柚皮素對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化損傷的作用

李再巧，王沙凝，吳 沖，田 迪，葉桂芝，宋 羚，桂明英，馬 嘯,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學龍潤普洱茶學院，云南 昆明 650201；2.云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，云南 昆明 650201)

【研究意義】 隨著生活水平的不斷提高，人們越來越重視各種原因引起的皮膚問題，如：皮膚老化、炎癥、癌變等[1]。當人體自身擁有用于抵御氧化損傷的系統(tǒng)不足以抵御氧化損傷時，則需進行外界干預，那么更天然、更安全的抗氧化劑和抗衰老藥物就成為人們迫切需要的物質(zhì)[2]。如暴露于微小顆粒物(PM 2.5)、紫外線、灰塵等環(huán)境中都能引起皮膚老化從而引發(fā)一系列的皮膚問題：皺紋、異常色素沉著和皮膚干燥等，產(chǎn)生這些的原因是由于細胞過度暴露于活性氧(reactive oxygen species, ROS)等之類的自由基所引起的，也就是ROS的形成與自身抗氧化防御能力之間出現(xiàn)不平衡導致的結果[3]?！厩叭搜芯窟M展】已有研究表明多酚類物質(zhì)能夠抗氧化、抗炎和抗菌，同時對傷口愈合起作用。柚皮素屬于二氫黃酮類化合物，以柚子等柑橘類水果中含量較豐富，也是一種天然抗氧化劑[4]。在菝葜、化紅、枳實、桃葉等天然植物中也含有該類物質(zhì)，具有和多酚類物質(zhì)相似的功效：抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤清除自由基及抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、預防動脈粥樣硬化、抗衰老[5]等多種活性。因其抗氧化和抗炎作用可以對肝臟起到很好的保護作用[6]。【本研究切入點】與其他抗氧化劑相比，柚皮素有更強的效力和良好的作用，從而在生活中顯示出很大的等待發(fā)掘利用的潛在價值?！緮M解決的關鍵問題】研究柚皮素對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化損傷的作用，為柚皮素在皮膚保護方面的開發(fā)應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株HaCaT細胞，中國科學院昆明細胞庫；培養(yǎng)基，Hyclone公司；胎牛血清，Gibco公司；青鏈霉素，碧云天公司；CO2培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；超凈工作臺，蘇州凈化公司；低溫高速離心機，Eppendorf公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；低速離心機，上海盧湘離心儀器有限公司；酶標儀，Molecular Devices公司；曝光機，北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司；倒置顯微鏡，上海蔡康光學儀器有限公司；細胞計數(shù)器，count star公司；一抗SOD2、CDK2，成都正能生物技術有限責任公司；DMSO、柚皮素和氧化試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HaCaT細胞復蘇后，用含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在5% CO2培養(yǎng)箱 (37 ℃，相對濕度95%)中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化后再用培養(yǎng)基稀釋制成細胞密度為1×106細胞混合液，接種在60 mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d后進行給藥處理。

1.2.2 構建細胞氧化損傷模型[7]首先將H2O2稀釋為10 mmol·L-1濃度的母液，之后再用培養(yǎng)基稀釋為100、200、300、400 μmol·L-1幾個濃度，分別加到已經(jīng)接種細胞且細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部面積80%以上的60 mm培養(yǎng)皿中去處理4 h進行造模，為后續(xù)實驗做準備。

1.2.3 MTT[8]活力測定 用處于對數(shù)生長期的細胞, 吸取0.25%胰酶1 mL消化8～10 min, 用培養(yǎng)基將細胞數(shù)量調(diào)整為5.0×104個 mL-1，每孔以200 μl的細胞培養(yǎng)基混合液體積接種在96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后吸去上層培養(yǎng)基之后進行后續(xù)操作。實驗組及空白對照組各200 μl，每個濃度設置6個復孔，在5% CO2(37 ℃，相對濕度95%) 條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)結束前4 h，每孔加入MTT (5 ng·mL-1) 16 μl。培養(yǎng)結束時吸去上清液加入160 μl的DMSO 振蕩10 min，充分溶解結晶物并測定吸光度(A492值)并計算分析。

1.2.4 細胞H&E染色 用胰酶消化下對數(shù)生長期的細胞在培養(yǎng)基稀釋后接種在24孔板中，接種密度為每個孔10 000個細胞，在5% CO2(37 ℃，相對濕度95%) 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后可以進行后續(xù)給藥處理，結束后用95%乙醇固定20 min后用PBS洗兩次；用蘇木精浸泡4 min除去蘇木精后用水洗3 s，然后用含有1%的乙醇溶液沖洗3 s，水沖洗10 s，氨水沖洗15 s，水沖洗10 s。之后用伊紅染色2 min除去伊紅，用水沖洗2 s，80%乙醇洗2 s，隨后用95%乙洗5 min，100%乙醇洗10 min，然后在空氣中自然干燥后進行拍照。

