甘薯腐爛莖線蟲重組酶聚合酶擴增方法的建立與應(yīng)用

馬居奎，張成玲，楊冬靜，謝逸萍，孫厚俊

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學研究所，農(nóng)業(yè)部甘薯生物學與遺傳育種重點實驗室，江蘇 徐州 221131)

【研究意義】甘薯腐爛莖線蟲(DitylenchusdestructorThorne)又稱馬鈴薯腐爛莖線蟲，是一種寄生于重要經(jīng)濟作物的遷移性內(nèi)寄生線蟲，可寄生超過120種植物[1-2]。甘薯腐爛莖線蟲最早發(fā)現(xiàn)于美國的儲藏甘薯中[3]，主要發(fā)生在溫帶及亞熱帶地區(qū)，現(xiàn)有報道的發(fā)生區(qū)域包括亞洲、非洲、北美洲、南美洲、大洋洲和歐洲[4]。為控制其傳播擴散，該線蟲已被亞太植物保護組織及許多國家和地區(qū)列為植物檢疫性有害生物。甘薯腐爛莖線蟲在國外主要為害馬鈴薯，平均每年給美國馬鈴薯產(chǎn)量的損失達10 %以上[5]。在我國，主要為害甘薯，是我國北方薯區(qū)甘薯生產(chǎn)的三大病害(莖線蟲病、黑斑病、根腐病)的病原之一?！厩叭搜芯窟M展】自1937年首次報道以來，甘薯腐爛莖線蟲病已成為北方薯區(qū)最嚴重的的病害。主要為害甘薯地下莖及塊根，嚴重時可擴展至地上莖部，一般可引起甘薯產(chǎn)量減產(chǎn)30 %～50 %，嚴重時可達到80 %以上，甚至絕收[6]。近年來，該線蟲在我國河北、甘肅、內(nèi)蒙古和黑龍江地區(qū)為害馬鈴薯的現(xiàn)象被陸續(xù)報道[7]。此外，陳品三(1988)和王玉娟(1990)等先后報道了甘薯腐爛莖線蟲可引起當歸麻口病[8-9]。由于我國在過去很長一段時間里未對該線蟲病害進行系統(tǒng)的調(diào)查和準確鑒定，導(dǎo)致甘薯腐爛莖線蟲通過甘薯種薯運輸、種苗調(diào)運、農(nóng)事操作以及花卉植物的種苗、苗木運輸?shù)韧緩?，已擴散到我國十多個省。目前，腐爛莖線蟲的種類鑒定主要通過利用雌成蟲的形態(tài)學特征，但當只有幼蟲、卵和雄蟲時，形態(tài)學就不能識別。此外，該線蟲存在明顯的種內(nèi)分化現(xiàn)象，不同群體在致病性、基因型和形態(tài)學方面都存在明顯的差異[10]。由于形態(tài)學鑒定方法耗時長、操作復(fù)雜需要較強的專業(yè)技能，因此基于DNA的分子檢測技術(shù)逐漸成為線蟲檢測最常用的手段，主要包括隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)、特異引物PCR技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)等[11-16]。PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)具備準確、高效、靈敏度高的特點，同時可實現(xiàn)對根際線蟲的定量檢測；但以PCR為基礎(chǔ)的分子檢測需要相對高質(zhì)量的DNA模板，擴增和檢測需要PCR儀等，且檢測過程需要數(shù)小時，存在對儀器設(shè)備、實驗條件、人員專業(yè)素質(zhì)要求較高的缺點。近年來，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，恒溫核酸擴增技術(shù)越來越受到關(guān)注。該技術(shù)在恒溫條件下進行且反應(yīng)更加迅速，不需要昂貴熱循環(huán)儀等儀器設(shè)備[17]。重組酶聚合酶擴增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一種由重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶參與的恒溫擴增新技術(shù)，可在37～42 ℃下連續(xù)進行反應(yīng)，反應(yīng)時間只需15～30 min。該技術(shù)已應(yīng)用于南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲等根際線蟲的分子診斷[18-20]?！颈狙芯壳腥朦c】本文以甘薯腐爛莖線蟲ITS序列設(shè)計特異性RPA引物，采用不同甘薯腐爛莖線蟲地理群體進行驗證，建立甘薯腐爛莖線蟲RPA反應(yīng)體系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究結(jié)果為快速檢測甘薯腐爛莖線蟲提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試線蟲 供試線蟲群體名稱、寄主及地理來源見表1。

