黃淮麥區(qū)部分小麥品種粒重基因 TaGS5-A1的等位變異分布及其效應(yīng)分析

李靜雯，董亞超，肖永貴，李法計，楊舒蓉，李 鳴，夏先春，何中虎,3

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，甘肅蘭州 730070； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所國家小麥改良中心，北京 100081; 3.CIMMYT中國辦事處,北京 100081)

小麥是我國第三大糧食作物，其產(chǎn)量的穩(wěn)步提升對于保障國內(nèi)糧食安全具有重大意義[1]。單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重構(gòu)成小麥產(chǎn)量三要素[2]。研究表明，千粒重的提高對小麥產(chǎn)量潛力提升貢獻較大[3-5]。籽粒大小和籽粒灌漿程度直接決定小麥粒重[6]，粒重與籽粒大小、形狀(粒長、粒寬、籽粒長寬比和粒厚)正相關(guān)[7]，且受多個微效基因控制。因此，深入了解粒重基因及其分子標記對于提升小麥產(chǎn)量潛力具有重要意義[8]。

近年來小麥粒重相關(guān)基因研究取得了一定進展，已克隆出多個粒重相關(guān)基因，包括TaGW2-6A、TaGW2-6B[9-11]、TaGS-D1[12]、TaGS5-A1[13]、TaTGW6[14-15]、TaGW8-B1[16]、TaGL3-5A[17]、TaSDIR1-4A[18]、TaSus2-2B[19]、TaSus2-2A、TaSus1-7A[20]、TaCwi-A1[21]、TaCWI-D1[22]、TaCKX6-D1[23]、TaCYP78A3[24]、TaTPP-6AL1[25]、TaSAP1-A1[26]、Tabas1-B1[27]、Ta-6-SFT[28]、TaGS1[29]、TaBT1[30]、TaSST[31]、TaSnRK2.10[32-33]、TaSnRK2.9-5A[34]等。上述粒重相關(guān)基因的克隆、功能標記的開發(fā)及其與農(nóng)藝性狀關(guān)系的研究，為了解粒重的分子遺傳機理及利用功能標記加快小麥高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)育種進程提供了重要信息。

早期研究顯示，水稻OsGS5編碼的絲氨酸羧肽酶類蛋白(serine carboxypeptidase-like proteins，SCPLs)可影響籽粒灌漿，在調(diào)控水稻籽粒大小和粒重方面發(fā)揮著重要作用[35]。Xu等[36]研究發(fā)現(xiàn)，SCPLs已在多種植物中得到鑒定，表明其廣泛參與植物體生長發(fā)育調(diào)控過程。Wang等[13]利用水稻OsGS5基因的生物學信息，克隆了普通小麥3A染色體上TaGS5-A1基因的全長編碼序列，并針對其等位變異TaGS5-A1a和TaGS5-A1b開發(fā)了共顯性酶切擴增多態(tài)性序列(cleaved amplified polymorphic sequences，CAPS) 功能標記，發(fā)現(xiàn)小麥TaGS5-A1基因?qū)τ谧蚜４笮【哂姓蛘{(diào)控作用，攜帶其優(yōu)異等位基因TaGS5-A1b的小麥品種具有較寬的粒寬和更高的千粒重，在小麥高產(chǎn)育種中有較大的應(yīng)用潛力。簡大為等[37]和Li等[38]先后將TaGS5-A1基因CAPS功能標記用于檢測新疆及黃淮麥區(qū)小麥，發(fā)現(xiàn)TaGS5-A1b基因型材料在新疆改良品種和黃淮麥區(qū)分布頻率均高于50%，后者還驗證了TaGS5-A1b基因與高粒重相關(guān)。

KASP技術(shù)作為一種高通量的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)或插入、缺失(insertion/deletion，InDel)基因分型平臺，已廣泛用于作物育種。近年來，小麥基因特異性KASP標記已被大量開發(fā)[39]，并在實踐中得到有效應(yīng)用[40]。利用KASP 標記檢測了109個長江上游小麥品種粒重等6個性狀20個位點的基因型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)材料為TaGS5-A1b基因型[41]。但是關(guān)于小麥主要粒重基因TaGS5-A1的 KASP標記在育種中的應(yīng)用價值報道較少。

