新疆地方綿羊品種Cytb基因 遺傳多樣性與系統(tǒng)進化分析

呂雪峰，許艷麗，鄭文新，胡 昕，賽迪古麗·賽買提，王 樂*

(1.新疆大學生命科學與技術(shù)學院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆畜牧科學院畜牧業(yè)質(zhì)量標準研究所，新疆 烏魯木齊 830046)

【研究意義】新疆地處中國西北部，總面積占中國陸地面積六分之一，屬于溫帶大陸性氣候，降水量少，氣候干燥。天山作為天然屏障將新疆分為南疆和北疆，南疆屬暖溫帶，北疆屬中溫帶，年平均氣溫10～13 ℃，其中阿勒泰地區(qū)冬季氣溫最低達-50 ℃，吐魯番地區(qū)夏季氣溫最高達49 ℃，多樣的自然環(huán)境造就了物種的豐富性。根據(jù)《中國畜禽遺傳資源志羊志》[1]，新疆共有13個地方綿羊品種，這些品種分布在天山南北，各大河流附近，在長期的選育下，逐漸形成了適應(yīng)當?shù)貧夂虻钠贩N，有著獨特的優(yōu)良性能。如阿勒泰羊、哈薩克羊、巴什拜羊是新疆主要的肉用羊品種，具有體格大、產(chǎn)肉多的特點；多浪羊具有良好的多胎性能；策勒黑羊是我國優(yōu)良的裘皮用羊；塔什庫爾干羊是高海拔環(huán)境下良好的肉用品種；和田羊是以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)地毯毛而著稱的半粗毛羊等?！厩叭搜芯窟M展】地方品種是在特定的地區(qū)、特定的地理環(huán)境中培育出來的，是我國寶貴的遺傳資源。遺傳多樣性反映了物種所包含基因的豐富程度和它對環(huán)境的適應(yīng)能力。已經(jīng)有學者通過微衛(wèi)星對新疆部分綿羊品種的遺傳多樣性進行了分析[2-5]。由于線粒體 DNA(mtDNA)具有嚴格的母系遺傳、分子量小、突變率高、無組織特異性等優(yōu)點，目前已成為研究物種進化的重要的分子標記，通過分析線粒體DNA的多態(tài)性可以探討種群的遺傳結(jié)構(gòu)、起源、地理分布、種群分歧、系統(tǒng)發(fā)育等[6-9]。寧禮群等[10]利用Cytb序列分析新疆10個綿羊品種，發(fā)現(xiàn)新疆地方綿羊品種的遺傳多樣性豐富，至少有3個獨立的母系起源。王世峰等通過mtDNA D-loop[11]和ND2[12]基因序列分析了新疆部分綿羊品種的親緣關(guān)系和起源,發(fā)現(xiàn)塔什庫爾干羊、巴什拜羊、哈薩克羊與東方盤羊關(guān)系較近，摩弗倫羊是家綿羊的野生祖先?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，由于消費市場的需求，新疆引進肉羊品種與本地綿羊品種雜交，同時，因為交通便利，各地方品種交流也非常頻繁，導致這些地方品種資源的純度急劇下降，數(shù)量減少。為全面系統(tǒng)地揭示新疆地方綿羊品種資源遺傳現(xiàn)狀，本研究對新疆13個地方綿羊品種遺傳多樣性、親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育進行了分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為綿羊品種的分類提供合理依據(jù)，對品種資源開發(fā)、利用和保護提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以新疆13個地方綿羊品種作為主要研究對象，分布地區(qū)見圖1，以內(nèi)蒙古烏珠穆沁羊和西藏綿羊做對照，共15個綿羊品種211個個體(表1)。頸靜脈采血，抗凝，置于-20 ℃冰箱保存。從NCBI上下載已發(fā)表綿羊線粒體胞色素b(cytochrome b,Cytb)基因序列：KF677303.1、KU899149、KU899141；東方盤羊(Ovisvignei)EU366052、東方盤羊烏茲別克斯坦亞種(Ovisammonsevertzovi)EU366057、亞洲摩佛倫羊(Ovisorientalis)KF677307.1、和歐洲摩佛倫羊(Ovisariesmusimon)FR873152作為參照。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用上海生工生物工程股份有限公司的EZUP柱式動物基因組DNA試劑盒提取。