1.1.2 主要試劑動物基因組DNA快速抽提試劑盒、瓊脂糖購于生工生物工程(上海)有限公司；RPA核酸擴增試劑盒(TwistAmp?Basic Kit)購于南京紐帕斯生物科技有限公司；EmeraldAmp?MAX PCR Master Mix、DL2000 DNA maker及蛋白酶K購于寶生物工程(大連)有限公司；Omega HP Plant DNA Kit試劑盒、PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒購于鼎思(南京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 線蟲種群和DNA提取 從全國不同地區(qū)采集病薯，采用淺盤法分離獲得甘薯腐爛莖線蟲(表1)。收集甘薯腐爛莖線蟲放入1.5 mL離心管中，經(jīng)5000 r/min離心10 min后，使用移液器盡量吸去管中的水，將離心管放入液氮中速凍30 s后，使用研磨杵進行研磨，研磨后的勻漿使用動物基因組DNA快速抽提試劑盒(上海生工)提取線蟲DNA。南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、象耳豆根結(jié)線蟲、大豆胞囊線蟲、禾谷胞囊線蟲、貝西滑刃線蟲、咖啡短體線蟲等群體采用同樣試劑盒提取DNA模板備用。所有供試群體均通過形態(tài)學和分子鑒定確認。

表1 供試線蟲群體信息

表2 本文所用的引物及其序列信息

1.2.2 引物設(shè)計和檢測 根據(jù)結(jié)果，從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中下載甘薯腐爛莖線蟲核糖體ITS序列(GenBank No：EF210372)及其他植物寄生線蟲ITS基因序列，進行多重比對分析，尋找序列中的特異性片段，設(shè)計引物進行合成。

RPA反應(yīng)使用TwistAmp?Basic Kit，反應(yīng)總體系為50 μl，首先在0.2 mL的PCR管中加入緩沖液29.5 μl，10 μmol/L的上游引物DD-RPAF和下游引物DD-RPAR(表2)各2.4 μl，DNA模板1 μl(～10 ng)，ddH2O 12.2 μl，用移液器吸打混勻后，加入到含有RPA凍干酶粉的反應(yīng)管中，并用移液器混勻，最后加入280 mmol/L的MgAc溶液2.5 μl。將上述RPA擴增體系充分混勻，置于39 ℃的水浴或者金屬浴孵育25 min，獲得RPA擴增產(chǎn)物。將5 μl RPA產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA染料染色后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下顯像。

1.2.3 甘薯腐爛莖線蟲RPA反應(yīng)靈敏度檢測 提取甘薯腐爛莖線蟲的基因組DNA，采用Nanodrop2000 測定DNA濃度，再用水將其稀釋成10、1、10-1、10-2、10-3ng/μl。

