chǎn)和糧食安全構(gòu)成極大威脅[1]。因此，加強(qiáng)小麥抗銹機(jī)制研究，合理利用小麥抗銹性，對延緩病菌變異和持續(xù)控制條銹病具有重要的意義。

經(jīng)典的基因?qū)驅(qū)W說闡明了植物中的抗病基因(R)在病原菌中都有互作的無毒基因(Avr)[2]。在植物中，目前已經(jīng)克隆的植物抗病基因中，核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-亮氨酸富集重復(fù)蛋白(nucleotide-binding site,leucine-rich repeat receptors,NBS-LRR)抗病基因占大多數(shù)，是一類非常重要的抗病基因，這類抗病基因編碼的蛋白作為受體與病原菌Avr基因編碼的蛋白直接或間接互作會引發(fā)一系列反應(yīng)，包括活性氧的迸發(fā)、離子流、蛋白質(zhì)的磷酸化和水楊酸(SA)含量的變化等[3-4]，最終激活防御反應(yīng)信號途徑，產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)(hypersensitive response,HR)[5]。在NBS-LRR介導(dǎo)的信號通路中，植物激素SA作為信號分子誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白(PR)基因的表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生HR和整個植株廣譜持久的系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance，SAR)[5-7]?？共⊥分泻芏嗫共∠嚓P(guān)基因也直接參與R基因介導(dǎo)的抗病通路，如RAR1、SGT1和HSP90基因編碼的蛋白已經(jīng)被證明在NBS-LRR類R基因介導(dǎo)的SA抗病信號通路中起作用[8-9]。研究這些基因在小麥防御條銹菌過程中的表達(dá)和功能對闡明R基因介導(dǎo)的防御信號通路有重要意義[10]。

抗病基因的結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，其抗病通路也不同。目前已經(jīng)克隆的抗條銹病基因中，Yr5和Yr7是NBS-LRR類型的抗病基因，在N-端有一個保守的含鋅指結(jié)構(gòu)(zinc-finger)的BED結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子WKRY來激活防御反應(yīng)[11]。已有研究表明，WRKY70基因在SA信號通路中調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[12]。Yr15是一個廣譜且具有全生育期抗性的基因，其編碼一個含有串聯(lián)激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白WTK1(wheat tandem kinase 1)，該結(jié)構(gòu)域與植物抗病防御相關(guān)。Yr18(Lr34/Sr57/Pm38)編碼的蛋白是一個ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子(ATP-binding cassette，ABC)，目前證明其作用底物是脫落酸(ABA)，通過ABA影響病原菌的生長，達(dá)到抗病的目的[13]。Yr36基因編碼的蛋白是一個含START結(jié)構(gòu)域的激酶(Kinase-START)[14]，該激酶可以通過跨膜運(yùn)輸進(jìn)入到葉綠體，與類囊體抗壞血酸過氧化物酶結(jié)合使其磷酸化，干擾其分解過氧化氫，造成活性氧的積累，從而加速細(xì)胞死亡，有效地限制了條銹菌在小麥葉片組織內(nèi)增殖[15]。Tada等[3]的研究結(jié)果表明，在寄主植物防御病原真菌引起的過敏反應(yīng)中，伴隨有大量的活性氧產(chǎn)生，并且這些活性氧的產(chǎn)生可能和過敏反應(yīng)的起始以及發(fā)展有密切的關(guān)系。但目前對抗病基因的通路研究還非常局限，對抗病防御反應(yīng)的激活和抗病信號的傳導(dǎo)仍需深入的研究。

小麥抗條銹病基因Yr10定位于小麥1B染色體上，具有全生育期抗性的特點(diǎn)[16]。根據(jù)早期獲得的Yr10的分子標(biāo)記，Liu等[17]通過轉(zhuǎn)基因和病毒介導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)等技術(shù)，證明該基因抗條銹病，其編碼的蛋白屬于NBS-LRR類受體蛋白。

長期以來的研究和生產(chǎn)實(shí)踐證明，合理利用抗病基因，培育和推廣高效、穩(wěn)定、廣譜、持久抗病品種是防治小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)、安全和有效的方法，但單一抗病品種多年使用，容易導(dǎo)致品種抗性喪失。因此，研究抗病基因的抗病通路，可以為傳統(tǒng)育種提供新的思路和策略。本研究通過研究抗病基因Yr10介導(dǎo)的抗病通路中植株活性氧積累和侵染部位細(xì)胞壞死情況，分析內(nèi)源激素SA的積累量變化和抗病相關(guān)基因的表達(dá)，以期為解析Yr10的抗病通路奠定基礎(chǔ)，從而為將來合理利用抗病資源、培育持久高效抗病小麥材料提供理論 依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥材料為AvocetS (以下簡寫為AvS)及其近等基因系A(chǔ)vSYr10NIL (near-isogenic lines，以下簡寫為AvS+Yr10)，條銹菌生理小種為CYR31，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物免疫研究室提供。