1.2.2 引物設(shè)計與PCR擴增參考 NCBI 綿羊Cytb基因(Gen Bank登錄號:EU176819)序列，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計能擴增Cytb基因部分序列的引物(由上海生工股份有限公司合成)。上游引物：5′-ATATACACGCAAACGGGGCA-3′，下游引物：5′-AGGGGGAGTGTTAAGTGGGT-3′，PCR反應(yīng)體系25 μl:TaqPCR MasterMix試劑12.5 μl，雙蒸水H2O29.5 μl，DNA 樣品1 μl，上、下游引物各1 μl。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工股份有限公司測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析測序結(jié)果 根據(jù)峰圖進行人工校對，利用 Clustal-X 軟件對序列進行比對、剪切和拼接，得到Cytb基因部分序列。利用DnaSP v5.10.0.1軟件計算各堿基組成比例、單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(k)、種群間核苷酸平均差異數(shù)(Kxy)、遺傳分化指數(shù)(Fst)、核苷酸歧義度(Dxy)、遺傳分化系數(shù)(Gst)和基因交流值(Nm)，并進行Tajima’s D 中性檢驗；利用Network 4.6.1.3軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖；利用Arlequin V3.5.1.3 軟件進行分子變異分析和錯配分析。運用MEGA7.0軟件計算堿基轉(zhuǎn)換與顛換平均比率，構(gòu)建單倍型的系統(tǒng)進化樹(neighbor-joining， NJ法，Bootstrap抽樣重復次數(shù)為1000次)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

以基因組DNA為模板對Cytb基因進行擴增，經(jīng)電泳檢測，得到與預期目標片段大小一致、整齊而清晰的條帶，送上海生工股份有限公司測序。

2.2 Cytb序列多態(tài)位點

測序結(jié)果經(jīng)ChromasPro拼接后，獲得Cytb序列，長度為1017 bp，共檢出24個變異位點，其中單堿基變異位點6個，簡約信息位點18個(圖2)，堿基含量平均值A(chǔ) 30.1 %、T 27.3 %、C 29.1 %、G 13.5 %，沒有發(fā)現(xiàn)堿基缺失或插入現(xiàn)象。其中A+T含量(57.4 %)明顯高于C+G含量(42.6 %)。本研究顯示轉(zhuǎn)換率明顯高于顛換率，總的轉(zhuǎn)換顛換偏倚率R值為25.06，T 和 C 之間的轉(zhuǎn)換率最高，為62.5 %。

2.3 遺傳多樣性

15個地方綿羊品種單倍型多樣度(Hd)在0.396～0.782，群體總Hd為0.684，其中，和田羊的單倍型多樣度最低，為0.396，羅布羊的單倍型多樣度最高，為0.782，各地方綿羊品種核苷酸多樣度Pi在0.00056～0.00593，總?cè)后w核苷酸多樣度為0.00407，其中，和田羊最低，為0.00056，巴爾楚克羊最高，為0.00593，各地方品種綿羊核苷酸平均差異數(shù)k在0.571～6.029，總?cè)后w核苷酸平均差異數(shù)為0.00407，其中和田羊最低，為0.571，巴爾楚克羊最高，為6.029。 Tajima’s D 中性檢測顯示，巴爾楚克羊、和田羊和塔什庫爾干羊檢驗結(jié)果顯著(P<0.05，表1)，因此這3個品種可能經(jīng)歷過種群擴張。

表1 15個綿羊品種遺傳多樣性參數(shù)

表2 15個綿羊品種群體間遺傳距離

2.4 遺傳距離和分化

基于 Kimura 雙參數(shù)模型計算15個綿羊品種內(nèi)和品種間的遺傳距離(表2)。品種內(nèi)遺傳距離在0.0006～0.0060，最小是和田羊和烏珠穆沁羊，為0.0006，最大是巴爾楚克羊，為0.006。品種間遺傳距離在0.001～0.006，在新疆13個地方綿羊品種中，和田羊和策勒羊之間的遺傳距離最近，為0.0014，巴爾楚克羊和策勒黑羊的遺傳距離最遠，為0.0059，而且巴爾楚克羊與其它品種羊的遺傳距離均較大。各地理種群總遺傳分化系數(shù)Gst為 0.41938，總固定系數(shù)Fst為 0.69561，總基因流Nm為 4.5。各種群間核苷酸差異數(shù)Kxy在1.0857～5.9783，均值為4.0767；核苷酸歧義度Dxy在00014～0.0059，均值為0.0040，其中策勒羊和巴爾楚克羊的分歧度最大，達到0.0059；遺傳分化系數(shù)Gst在-0.0376～0.1017，均值為0.0268；固定系數(shù)Fst在-0.0893～0.3882，均值為0.0766。

