小麥種子顏色測(cè)定的色差計(jì)法和目測(cè)法及對(duì)穗發(fā)芽抗性的鑒定效果

陳 泠，朱展望，劉易科，佟漢文，何偉杰，鄒 娟，張宇慶，高春保,2

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部華中地區(qū)小麥病害生物學(xué)科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/湖北省小麥工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430064；2.主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，長(zhǎng)江大學(xué)，湖北荊州 434025)

我國(guó)的長(zhǎng)江中下游麥區(qū)、西南麥區(qū)、東北春麥區(qū)等區(qū)域在小麥成熟時(shí)節(jié)常出現(xiàn)陰雨天氣，小麥易發(fā)生穗發(fā)芽災(zāi)害[1-2]。穗發(fā)芽不僅會(huì)降低小麥產(chǎn)量，易使籽粒霉?fàn)€、品質(zhì)劣化，而且會(huì)導(dǎo)致小麥喪失種用價(jià)值。小麥種子顏色目測(cè)可區(qū)分為紅粒小麥和白粒小麥，且一般認(rèn)為紅粒小麥的穗發(fā)芽抗性比白粒小麥強(qiáng)[3-4]。小麥種子顏色的目測(cè)法結(jié)果易受主觀和環(huán)境因素影響，誤差較大。NaOH法也可以判斷小麥種子顏色，紅粒和白粒小麥種子經(jīng)5% NaOH溶液浸泡后，溶液分別呈深紅色和淡黃色[5]，但這種方法也存在感官誤差。用色差計(jì)測(cè)量顏色，數(shù)據(jù)客觀穩(wěn)定，可排除人為因素干擾，便于不同測(cè)量材料間定量比較。色差計(jì)的測(cè)定方法多采用CIELAB(L*a*b*)系統(tǒng)[6]。該系統(tǒng)以3個(gè)色度測(cè)量值L*、a*、b*表示樣品的顏色，其中L*為正值表示亮，為負(fù)值表示暗；a*為正值表示紅色，為負(fù)值表示綠色；b*為正值表示黃色，為負(fù)值表示藍(lán)色。Peterson等[7]用色差計(jì)法和目測(cè)顏色分級(jí)法分析了543份美國(guó)硬白冬小麥籽粒顏色，發(fā)現(xiàn)部分色差計(jì)參數(shù)L*、a*、b*在不同分級(jí)間差異顯著，但無(wú)法用于準(zhǔn)確判斷顏色分級(jí)。Groos等[8]認(rèn)為，a*/L*比值比較適合分析小麥籽粒顏色和小麥穗發(fā)芽間的關(guān)系。Imtiaz等[5]用小麥種子色差計(jì)數(shù)據(jù)與小麥穗發(fā)芽進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，a*/L*比值與種子發(fā)芽指數(shù)、穗發(fā)芽率間相關(guān)系數(shù)分別為-0.64和-0.37(P< 0.001)。Zhu等[9]在全基因組關(guān)聯(lián)定位小麥穗發(fā)芽抗性QTL位點(diǎn)時(shí)，將色差計(jì)參數(shù)a*/L*比值作為小麥種子顏色的替代值來(lái)分析QTL位點(diǎn)與種子顏色的相關(guān)性。

本研究利用色差計(jì)分析小麥種子顏色，期望用色度的指標(biāo)L*、a*和b*等來(lái)定量分析小麥的種子顏色，同時(shí)比較色差計(jì)法和目測(cè)法測(cè)定結(jié)果與小麥穗發(fā)芽抗性的相關(guān)性，以期為穗發(fā)芽抗性分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究分析用小麥材料790份，包括湖北地方小麥資源種質(zhì)材料557份(由湖北省中期種質(zhì)資源庫(kù)提供)和優(yōu)異品種(系)233份(含國(guó)外材料12份)。驗(yàn)證用小麥材料228份(國(guó)內(nèi)育成品種和品系217份，國(guó)外材料11份)。所有材料于2018-2019年度種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南湖試驗(yàn)田，正常田間管理。

1.2 整穗發(fā)芽率測(cè)定

在小麥生理成熟時(shí)，每個(gè)分析材料隨機(jī)選取5個(gè)穗子(含10 cm穗下節(jié)部分)，每個(gè)驗(yàn)證材料隨機(jī)選取10個(gè)穗子，取樣時(shí)確保穗子完整、無(wú)病害、無(wú)缺損。樣品室溫晾干5 d，保存于-20 ℃冰箱中待用。材料收集完成后，從冰箱中取出穗子，插在有孔的托盤(pán)上，室溫晾干2 d。托盤(pán)孔徑0.6 cm，孔距1.6 cm。托盤(pán)移至人工氣候室中進(jìn)行自動(dòng)降雨模擬實(shí)驗(yàn)，每4 h噴淋20 min，室內(nèi)溫度20±2 ℃。處理5 d后取出發(fā)芽整穗，保存在-20 ℃冰箱中，以便后期人工計(jì)數(shù)。以種子胚芽或胚根超過(guò)種子長(zhǎng)度的一半作為發(fā)芽鑒定標(biāo)準(zhǔn)。小麥材料的整穗發(fā)芽率(SGR)=(所有穗子的發(fā)芽種子數(shù)/所有穗子種子總數(shù))×100%。