本研究以本課題組基于粒重基因TaGS5-A1開發(fā)的高通量KASP標記檢測黃淮麥區(qū)119個小麥品種，了解其等位變異分布頻率，并比較攜帶不同等位變異品種的粒重構(gòu)成要素，探討等位變異TaGS5-A1b和TaGS5-A1a的育種價值，以期為利用粒重分子標記進行基因聚合和培育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)小麥品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究采用119個小麥品種作為試驗材料，其中，黃淮麥區(qū)(安徽、河北、河南、江蘇、山東、山西和陜西7個省份)推廣品種101個，適宜黃淮麥區(qū)生長的國外品種18個，該群體源于黃淮麥區(qū)具有代表性的166個小麥品種[42-44]。品種基本信息見表1。試驗材料于2012-2013和2013-2014年度種植于中國農(nóng)業(yè)科學院安陽棉花所白壁試驗站(36°3′ N，114°29′ E，海拔65 m)和安徽省農(nóng)業(yè)科學院濉溪試驗站(33°53′ N，116°46′ E,海拔 30 m)，2014-2015年度種植于中國農(nóng)業(yè)科學院安陽棉花所白壁試驗站和河北省石家莊市高邑縣原種場(37°37′ N，114°36′ E,海拔45 m)。田間種植采用隨機區(qū)組設(shè)計，3行區(qū)，行長2 m，3次重復(fù)。田間管理措施同當?shù)卮筇铩?/p>

表1 119個小麥品種的基本信息和基因型Table 1 Basic information and genotypes of 119 wheat varieties

(續(xù)表1 Continued table 1)

1.2 性狀調(diào)查

調(diào)查性狀包括千粒重、粒長、粒寬、穗長、株高和穗下節(jié)長。于小麥成熟期，每個小區(qū)隨機選取20個穗子、10個單株分別測定穗長、株高和穗下節(jié)長，以小麥根莖結(jié)合處與頂部小穗之間的距離代表植株高度，以穗下部往下到第一個結(jié)節(jié)處的長度作為穗下節(jié)長。于小麥成熟后，單株收獲脫粒，用萬深SC-G型自動考種分析儀測定千粒重、粒長和粒寬。119個小麥品種的表型數(shù)據(jù)由Li等[44]調(diào)查提供。

1.3 小麥葉片DNA提取

每個品種挑選8粒種子，發(fā)苗7～10 d后，剪取一定量的葉片，采用高鹽、低pH法提取DNA[45]。

1.4 基因型分型

采用粒重基因TaGS5-A1特異性KASP標記進行基因型分型，該基因標記由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所何中虎課題開發(fā)，具體引物序列見表2。根據(jù)KASP標記標準方法對119個小麥品種TaGS5-A1基因的目標SNP位點進行KASP分析。

PCR反應(yīng)在SNPline水浴PCR熱循環(huán)儀Hyfrocycler2(LGC，英國)384孔PCR板進行，每個PCR反應(yīng)體系為5.0 μL，包含2.0 μL 50 ng·μL-1的DNA，2.5 μL 2×KASP Master Mix，0.056 μL引物混合液，用ddH2O補充至5 μL。兩個上游引物和共用下游引物的濃度分別為12 μmol·L-1和30 μmol·L-1。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃變性15 min；94 ℃變性20 s，65～55 ℃退火/延伸1 min，10個循環(huán)(從第二個循環(huán)開始每個循環(huán)降1 ℃)；94 ℃變性20 s，57 ℃退火/延伸1 min，32個循環(huán)。用Synergy H1型多功能酶標儀(BioTek，美國)讀取熒光值，用KlusterCaller軟件(KBioscience)分型。若熒光信號弱、分群較分散，則影響數(shù)據(jù)分析，可以加3個循環(huán)(94 ℃變性20 s,57 ℃退火/延伸1 min)，直至結(jié)果滿意為止。

表2 TaGS5-A1位點、染色體、等位基因及引物序列Table 2 TaGS5-A1 locus,chromosome,alleles and primer sequences for detecting allelic variations

1.5 統(tǒng)計分析

用Excel 2010對每種基因型對應(yīng)小麥品種的千粒重、粒長、粒寬、株高、穗長、穗下節(jié)長平均值分別進行統(tǒng)計分析。用SPSS 20.0對上述性狀3年2點數(shù)據(jù)[44]進行方差分析。KASP結(jié)果判讀中排除DNA 樣本檢測顯示為缺失的數(shù)據(jù)，不予分析。采用t測驗進行TaGS5-A1位點不同等位變異的顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒等主要農(nóng)藝性狀的表型分析結(jié)果

從表3可以看出，基因型、環(huán)境及基因型與環(huán)境互作對所有檢測性狀均有極顯著影響(P< 0.01)，說明基因型、環(huán)境及基因型與環(huán)境互作均影響籽粒相關(guān)農(nóng)藝性狀。