2.5 單倍型分析

在 211個個體中共發(fā)現(xiàn)19種單倍型，其中新疆13個地方綿羊品種有17種單倍型，西藏綿羊單獨享有2個單倍型。在19種單倍型中，有 12個共享單倍型(在2個及以上個體中出現(xiàn))和7個特殊單倍型(僅在1個個體中發(fā)現(xiàn))，其中共享單倍型1(Hap1)出現(xiàn)頻率最高，占個體的51.66 %(109/211)，推測其可能為祖先單倍型，所有的種群均共享該單倍型；其次是單倍型2(Hap2)，占個體的16.59 %(35/211，表3)。用19種單倍型構(gòu)建中介網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，發(fā)現(xiàn)歸屬于3個不同的單倍型群(A,B和C)，分別包括 8、6和5個單倍型。在15個地方綿羊品種中，哈薩克羊單倍型數(shù)量最多，有6個單倍型；烏珠穆沁羊單倍型數(shù)量最少，僅有2個單倍型。

表3 15個綿羊品種單倍型分布情況

續(xù)表3 Continued table 3

2.6 種群變異分析

從表4可知，15個地方綿羊品種種群間的遺傳變異(8.68 %)遠遠小于種群內(nèi)的遺傳變異(91.33 %)。說明，這些地方綿羊品種變異主要來自種群內(nèi)，種群間的遺傳變異較低，品種之間遺傳交流非常頻繁，品種分化不明顯。

2.7 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

品種間遺傳距離構(gòu)建N-J系統(tǒng)進化樹(圖4)顯示，巴爾楚克羊和塔什庫爾干羊單獨聚為一類，其它13個品種聚為一類。

以鄰接法Neighbour-Joining構(gòu)建19個單倍型和參照綿羊、盤羊群體的系統(tǒng)進化樹(圖5)，19個單倍型聚為3支(A,B,C)，單倍型A支包括除和田羊外的14個品種；單倍型B支包括所有的15個品種；單倍型C支包括12個品種，不包括和田羊、烏珠穆沁羊和策勒黑羊。歐洲摩佛倫羊與單倍型A支聚為一支，亞洲摩佛倫羊與單倍型C支聚為一支，這3支與東方盤羊聚在一起，最后再與東方盤羊烏茲別克斯坦亞種聚在一起。

表4 15個綿羊品種的分子變異分析

2.8 種群歷史動態(tài)分析

Tajima's D 是對地理種群古老突變的檢測，F(xiàn)u′s Fs是對近期發(fā)生的種群擴張檢測。根據(jù)Tajima's D 中性檢測結(jié)果，巴爾楚克羊、和田羊和塔什庫爾干羊可能經(jīng)歷過種群擴張。Fu′s Fs 檢驗結(jié)果中負的Fs值和差異顯著的P值被認為種群在歷史上有擴張跡象，提示和田羊可能經(jīng)歷過種群擴張。進一步利用Arlequin軟件進行核苷酸錯配分析，如果期望值是一條平滑的曲線，而觀測值有1個單峰，并且中性檢驗結(jié)果顯著，說明該種群可能在歷史進化過程中經(jīng)歷過種群擴張，如果觀察值呈現(xiàn)多峰，說明該群體大小保持相對穩(wěn)定。對巴爾楚克羊、和田羊和塔什庫爾干羊錯配分析(圖6)發(fā)現(xiàn)，巴爾楚克羊和塔什庫爾干羊錯配分布呈現(xiàn)多峰，且Fu′s Fs 檢驗結(jié)果不顯著，說明該群體大小保持相對穩(wěn)定，未經(jīng)歷種群擴張。和田羊錯配分析有1個單峰，Tajima's D中性檢驗顯著，F(xiàn)u′s Fs檢驗為負值且差異顯著，因此，可認為和田羊群體經(jīng)歷過種群擴張。