分別以這5種不同濃度的甘薯腐爛莖線蟲DNA為模板(1 μl)，以清水為陰性對照，參照1.2.2進行RPA反應(yīng)并檢測。

普通PCR以上述梯度稀釋的DNA模板，擴增體系為25 μl，DNA模板1 μl，10 μM引物DdF1和DdR1(表2)各1 μl，EmeraldAmp?MAX PCR Master Mix(TaKaRa，大連)12.5 μl，ddH2O補足至25 μl，以清水為陰性對照，在Eppendorf PCR擴增儀上進行擴增。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 4 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。將5 μl PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA染料染色后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.2.4 單條甘薯腐爛莖線蟲RPA反應(yīng)靈敏度檢測 挑取單條甘薯腐爛莖線蟲，置于含有10 μl裂解緩沖液(8 μl ddH2O和1 μl 10×PCR buffer)的200 μl PCR管中，隨后在液氮中冷凍2 min，65 ℃水浴2 min，重復(fù)3次，然后向PCR管中加入1 μl 10 mg/mL蛋白酶K，65 ℃溫育1.5 h，95 ℃處理10 min，14 000 r/min離心1 min，獲得單條甘薯腐爛莖線蟲DNA模板(以100計)，并按10倍梯度依次稀釋10-1、10-2、10-3和10-4條線蟲DNA。以上述梯度的DNA模板進行RPA和PCR反應(yīng)檢測。

1.2.5 混合樣本RPA反應(yīng)檢測 將20條甘薯腐爛莖線蟲和50 mg甘薯薯塊組織混合作為檢測對象，陰性對照為不含甘薯腐爛莖線蟲的甘薯薯塊組織。甘薯腐爛莖線蟲和植物組織(甘薯薯塊組織)混合樣本DNA提取采用Omega HP Plant DNA Kit試劑盒。

將100條腐爛莖線蟲和250 mg自然狀態(tài)下土壤混合作為檢測樣本，陰性對照為不含甘薯腐爛莖線蟲的土壤。腐爛莖線蟲和土壤混合樣品的DNA提取采用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒。

1.2.6 田間病樣檢測 采集6個罹病甘薯薯塊樣本和4個罹病薯塊周圍土壤，分別采用Omega HP Plant DNA Kit試劑盒和PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒提取DNA備用。采用RPA法和普通PCR法對DNA樣本進行測定，以未發(fā)病薯塊DNA樣本和土壤作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA引物特異性檢測

將5 μl RPA產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA染料染色后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下顯像；引物DD-RPAF、DD-RPAR擴增后，甘薯腐爛莖線蟲群體能穩(wěn)定獲得230 bp特異性片段，而南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、象耳豆根結(jié)線蟲、大豆孢囊線蟲、禾谷孢囊線蟲、貝西滑刃線蟲、咖啡短體線蟲等群體無特異性條帶(圖1)，表明該引物可特異性擴增甘薯腐爛莖線蟲樣本。

2.2 甘薯腐爛莖線蟲群體基因組DNA 的RPA反應(yīng)靈敏度檢測

提取甘薯腐爛莖線蟲基因組DNA，采取10倍梯度稀釋，通過RPA和PCR 2種方法檢測其靈敏度。當樣本最大稀釋至10-2ng/μl時，2種方法能夠分別擴增產(chǎn)生約230和495 bp的特異性條帶，樣本進一步稀釋均無擴增條帶產(chǎn)生，表明 RPA技術(shù)與普通PCR檢測的靈敏度相當，檢測限約為10-2ng/μl(圖2)。

2.3 單條甘薯腐爛莖線蟲RPA反應(yīng)靈敏度檢測

提取單條甘薯腐爛莖線蟲基因組DNA，采取10倍梯度稀釋，通過RPA和PCR 2種方法檢測其靈敏度。實驗結(jié)果顯示，樣本最大稀釋至100倍時，2種方法能夠分別擴增產(chǎn)生約230 和495 bp的特異性條帶，樣本進一步稀釋均無擴增條帶產(chǎn)生，表明RPA技術(shù)與普通PCR檢測的靈敏度相當，檢測限約為1/100條線蟲(圖3)。

2.4 混合樣本RPA反應(yīng)檢測

對甘薯腐爛莖線蟲—薯塊組織和線蟲—土壤混合樣本分別進行RPA反應(yīng)檢測，結(jié)果顯示，存在甘薯腐爛莖線蟲的混合樣本都能產(chǎn)生特異性條帶，而在僅有薯塊組織和土壤的樣本中無特異性條帶產(chǎn)生(圖4)。實驗結(jié)果證明，RPA技術(shù)可用于甘薯腐爛莖線蟲的田間檢測。