表3 籽粒及穗部部分性狀的方差分析Table 3 Analysis of variance for grain and spike related traits

2.2 119個小麥品種 TaGS5-A1基因等位變異的分布頻率

從圖1可以看出，含有TaGS5-A1b等位基因的品種有91個，分布頻率為76.5%；含有TaGS5-A1a等位基因的品種有28個，分布頻率為23.5%，等位基因TaGS5-A1b的分布頻率明顯高于TaGS5-A1a。

2.3 TaGS5-A1基因等位變異的效應(yīng)分析

從表4可以看出，含有TaGS5-A1b等位基因品種與含有TaGS5-A1a等位基因品種間的千粒重和粒寬差異均達到極顯著水平，前者較后者增幅分別為6.6%和3.0%，說明TaGS5-A1b等位變異可增加小麥籽粒的粒重和粒寬。此外，含有TaGS5-A1b等位基因品種較含TaGS5-A1a基因的株高顯著降低，降幅為6.6%，但其粒長(7.0 mm)、穗長(9.3 cm)、粒長/粒寬(2.0)和穗下節(jié)長(26.8 cm)均與含有TaGS5-A1a等位基因的品種間無顯著差異，說明TaGS5-A1主要是通過增加粒寬來提高千粒重。

2.4 黃淮麥區(qū)不同省份小麥品種 TaGS5-A1基因等位變異的分布頻率

對黃淮麥區(qū)河北(9個)、河南(42個)、山東(22個)、安徽(9個)、陜西(15個)小麥品種TaGS5-A1基因等位變異的分布頻率進行分析，結(jié)果(表5)表明，TaGS5-A1b在安徽、河南、山東小麥品種的分布頻率分別為100%、88.1%、 81.8%，在河北和陜西小麥品種的分布頻率均為 66.7%。河北、安徽、陜西三省的小麥品種數(shù)目有限，統(tǒng)計結(jié)果僅供參考。但總的來看，TaGS5-A1b等位變異在黃淮麥區(qū)5省的分布頻率明顯高于TaGS5-A1a。

表4 TaGS5-A1基因等位變異品種間粒型等農(nóng)藝性狀的比較Table 4 Comparison of grain shape and agronomic traits between TaGS5-A1a and TaGS5-A1b allele varieties

表5 黃淮麥區(qū)不同省份小麥品種 TaGS5-A1基因等位變異的分布頻率Table 5 Allelic frequencies at TaGS5-A1 locus in wheat varieties from different provinces in Huanghuai wheat area

3 討 論

3.1 TaGS5-A1基因KASP標記的驗證

近十年來，模式植物水稻和擬南芥中與籽粒大小相關(guān)的遺傳研究蓬勃發(fā)展。通過正向遺傳學手段如數(shù)量性狀位點的圖位克隆和T-DNA插入突變體庫已克隆出40多個控制籽粒大小的基因[46]。這些基因主要與三個遺傳途徑有關(guān)，包括蛋白酶體的降解，G蛋白信號和植物激素[47-49]?？刂屏Ｐ蔚幕虼蠖嗾{(diào)控籽粒的細胞分裂，而控制籽粒灌漿的基因則主要影響源庫關(guān)系。在細胞水平，GS5基因主要通過促進細胞分裂來增加細胞數(shù)目，進而調(diào)控籽粒大小和粒重[35]。

功能標記作為育種應(yīng)用的理想標記，經(jīng)驗證優(yōu)化后可用于所有育種材料的檢測和分子標記輔助選擇[50]。本研究利用粒重基因TaGS5-A1的KASP標記對黃淮麥區(qū)119個小麥品種該位點等位變異分布及效應(yīng)進行分析，發(fā)現(xiàn)TaGS5-A1b等位基因的分布頻率達76.5%，在6個環(huán)境中攜帶該等位基因的小麥品種具較寬的粒寬和更高的千粒重(P<0.01)，這與采用該基因CAPS標記的分析結(jié)果一致[37-38]，驗證了TaGS5-A1基因的KASP標記的有效性和實用性，可用于小麥粒重的輔助選擇。