3 討 論

3.1 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是指生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，可以遺傳給后代的變異程度。遺傳多樣性越高，遺傳變異程度越大，該種群適應(yīng)環(huán)境的能力就越強[13]。在新疆13個地方綿羊品種和其它2個品種(內(nèi)蒙古烏珠穆沁羊和西藏綿羊)mtDNACytb基因序列中共發(fā)現(xiàn)了24個變異位點，定義了19個單倍型。這15個地方綿羊品種總的單倍型多樣度平均為0.684±0.029，核苷酸多樣性為0.00407，根據(jù)Grant等[14]將mtDNA序列遺傳變異分成的4個類型，羅布羊、葉城羊、塔什庫爾干羊和巴爾楚克羊?qū)儆诟叩膯伪缎投鄻佣?Hd>0.5)和高的核苷酸多樣性(Pi>0.005)，說明這4個品種遺傳多樣性豐富，在進化中產(chǎn)生了較多突變，積累了豐富的單倍型和核苷酸變異，也表明該物種對當?shù)氐沫h(huán)境具有非常強的適應(yīng)能力。其中塔什庫爾干羊的遺傳多樣性與王世峰[12]的研究非常一致。阿勒泰羊、哈薩克羊、巴什拜羊、策勒黑羊、吐魯番黑羊、柯爾克孜羊、多浪羊、巴音布魯克羊、西藏羊和烏珠穆沁羊共10個品種屬于高的單倍型多樣度(Hd>0.5)和低的核苷酸多樣性(Pi<0.005)，說明這些品種也具有豐富的遺傳多樣性，但是沒有足夠的時間積累核苷酸多樣性[15]。和田羊?qū)儆诘偷膯伪缎投鄻佣?Hd<0.5)和低的核苷酸多樣性(Pi<0.005)，說明和田羊種群遺傳多樣性低，中性檢驗表明和田羊經(jīng)歷過種群擴張，種群擴張可以快速增加單倍型多樣度，但沒有足夠的時間積累核苷酸的變異。雖然如此，和田羊的單倍型多樣度仍然比較低。目前，受市場和消費的影響，我國許多地方綿羊品種的數(shù)量在下降[16]，真正純種的和田羊數(shù)量也在下降，結(jié)合遺傳多樣性分析，該品種需要加強遺傳資源的保護。在15個地方綿羊品種中，單倍型多樣度最高的是羅布羊，這是一個生存在塔里木盆地中心的羅布泊地區(qū)，極適宜荒漠草場、極端干旱氣候、耐粗飼、強抗逆的獨特地方羊種，羅布羊的生存地域環(huán)境相對封閉，與其它品種羊交流不多，但其遺傳多樣性豐富，說明其受自然和人工選擇壓力較小，這可能與當?shù)貍鹘y(tǒng)放牧管理、自然交配方式有關(guān)，鄭永富[17]的研究也證實了這一點。

基因流是一個群體遷移到另一個群體時，將某基因帶到新的群體從而產(chǎn)生的基因流動。通常，Nm<1，說明群體可能由于遺傳漂變發(fā)生了分化[18]，Nm>1，說明群體間基因流水平較高，遺傳分化較?。籒m>4說明種群間的基因交流更為充分，遺傳分化更小[19]。15個綿羊品種總基因流Nm為4.5，表明各品種之間的基因交流非常廣泛，這與品種內(nèi)遺傳分化程度較高的結(jié)論相對應(yīng)。分子變異分析也證實了這一點，表明遺傳變異主要來自于品種內(nèi)，而非品種間，也充分表明各品種之間基因交流頻繁，沒有明顯的地理遺傳結(jié)構(gòu)。固定系數(shù)Fst是一種種群間遺傳距離的測度參數(shù)[20]，可反映種群之間基因的差異程度，根據(jù)Weight[21]報道，F(xiàn)st值在0～0.05表明群體間的遺傳分化程度很小，在0.05～0.15表明群體間遺傳分化程度中等，在0.15～0.25表明群體間的遺傳分化較大，15個綿羊品種平均遺傳分化指數(shù)Fst為0.0766，表明群體間的遺傳分化程度中等。其中和田羊與巴爾楚克羊的遺傳分化程度最大，達0.3882；這與兩者的遺傳距離相一致。