1.3 色差計(jì)測(cè)量

色差計(jì)為柯尼卡美能達(dá)CM-5(https://sensing.konicaminolta.asia/product/cm-5-spectrophotometer/)。田間小麥材料成熟后，人工收割，利用單穗脫粒機(jī)進(jìn)行脫粒，每個(gè)小麥品種(系)經(jīng)人工去雜，剔除病害、雜粒和不飽滿粒后，稱(chēng)取30 g種子用于色差計(jì)測(cè)量顏色參數(shù)。色差計(jì)先用白板校正，然后開(kāi)始下述操作步驟：將種子倒?jié)M測(cè)量平皿，用直尺沿平皿表面刮平后進(jìn)行測(cè)量。重復(fù)上述步驟，獲得L*、a*、b*的3次測(cè)量值，L*值越大，顏色越亮(白)，a*值越大，顏色越偏紅色，b*值越大，顏色越偏黃色。取3次結(jié)果的平均值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel和SPSS20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥籽粒顏色的色差計(jì)測(cè)定結(jié)果和穗發(fā)芽情況

小麥籽粒的L*、a*和b*平均值分別為 52.60±3.18、10.19±1.03和27.54±2.30，其中a*的變異系數(shù)最大，b*值其次，L*最小(表1)。

表1 色差計(jì)和穗發(fā)芽結(jié)果分析

通過(guò)目測(cè)法將790份材料分成455份紅粒材料和335份白粒材料。對(duì)色差計(jì)測(cè)定指標(biāo)L*、a*和b*及其比值進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)表明，紅粒和白粒材料間L*、a*、b*、a*/b*和a*/L*均值均差異顯著，其中紅粒的a*、a*/b*和a*/L*均值顯著高于白粒，其他值均顯著低于白粒。說(shuō)明紅粒小麥種子顏色偏紅暗，白粒小麥種子顏色偏黃亮。紅粒小麥的SGR均值顯著低于白粒小麥，說(shuō)明紅粒小麥比白粒小麥抗穗發(fā)芽。紅粒和白粒小麥SGR的變化范圍分別為0.00%～100.00%和4.33%～ 99.58%，說(shuō)明紅粒和白粒小麥中都有抗穗發(fā)芽和感穗發(fā)芽材料。

紅粒和白粒的L*、a*和b*值變異系數(shù)相對(duì)于總體有所降低，但紅粒SGR變異系數(shù)高達(dá)122.36%，說(shuō)明紅粒小麥在品種(系)間SGR值差異很大。

2.2 色差計(jì)參數(shù)、種子顏色、SGR之間的相關(guān)性

對(duì)色差計(jì)數(shù)據(jù)、種子顏色(紅粒設(shè)置為1，白粒設(shè)置為2)和SGR數(shù)據(jù)相關(guān)性分析(表2)表明，790份小麥材料的色差計(jì)參數(shù)與種子顏色均顯著相關(guān)，其中a*、a*/b*和a*/L*與種子顏色呈負(fù)相關(guān)，其他呈正相關(guān)。特別是a*/b*和b*/a*與種子顏色相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.934和0.941，說(shuō)明a*/b*值越大或b*/a*值越小，種子顏色越趨于紅色。色差計(jì)參數(shù)、種子顏色與SGR均顯著相關(guān)，其中a*/b*和b*/a*與SGR相關(guān)性較高(相關(guān)系數(shù)分別為-0.831和 0.835)，而種子顏色與SGR的相關(guān)性最高(相關(guān)系數(shù)為0.854)，說(shuō)明白粒(種子顏色值高)或b*/a*值大，穗發(fā)芽率高。

表2 色差計(jì)數(shù)據(jù)、種子顏色和SGR間的相關(guān)性

與總體相比，紅粒和白粒材料的部分?jǐn)?shù)據(jù)間相關(guān)性發(fā)生變化。如a*與L*和b*的相關(guān)性由負(fù)相關(guān)變?yōu)檎嚓P(guān)。紅粒材料中，僅a*/b*和b*/a*與SGR顯著相關(guān)。白粒材料中，除L*和b*/L*外，其他色差計(jì)數(shù)據(jù)均與SGR顯著相關(guān)。色差計(jì)各參數(shù)與SGR相關(guān)值都較低。