Wang等[13]將TaGS5-A1基因定位到3AS染色體上，其側(cè)翼標記為Barc356 和 Barc324，其中攜帶TaGS5-A1a等位基因材料的株高、穗長、穗下節(jié)顯著高于含有TaGS5-A1b基因型的材料(P<0.05)。本研究攜帶TaGS5-A1b的材料株高顯著低于含有TaGS5-A1a的材料，這與前人研究結(jié)果一致，但兩個等位基因材料間的穗長、穗下節(jié)長無顯著差異。已有研究表明，3A 染色體上與小麥千粒重相關(guān)的QTL與SSR分子標記 Barc356 緊密連鎖[51]，該染色體上與株高有關(guān)的 QTL位于分子標記 Barc324和 Xwmc428之間[52]。類似地，定位于2BL染色體上控制產(chǎn)量和株高的QTLs區(qū)域含有粒重基因TaSus2-2B，且攜帶該基因優(yōu)勢等位變異Hap-H的小麥品種在2個環(huán)境下株高均顯著降低[11]。由于控制小麥粒重的主效QTL或基因經(jīng)常與其他性狀緊密連鎖，存在一因多效的現(xiàn)象，那么本研究中粒重基因TaGS5-A1是否與株高QTL緊密連鎖，還有待于進一步驗證。

粒重性狀容易受氣候、土壤、生產(chǎn)條件和栽培措施等因素的影響，造成不同地區(qū)不同年份籽粒質(zhì)地、重量差異較大。本研究通過多年多點試驗，獲得連續(xù)3個生長周期共6個環(huán)境的表型數(shù)據(jù)，更準確地評價了粒重基因TaGS5-A1的效應(yīng)及其KASP標記輔助選擇的應(yīng)用價值。

3.2 TaGS5-A1b等位基因的分布頻率

本研究發(fā)現(xiàn)黃淮麥區(qū)小麥各主產(chǎn)省份TaGS5-A1b等位基因的分布頻率不同，但總體趨勢一致，表明該粒重基因優(yōu)異等位變異在黃淮麥區(qū)不同省份均被不同程度地正向選擇，但是TaGS5-A1b等位基因的粒重改進潛力在不同省份有所差異。陜西省攜帶TaGS5-A1b等位基因小麥品種的粒重(41.9 g)高于TaGS5-A1a等位基因(39.2 g)的品種，可能是品種數(shù)偏少所致；其粒寬(3.4 mm)顯著高于TaGS5-A1a基因型材料(3.3 mm)，表明陜西省品種粒重改進潛力大。山東省選育的攜帶優(yōu)勢等位變異TaGS5-A1b小麥品種的千粒重(45.5 g)、粒寬(3.5 mm)均顯著高于TaGS5-A1a基因型(41.2 g，3.4 mm)，進一步驗證了TaGS5-A1b基因型與千粒重顯著正相關(guān)，而且與宋健民等[53]發(fā)現(xiàn)山東省1999-2010年育成的小麥品種產(chǎn)量構(gòu)成要素中粒重呈顯著上升結(jié)果相印證。

3.3 TaGS5-A1b基因功能標記在育種中的應(yīng)用

粒重作為多基因控制的數(shù)量性狀，以表型為主的選擇可能造成優(yōu)異基因的丟失，而以分子標記跟蹤能確保優(yōu)異基因的保留。所以常規(guī)育種與分子標記輔助選擇相結(jié)合可提高對粒重選擇的準確性和育種效率[54]。目前國內(nèi)學者利用粒重基因特異性分子標記快速準確鑒定出不同小麥品種中粒重形成相關(guān)基因及其變異類型的分布，為小麥高產(chǎn)育種過程中親本選配和后代輔助選擇提供依據(jù)[8]。本研究主要基于TaGS5-A1基因?qū)αＶ氐脑鲂нM行了驗證，明確攜帶優(yōu)異等位變異TaGS5-A1b小麥品種的粒重較高。粒重較高的品種如中麥875(52.8 g)、豫麥34(50.8 g)、魯麥23(50.7 g)和中麥895(49.8 g)均攜帶與其高粒重表型一致的優(yōu)異等位變異TaGS5-A1b。研究發(fā)現(xiàn)，中麥895還具有4個位點的優(yōu)異等位變異，即Hap-A、Hap1/2/3、Tabas1-B1a和TaCwi-A1a；豫麥34還具有3個位點的優(yōu)異等位變異Hap-A、Hap1/2/3和TaCwi-A1a；中麥875還具有2個位點的優(yōu)異等位變異Hap-A和Hap1/2/3；魯麥23僅有1個位點的優(yōu)異等位變異，為Hap-A。以上小麥品種應(yīng)該還存在其他粒重基因的優(yōu)異等位變異，需要進一步明確這些高粒重品種中影響粒重的變異位點，評價相關(guān)位點的高通量KASP標記。因此，今后在利用本研究篩選的粒重基因TaGS5-A1高通量KASP標記時，應(yīng)在綜合考慮基因、環(huán)境以及植株本身優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上，結(jié)合其他多個粒重和品質(zhì)基因標記進行基因聚合，可加速培育出具有突破性的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥新品種。