1.2.5 細胞克隆形成實驗 用處于對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后收集并稀釋后接種在6孔板中，每個孔中接種細胞數(shù)為500～1000個，放入5% CO2(37 ℃, 相對濕度95%) 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后棄去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度的柚皮素(6.25、12.5、25 μmol·L-1)的培養(yǎng)基處理細胞2 d后換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后，用甲醇固定細胞10 min后0.1%結晶紫溶液染色15～30 min，回收結晶紫染液后多洗滌幾次后放在空氣中干燥之后即可拍照。接下來用10%的冰乙酸對結晶紫進行溶解在560 nm處測量吸光值后進行計算分析。

1.2.6 細胞劃痕實驗 先在6孔板背后做好標記(用標記筆配合直尺劃線，線與線之間隔0.75 cm，至少劃5條線)為方便后續(xù)劃痕；把消化收集到的對數(shù)生長期的細胞稀釋后以細胞密度為5×105每個孔加到6孔板中，每個實驗組做3個重復孔，等細胞在顯微鏡下被觀察到呈單層貼壁生長時，用提前消過毒的200 μl槍頭和直尺并用在6孔板上方垂直劃痕(用力均勻慢速，盡量避免傾斜)；之后用PBS多次清洗盡量洗干凈劃下來懸浮著的細胞；接著分別加入不同濃度的柚皮素處理，放入5% CO2(37 ℃, 相對濕度95%) 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h后置于顯微鏡下拍照。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達 用不同濃度的柚皮素(6.25、12.5、25 μmol·L-1)處理H2O2損傷的HaCaT細胞4 h后，以100∶1的比例配制混合均勻RIPA裂解液和PMSF用于提取HaCaT細胞總蛋白，之后用BCA試劑盒對所提蛋白進行濃度測定并

分裝制成自己實驗需要的蛋白樣品，然后通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來把不同分子量的蛋白分離開之后用轉(zhuǎn)膜裝置將電泳好的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再把膜放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中在搖床上(室溫下)封閉1 h后回收封閉液，用TBST清洗3次每次5 min后加入一抗放在4 ℃冰箱中的搖床上孵育12 h，回收一抗后用TBST清洗3次每次5 min，加入二抗在搖床上(室溫下)孵育1 h后，用TBST清洗3次每次5 min(具體洗滌次數(shù)和時間可根據(jù)實際情況進行調(diào)整)，最后用曝光機進行拍照顯影，用Image J軟件進行分析。

1.2.8 MDA、SOD 水平檢測 參照文獻[9]根據(jù)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒的說明書步驟逐一進行測定并統(tǒng)計結果。上述所有實驗操作重復3次及以上。

1.3 統(tǒng)計學分析

圖片分析用Image J軟件，實驗數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 5統(tǒng)計軟件分析。

2 結果與分析

2.1 HaCaT細胞存活率

2.1.1 H2O2對HaCaT細胞存活率的影響 由圖1可見，H2O2100、200 μmol·L-12個濃度處理與0 μmol·L-1(CK)處理相比，細胞活力在P<0.01水平差異顯著，300、400 μmol·L-12個濃度處理與0 μmol·L-1(CK)處理相比，細胞活力在P<0.001水平差異極顯著，表明隨著H2O2的濃度升高，HaCaT細胞活力呈下降趨勢。因此，后續(xù)實驗選擇300 μmol·L-1作為H2O2的建模濃度。

2.1.2 柚皮素對HaCaT細胞存活率的影響 由圖2可見，與0 μmol·L-1(CK)處理相比，柚皮素50 μmol·L-1濃度處理的細胞活力在P<0.05水平有差異顯著，柚皮素100、200 μmol·L-12個濃度處理的細胞活力在P<0.001水平差異高度顯著。試驗表明，隨著柚皮素濃度的升高，HaCaT 細胞活力呈下降趨勢。因此選擇柚皮素濃度0～50 μmol·L-1為治療濃度進行后續(xù)實驗。

2.2 細胞H&E染色

由圖3可見，與0 μmol·L-1(CK，a)處理相比，DMSO(25 μmol·L-1，b)處理對細胞無明顯損傷作用；H2O2(300 μmol·L-1，c)處理的細胞形狀明顯發(fā)生變化，邊緣皺縮明顯，細胞飽滿度不足；柚皮素(6.25 μmol·L-1，d；12.5 μmol·L-1，e；25 μmol·L-1，f)處理能夠顯著治療H2O2損傷的HaCaT細胞形狀越來越飽滿，邊緣皺縮逐漸減少，結果表明柚皮素對H2O2損傷的HaCaT細胞有治療作用。

2.3 細胞克隆形成實驗

由圖4可見，與0 μmol·L-1(CK，a)處理相比，H2O2(濃度300 μmol·L-1，b)處理的細胞數(shù)量在P<0.001水平差異極顯著。與0 μmol·L-1(CK，a)處理相比，用H2O2(濃度300 μmol·L-1)處理后，加柚皮素6.25 μmol·L-1(c)處理的細胞數(shù)量在P<0.001水平差異極顯著，加柚皮素12.5 μmol·L-1(d)處理的細胞數(shù)量在P<0.05水平有差異，加柚皮素25 μmol·L-1(e)處理的細胞數(shù)量在P<0.01水平差異顯著。結果表明柚皮素可恢復H2O2損傷HaCaT細胞的增殖生長，且柚皮素的處理濃度在12.5 μmol·L-1時效果更佳。