2.5 田間病樣檢測結(jié)果

田間檢測結(jié)果顯示，RPA檢測法和PCR檢測法基本一致，6個病薯中均檢測到甘薯腐爛莖線蟲。但在病薯根際土壤中部分樣本，RPA和PCR檢測法均未檢測到該線蟲(表3)。這可能是由于土壤中線蟲數(shù)量較少，提取模板濃度較低導(dǎo)致的。

3 討 論

重組酶聚合酶擴增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技術(shù)是一種新興的恒溫核酸擴增技術(shù)，在病害診斷過程中越來越受到關(guān)注[21]。本文建立了甘薯腐爛莖線蟲RPA檢測方法，使用特異性的RPA引物(DD-RPAF/DD-RPAR)在39 ℃的恒溫條件下，25 min即可完成DNA快速擴增。前人的研究表明，在37～42 ℃恒溫條件下，RPA反應(yīng)在60 min內(nèi)可以產(chǎn)生10億個DNA拷貝[22]，相比于普通PCR反應(yīng)(2.5 h)和LAMP反應(yīng)(1 h)，反應(yīng)時間更短[23]。此外，RPA技術(shù)低溫孵育取代了PCR的熱循環(huán)模式，使該技術(shù)有望成為田間檢測甘薯腐爛莖線蟲一種行之有效的方法。

RPA技術(shù)的關(guān)鍵是篩選出特異性高的引物[24]，引物設(shè)計規(guī)則與PCR相似，但引物略長于PCR引物，引物堿基數(shù)介于30～38 bp之間時可以提高引物與重組酶結(jié)合的穩(wěn)定性，更好地進行擴增反應(yīng)[25-26]。在靈敏度檢驗中，一些研究發(fā)現(xiàn)RPA技術(shù)與PCR或real-time PCR反應(yīng)相接近[27-28]。此外，某些RPA反應(yīng)靈敏度被證實高于普通PCR反應(yīng)[20,29]。本研究中，甘薯腐爛莖線蟲RPA反應(yīng)與PCR反應(yīng)靈敏度一致，基因組DNA檢出限約為10-2ng/μl，單條甘薯腐爛莖線蟲檢出限約為1/100條線蟲。因此，該RPA引物可用于甘薯腐爛莖線蟲的分子鑒定和病害診斷。為保證該方法檢測可靠性和穩(wěn)定性，本研究中利用設(shè)計的RPA引物對8個甘薯腐爛莖線蟲群體和7種形態(tài)、生物學特性相似的植物寄生線蟲進行檢測，結(jié)果顯示，該RPA方法具有良好的特異性和穩(wěn)定性。

在自然條件下，甘薯腐爛莖線蟲往往寄生于植物組織或者土壤中，許多自然條件下樣本中都含有目標以外的各種雜質(zhì)，特別是土壤中，含有數(shù)以萬計的微生物和有機肥料等物質(zhì)[30]。土壤中的多種微生物與環(huán)境的相互作用，DNA提取過程中一些腐殖質(zhì)及土壤中許多未知因素都可能嚴重影響對目標線蟲的檢測。本研究建立的RPA方法不僅可以從群體gDNA和單條線蟲DNA檢測到甘薯腐爛莖線蟲，而且還可以從病薯組織或病薯根際土壤中檢測到甘薯腐爛莖線蟲，省去了傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定和PCR檢測方法所需的從樣本中分離目標線蟲的步驟，簡化了檢測過程，節(jié)省了檢測時間。

表3 樣品檢測結(jié)果

4 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明，RPA技術(shù)是一種耗時短、靈敏度高、穩(wěn)定性強的甘薯腐爛莖線蟲分子鑒定技術(shù)。本研究建立的RPA檢測方法可用于甘薯腐爛莖線蟲檢測診斷，對甘薯莖線蟲病的現(xiàn)場檢測、早期診斷和指導(dǎo)科學施藥具有重要意義。