1.2 供試材料中活性氧含量的測定

待AvS和AvS+Yr10小麥材料長至一葉一心時期，接種條銹菌CYR31，分別在接菌后0、12、24、48、72、96和120 h后剪取幼苗葉片，每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)。利用PBS緩沖液對樣品進(jìn)行研磨。按照植物活性氧酶聯(lián)免疫分析試劑盒方法(上海滬鼎生物科技有限公司進(jìn)口分裝)進(jìn)行H2O2含量的測定。

1.3 供試材料的細(xì)胞組織學(xué)觀察

分別在接種條銹菌48和72 h后剪取葉片，將葉片剪成1～2 cm 小段，置于乙醇∶冰醋酸=1∶1的固定液中脫色固定，定期更換固定液，待葉片綠色脫凈，用飽和水合氯醛溶液處理6 h后，保存于30%甘油中，Olympus BX-51 微分干涉顯微鏡觀察細(xì)胞的壞死狀況。

1.4 供試材料中內(nèi)源SA含量的測定

樣品的取樣方法同1.2，樣品稱取鮮重后用液氮速凍，用破碎儀破碎樣品。加浸提液(甲醇∶水∶冰醋酸=89∶10∶1)渦旋樣品后，12 000 r·min-1室溫離心，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中。重復(fù)操作2～3次。獲得的樣品加水稀釋至甲醇濃度為50%，超低溫冰箱冷凍后放置冷凍干燥儀中過夜。干燥后的樣品用色譜級甲醇溶解后，用 0.22 μm有機(jī)系過濾膜過濾至上樣瓶中。利用西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院實(shí)驗(yàn)平臺的質(zhì)譜儀器LC-30A+TripleTOF5600+(AB SCIEX,Singapore)測定SA的含量。

1.5 QRT-PCR 分析

AvS和AvS+Yr10小麥樣品的取樣方法同1.2，采用Biozol法提取各時間點(diǎn)采集的小麥樣品RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo,美國)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計基因定量分析引物(表1)。其中，以肌動蛋白actin基因作為內(nèi)參基因。以反轉(zhuǎn)錄的各時間點(diǎn)cDNA為模板，利用Bio-Rad Real-time PCR儀分別檢測TaRAR1、TaHSP90、TaSGT1和PR1基因的表達(dá)量。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包括cDNA 2 μL，SYBR Green mix 1μL,上下游引物各1 μL,ddH2O補(bǔ)齊到20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；然后95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。收集溶解曲線程序：60 ℃升至95 ℃時，PCR儀每隔1 ℃檢測一次信號。用2-ΔΔCt法[18]計算基因的相對表達(dá)量，每個處理 3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 供試小麥材料接種條銹菌后活性氧和SA積累量的變化

從表2可以看出，SA和活性氧的積累量都存在兩個高峰，但高峰出現(xiàn)的時間點(diǎn)不同。接種條銹菌后，AvS和AvS+Yr10小麥材料葉片中的H2O2含量均在接菌后24和96 h有迸發(fā)現(xiàn)象，在接菌72 h后H2O2含量最低，在96 h后又有所降低。AvS小麥材料的內(nèi)源SA含量在接菌后12和96 h出現(xiàn)峰值，在接菌48 h含量最低，72 h有所回升，到120 h又恢復(fù)至接菌前水平；AvS+Yr10小麥材料的內(nèi)源SA含量在接菌后12和 72 h出現(xiàn)峰值，在接菌后24 h內(nèi)源SA含量最低， 48 h又有所升高，到120 h又恢復(fù)到接菌前的水平。總體來看，AvS小麥材料的H2O2和內(nèi)源SA含量低于AvS+Yr10小麥材料。

表2 接種條銹菌后AvS和AvS+ Yr10葉片中H2O2和內(nèi)源SA含量的變化Table 2 H2O2 accumulation and endogenous SA concentration in AvS and AvS+ Yr10 leaves after inoculation with stripe rust

2.2 供試小麥材料接種條銹菌后細(xì)胞壞死狀況

接菌后48和72 h，通過組織學(xué)觀察AvS和AvS+Yr10小麥材料中條銹菌在侵染位點(diǎn)葉肉細(xì)胞的壞死產(chǎn)生情況，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，在接菌后48和72 h，在微分干涉顯微鏡明場下均可觀察到形成氣孔下囊(SV)的侵染點(diǎn)(圖1a、圖1c、圖1e和圖1g)。活性氧的產(chǎn)生通常會引起侵染位點(diǎn)附近的葉肉細(xì)胞壞死，在接菌后48和72 h，在熒光顯微鏡下均可觀察到AvS+Yr10小麥材料葉肉細(xì)胞產(chǎn)生黃色的自發(fā)熒光(圖1d和1h)，說明該細(xì)胞發(fā)生了HR反應(yīng)，并且72 h的自發(fā)熒光面積比48 h的自發(fā)熒光面積大，表明壞死面積隨侵染時間的推移而增大(圖1d和1h)。而接菌后48和72 h，AvS小麥材料中沒有自發(fā)熒光產(chǎn)生(圖1b和1f)。