3.2 親緣關(guān)系與進化起源分析

遺傳距離分析顯示，15個地方綿羊品種中，和田羊與策勒黑羊、烏珠穆沁羊遺傳距離最近，與巴爾楚克羊遺傳距離最遠；阿勒泰羊與和田羊、烏珠穆沁羊遺傳距離比較近，與巴爾楚克羊和塔什庫爾干羊遺傳距離比較遠；巴爾楚克羊和塔什庫爾干羊與其余13個地方綿羊品種遺傳距離都較遠。從遺傳距離看，和田羊與烏珠穆沁羊的遺傳距離比與西藏羊的遺傳距離近，說明和田羊與蒙古羊系統(tǒng)有一定的親緣關(guān)系。和田羊主產(chǎn)區(qū)與策勒黑羊主產(chǎn)區(qū)有重疊，兩者之間的遺傳距離近，說明這2個品種存在非常近的親緣關(guān)系。策勒黑羊的育成歷史不詳，大概是19 世紀末，引入黑羔皮羊與當?shù)鼐d羊雜交形成，推測是與和田羊雜交育成的。塔什庫爾干羊分布在新疆帕米爾高原上的塔什庫爾干縣，與巴基斯坦、阿富汗和蘇聯(lián)3個國家相鄰。因此，塔什庫爾干羊的育成很可能受周邊地區(qū)羊(如阿富汗肥尾羊和吉薩爾大尾羊)的影響，因此與其它地方品種遺傳距離較遠。而巴爾楚克羊則是因巴爾楚克地名而來，據(jù)《新疆簡史》記載，巴爾楚克命名是在1902年，已知巴爾楚克羊品種的歷史有200多年[22]，它的育成史可能與塔什庫爾干羊或周邊國家的綿羊品種有關(guān)，值得進一步研究。羅布羊是15個地方綿羊品種中遺傳多樣性最高的品種，它與多浪羊、巴音布魯克羊存在系統(tǒng)上的進化關(guān)系，與王慧華[23]、袁澤湖[24]的研究結(jié)果一致。新疆地方綿羊品種的親緣與地理分布有明顯的關(guān)系，從遺傳距離構(gòu)建的進化樹可以看出，柯爾克孜羊、巴音布魯克羊、多浪羊、羅布羊、吐魯番黑羊、葉城羊親緣關(guān)系均較近，這6個品種，除吐魯番黑羊外都分布在天山以南，塔克拉瑪干沙漠邊緣，沿塔里木河流域，地域上的優(yōu)勢使得品種可能互相交流。而吐魯番黑羊則是以巴音布魯克羊為父本，哈薩克羊和卡拉庫爾羊為母本進行雜交,長期選育而成的[25]，因此，與巴音布魯克羊有更近的親緣關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，15個地方綿羊品種分為三大支系：支系 A 占所有單倍型42.1 %(8/19)，包括歐洲摩佛倫羊和14個綿羊品種中(除和田羊)；支系 B占所有單倍型的31.6 %(6/19)，在15個地方綿羊品種中均有分布，支系 C占所有單倍型的26.3 %(5/19)；包括亞洲摩佛倫羊和12個地方綿羊品種(除策勒黑羊、和田羊和烏珠穆沁羊)。表明新疆地方綿羊品種至少有三大母系起源。關(guān)于綿羊起源，一直存在雙起源說[26-28]和三起源說[29-31]。本研究結(jié)果與三起源說相符，除亞洲摩佛倫羊和歐洲摩佛倫羊兩大起源，還有1個不同的母系起源，這也與羅玉柱[32]、劉剛[33]等的研究一致。

對新疆13個地方綿羊品種遺傳多樣性的分析一定程度上可了解這些品種遺傳現(xiàn)狀、系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系，可為后期地方品種資源保護、利用提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

新疆地方綿羊品種除和田羊外，遺傳多樣性都比較高，和田羊的單倍型多樣度最低，為0.396±0.159；羅布羊的單倍型多樣度最高，為0.782±0.107。和田羊和策勒黑羊之間的遺傳距離最近，巴爾楚克羊和策勒黑羊的遺傳距離最遠。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示新疆13個地方綿羊品種有3個不同的母系起源，育成史與地理分布基本一致。和田羊經(jīng)歷過種群擴張，但單倍型多樣度仍比較低，提示和田羊需要加強品種的選育和保護。