2.4 細胞劃痕實驗

由圖5可見，與0 μmol·L-1(CK，b)處理相比，在H2O2(濃度300 μmol·L-1，c)處理后，細胞劃痕閉合度在P<0.01水平差異顯著。與0 μmol·L-1(CK，b)處理相比，用H2O2(濃度300 μmol·L-1)處理后，加柚皮素6.25 μmol·L-1(d)處理的細胞劃痕閉合度在P<0.05水平有差異，柚皮素12.5μmol·L-1(e)處理的細胞劃痕閉合度在P<0.01水平差異顯著，柚皮素25 μmol·L-1(f)處理的細胞劃痕閉合度在P<0.001水平差異極顯著。說明柚皮素在低濃度下能夠加快受氧化損傷HaCaT細胞快速生長。柚皮在濃度為6.25 μmol·L-1時效果更佳。

2.5 Western blot檢測蛋白表達

由圖6可見，與0 μmol·L-1(CK)處理相比，僅用H2O2(濃度300 μmol·L-1)的處理其SOD2、CDK2蛋白表達量在P<0.05水平有差異；與0 μmol·L-1(CK)處理相比，H2O2(濃度300 μmol·L-1)加柚皮素6.25、12.5、25 μmol·L-13個處理的SOD2、CDK2蛋白表達量水平在P<0.05水平無差異，說明柚皮素能通過調(diào)節(jié)SOD2、CDK2蛋白對氧化損傷產(chǎn)生作用。

2.6 抗氧化試劑盒檢測

由圖7可見，與0 μmol·L-1(CK)處理相比，僅用H2O2(濃度300 μmol·L-1)的處理其MDA含量和SOD含量在P<0.001水平差異極顯著；與0 μmol·L-1(CK)處理相比，H2O2(濃度300 μmol·L-1)加柚皮素6.25、12.5、25 μmol·L-13個處理的MDA含量在P<0.05水平?jīng)]有差異，H2O2(濃度300 μmol·L-1)加柚皮素6.25 μmol·L-1處理的SOD含量在P<0.01水平差異顯著，而H2O2(濃度300 μmol·L-1)加柚皮素12.5、25 μmol·L-12個處理的SOD含量在P<0.05水平?jīng)]有差異。說明柚皮素能夠治療H2O2誘導的氧化損傷。

3 討 論

本研究用H2O2成功建成HaCaT細胞衰老模型，這與已有的實驗結果一致，在用柚皮素進行治療處理的結果：細胞活性、形態(tài)、增值能力、抗氧化試劑盒和相關通路蛋白研究結果也與前人的研究結果保持一致。有實驗證明黃酮能對H2O2誘導的氧化損傷起到保護作用[10]，從本實驗結果來看柚皮素確實能對氧化損傷起到治療作用；對氧化損傷的細胞在治療效果和改善細胞形態(tài)上的作用較明顯[11]，在對抗糖尿病和改善肝臟和腎臟功能方面也很有可能起到增強作用[12]；對成纖維細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用、對細胞周期產(chǎn)生阻斷作用，促進凋亡，抑制成纖維細胞的運動活性[13]。還可以通過抑制HaCaT細胞的凋亡從而保護皮膚減弱損傷[14]；能夠起到抑制大鼠肺鱗癌的作用[15]；降低皮炎炎癥程度[16]。凹紋胡蜂蜂巢中的黃酮同樣具有抗氧化活性[17]，枸杞多糖[18]，楊梅黃酮[19]，花青素[20]，枸杞多糖[21]等都能對皮膚起到抗氧化進而保護皮膚的作用。皮膚老化隨著年齡的增長而發(fā)生，表現(xiàn)為皮膚變薄、細紋出現(xiàn)、彈性降低等現(xiàn)象[22]。從實驗結果來看，低濃度的柚皮素對皮膚衰老有治療作用。通過調(diào)節(jié)HaCaT細胞增殖能夠達到保護皮膚的作用[23]。類似的研究也證實了柚皮素能減緩氧化應激反應，延長壽命，延緩衰老相關疾病的發(fā)展[24]。本實驗只是進行了初步的研究，日后將可以進一步探討研究柚皮素的其他相關保護機制。

4 結 論

本研究主要是通過H2O2來建造HaCaT細胞的氧化損傷模型，從而通過幾種方式來驗證柚皮素對 H2O2造成的細胞氧化損傷的作用。結果表明H2O2在一定的濃度下能夠降低HaCaT細胞的活性和生長速度并且影響其細胞形態(tài)，增強細胞的氧化反應，影響HaCaT細胞的正常生長。用具有抗氧化性能的柚皮素治療處理，能夠不同程度的降低氧化損傷，恢復細胞的正常生長。柚皮素在HaCaT細胞中展現(xiàn)出初步的抗氧化效果，進一步確定柚皮素的抗氧化性能，為柚皮素開拓更廣闊的用途提供理論支持。