2.3 供試小麥材料接種條銹菌后 PR1基因的表達(dá)分析

從圖2可以看出，PR1基因的表達(dá)量在AvS和AvS+Yr10小麥材料中趨勢一致，均呈先升高后降低的趨勢。但在接菌后不同時間點(diǎn)，PR1基因的表達(dá)量在含有Yr10抗病基因的小麥體內(nèi)積累較多，在病原菌侵染48和72 h時，PR1基因的表達(dá)量在AvS和AvS+Yr10小麥材料間的差異達(dá)到了極顯著水平，說明PR1基因在Yr10的抗病信號通路中發(fā)揮著重要作用。

2.4 抗病相關(guān)基因的表達(dá)和功能分析

利用實(shí)時定量分析抗病相關(guān)基因RAR1、SGT1和HSP90在AvS和AvS+Yr10小麥材料中接種條銹菌后的表達(dá)水平，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，接菌后不同時間三個基因的表達(dá)趨勢基本一致。在0～24 h均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，并且SGT1和HSP90基因均在AvS+Yr10材料中顯著上調(diào)表達(dá)。在接菌后48 h，AvS+Yr10材料中三個基因的表達(dá)量均顯著高于AvS材料。說明在Yr10介導(dǎo)的抗病通路中三個基因都參與了小麥對條銹菌的防御反應(yīng)。

表3 TaRAR1、 TaSGT1和 TaHSP90在小麥材料AvS和AvS+ Yr10接菌后的相對表達(dá)量Table 3 Relative expression of TaRAR1, TaSGT1 and TaHSP90 in wheat material AvS and AvS+ Yr10after inoclulation of stripe rust

為了進(jìn)一步驗(yàn)證三個基因在Yr10介導(dǎo)的抗病通路中的功能，對三個基因分別進(jìn)行病毒誘導(dǎo)的基因沉默實(shí)驗(yàn)。摩擦接毒后12 d，接種BSMV:PDS病毒植株的第4葉出現(xiàn)明顯光漂白現(xiàn)象，表明病毒RNA介導(dǎo)的基因沉默已經(jīng)發(fā)生(圖3A)；沉默后的植株接種條銹菌CYR31，在接種后15 d進(jìn)行表型觀察，發(fā)現(xiàn)在不含Yr10抗病基因的AvS材料中，不做接毒處理的對照組Mock和只接病毒的對照組BSMV:00與實(shí)驗(yàn)組BSMV:HSP90和BSMV:RAR1的葉片均產(chǎn)孢，并且產(chǎn)孢數(shù)量無明顯差異(圖3B)。而在含有Yr10抗病基因的小麥材料AvS+Yr10中，BSMV:HSP90和BSMV:RAR1實(shí)驗(yàn)組與對照組BSMV:00相比，過敏性壞死反應(yīng)程度降低(圖3A)。結(jié)果表明，TaRAR1和TaHSP90在Yr10抗病基因引起的過敏性壞死反應(yīng)中起作用。TaSGT1由于沉默后嚴(yán)重影響植物的發(fā)育，未展示結(jié)果。

為確定TaRAR1和TaHSP90基因的沉默效率，通過實(shí)時定量檢測沉默后葉片中這2個基因的表達(dá)量。在接種BSMV:PDS病毒植株出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象時，分別對接種BSMV:HSP90和BSMV:RAR1的沉默植株進(jìn)行取樣，并測定TaHSP90和TaRAR1基因的表達(dá)量。與接種空病毒BSMV:00對照組相比，親和組合AvS/CYR31中TaHSP90和TaRAR1基因的沉默效率分別為67%和83%，非親和組合AvS+Yr10/CYR31中TaHSP90和TaRAR1基因的沉默效率分別為66%和91%，表明兩個基因都被顯著抑制(表4)。

表4 TaHSP90和 TaRAR1基因沉默的小麥材料中的相對表達(dá)量Table 4 Relative expression of TaHSP90 and TaRAR1 in gene silenced wheat

3 討 論

活性氧在植物的防御反應(yīng)中扮演一個重要的角色[19-20]。寄主抗病基因R識別病原菌Avr基因編碼的蛋白后會快速迸發(fā)活性氧，然后誘導(dǎo)侵染部位發(fā)生HR反應(yīng)及抗病相關(guān)基因的表達(dá)[5]。本研究對小麥材料AvS和含有Yr10抗病基因的近等基因系A(chǔ)vS+Yr10接種條銹菌小種CYR31分別組成親和與非親和體系。通過酶聯(lián)免疫法和組織學(xué)檢測法研究非親和體系中活性氧積累和細(xì)胞的壞死情況。在非親和體系中，活性氧在接菌后24和96 h出現(xiàn)迸發(fā)現(xiàn)象。伴隨活性氧的產(chǎn)生，侵染位點(diǎn)的組織細(xì)胞壞死。說明在Yr10介導(dǎo)的植物防御反應(yīng)中活性氧的產(chǎn)生作為早期事件，細(xì)胞內(nèi)活性氧的升高抑制了條銹菌的菌絲發(fā)育和菌落形成，并在侵染點(diǎn)的寄主細(xì)胞發(fā)生典型的過敏性細(xì)胞壞死，完成植物防御反應(yīng)。這些變化與條銹菌和其他抗病品種的非親和組合所表現(xiàn)出的特征基本一致[19,21]。

R基因介導(dǎo)的抗性觸發(fā)了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而導(dǎo)致局部細(xì)胞程序性死亡(PCD)和SAR，PCD即HR反應(yīng)[22-23]。HR發(fā)生在感染部位可以限制活體寄生菌在內(nèi)的病原菌在寄主體內(nèi)的擴(kuò)展。通過SA介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑，SAR經(jīng)常與PR基因一起被誘導(dǎo)產(chǎn)生整株或廣譜植物抗性[24-25]。在NBS-LRR介導(dǎo)的信號通路中，SA在植物防御反應(yīng)過程中具有重要作用[4]。本研究結(jié)果表明，含抗條銹病基因Yr10的小麥材料AvS+Yr10中內(nèi)源SA含量在接菌后12和72 h出現(xiàn)高峰，兩個高峰出現(xiàn)的時間較活性氧迸發(fā)的時間較早。而在SA含量產(chǎn)生高峰前，H2O2含量雖未到達(dá)頂峰，但出現(xiàn)了快速的積累，其誘導(dǎo)了SA的快速積累并達(dá)至高峰。反之，SA的積累又加速了H2O2的積累，使得活性氧含量的第一個高峰出現(xiàn)。說明在非親和體系中，SA信號作為一個更早的信號，與活性氧迸發(fā)之間存在一定的相關(guān)性，這種相關(guān)性形成一種微循環(huán)，互相促進(jìn)植物防御反應(yīng)的發(fā)生，最終使植物產(chǎn)生獲得性免疫反應(yīng)。PR基因的表達(dá)量也隨SA的積累和活性氧的產(chǎn)生逐漸升高，在接菌后48和72 h親和與非親和組合出現(xiàn)顯著差異。Wang等[9]研究表明，在水源11組成的非親和體系中，內(nèi)源SA和H2O2含量增加，小麥的抗性增強(qiáng)，這與本研究中Yr10抗病通路中的SA和活性氧含量的變化一致。在小麥抗病基因Yr10與Avr基因識別后，活性氧含量的升高引起SA信號的級聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘發(fā)活性氧的迸發(fā)，進(jìn)而引起下游PR蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致HR反應(yīng)和HR的發(fā)生。

在抗病通路中，HR反應(yīng)是植物抗病基因和病原菌Avr基因編碼的蛋白相互作用的結(jié)果，在這個過程中抗病蛋白復(fù)合體的激活往往由其他抗病相關(guān)基因調(diào)控，在抗病中具有重要作用[8,23]。如RARl編碼的蛋白首次是從大麥抗白粉病基因Mla12介導(dǎo)的抗病信號途徑中分離的一個重要信號元件。RAR1通常與SGT1和HSP90相互作用形成蛋白復(fù)合體，促進(jìn)抗病基因復(fù)合物的形成和激活，對完成下游PR1基因的表達(dá)起到重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與AvS材料相比，AvS+Yr10材料中RAR1、HSP90和SGT1基因的表達(dá)量均在接菌后24 h顯著升高，并且基因沉默后能引起HR反應(yīng)的降低。因此，在抗病通路中，SA激素、活性氧和抗病相關(guān)蛋白形成的復(fù)合體共同調(diào)節(jié)由抗病基因引起的寄主細(xì)胞壞死?；诒狙芯康某醪窖芯拷Y(jié)果，筆者提出Yr10介導(dǎo)的抗病通路模式為：在早期抗病基因R和病原菌的無毒基因Avr識別，抗病相關(guān)蛋白RAR1、HSP90和SGT1形成蛋白復(fù)合體通過某種方式維持抗病蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)處于激活狀態(tài)，隨后SA信號分子的積累促進(jìn)活性氧的迸發(fā)和HR反應(yīng)，但其具體調(diào)節(jié)的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。