2.3 色差計(jì)法判斷種子顏色回歸方程及驗(yàn)證

將種子顏色設(shè)定值作為因變量(紅粒設(shè)置為1，白粒設(shè)置為2)，色差計(jì)參數(shù)為自變量，進(jìn)行逐步回歸分析，得到方程Y=-12.699+ 1.232b*/a*+21.308b*/L*-0.349b*+ 0.175L*，調(diào)整后R2為 0.908。利用該方程對(duì)790份分析材料進(jìn)行檢驗(yàn)，紅粒材料Y值為0.61～1.42，白粒材料Y值為1.53～2.41，四舍五入后與目測(cè)結(jié)果完全一致。用228份驗(yàn)證材料進(jìn)行驗(yàn)證，得到紅粒材料Y值為0.85～1.36，白粒材料Y值為 1.64～2.22，與感官評(píng)價(jià)一致，說(shuō)明用色差計(jì)可以很好地判斷種子顏色。

利用色差計(jì)測(cè)量結(jié)果可以比較不同小麥材料的種子顏色差異。按種子L*、a*、b*、a*/b*和b*/a*值的升高順序?qū)?28份驗(yàn)證小麥材料進(jìn)行排序，取部分小麥材料種子進(jìn)行種子顏色比較(圖1)。隨著L*值的升高，小麥種子顏色變亮(圖1A)。a*值升高，種子紅色加深(圖1B)。b*值升高，種子越偏黃色(圖1C)。a*/b*值升高，種子顏色由偏黃色變?yōu)槠t色(圖1D)。b*/a*值升高，種子顏色變化與a*/b*的種子顏色變化相反(圖1E)。

A～E：小麥種子按L*，a*，b*，a*/b*和b*/a*升序排列，數(shù)字表示小麥種子按L*，a*，b*，a*/b*和b*/a*升序的排名。

2.4 色差計(jì)參數(shù)、種子顏色與SGR回歸線性 分析

將790份小麥材料的SGR作為因變量，種子顏色(紅粒為1，白粒為2)作為自變量，進(jìn)行逐步回歸分析，回歸方程為Y=-0.467+0.622X，調(diào)整后R2=0.729。將790份小麥材料的SGR作為因變量，以色差計(jì)參數(shù)L*、a*、b*、a*/b*、b*/a*、a*/L*和b*/L*為自變量，進(jìn)行逐步回歸分析，得到方程Y=-13.271+0.893b*/a*+23.376b*/L*-0.410b*+0.196L*，調(diào)整后的R2為 0.725。上述結(jié)果說(shuō)明小麥種子顏色(紅或白)可解釋小麥穗發(fā)芽抗性72.9%的變異，色差計(jì)參數(shù)可解釋小麥穗發(fā)芽抗性72.5%的變異。

將455份紅粒小麥材料的SGR作為因變量，色差計(jì)參數(shù)L*、a*、b*、a*/b*、b*/a*、a*/L*和b*/L*為自變量，進(jìn)行逐步回歸分析，得到方程Y=-42.427+6.951b*/a*-42.702a*/L*+60.194a*/b+19.302b*/L*，調(diào)整后的R2為 0.114，說(shuō)明紅粒小麥中，色差計(jì)參數(shù)可解釋其穗發(fā)芽抗性11.4%的變異。同理，在白粒小麥中進(jìn)行相應(yīng)的逐步回歸分析，得到方程Y= 1.027-0.164a*+2.411b*/L*，調(diào)整后的R2為 0.087，說(shuō)明白粒小麥中，色差計(jì)參數(shù)只能解釋白粒小麥穗發(fā)芽抗性8.7%的變異。

3 討 論

3.1 色差計(jì)法可用于小麥種子顏色定量分析

本研究利用色差計(jì)參數(shù)和小麥種子顏色目測(cè)法結(jié)果構(gòu)建了回歸線性方程，R2達(dá)到了0.9以上，進(jìn)一步利用228份獨(dú)立小麥材料驗(yàn)證分析表明，此方程可靠性較高，說(shuō)明用色差計(jì)參數(shù)可準(zhǔn)確判定小麥種子顏色(紅或白)。色差計(jì)法與目測(cè)法各有優(yōu)缺點(diǎn)：色差計(jì)法可用于小麥種子顏色的定性定量分析，但相對(duì)目測(cè)法感官判斷，稍費(fèi)時(shí)繁瑣；目測(cè)法操作簡(jiǎn)單，但誤差大，不能定量比較種子顏色。因此，在小麥種子顏色分析中，可將色差計(jì)法作為目測(cè)法定性的補(bǔ)充手段，用于種子顏色的定量比較分析。

3.2 種子顏色目測(cè)法和色差計(jì)法對(duì)小麥穗發(fā)芽的鑒定效果

人們?cè)谟N和研究中發(fā)現(xiàn)，紅粒小麥比白粒小麥抗穗發(fā)芽。Zhou等[2]對(duì)717份中國(guó)地方小麥品種進(jìn)行了6個(gè)環(huán)境下的種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，白粒品種的發(fā)芽率顯著高于紅粒品種，發(fā)芽率均值范圍分別為47.2%～79.6%和19.1%～ 56.0%。陳 泠等[4]對(duì)169份白粒小麥和71份紅粒小麥進(jìn)行4個(gè)環(huán)境的整穗發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，結(jié)果也顯示，白粒品種發(fā)芽率均值顯著高于紅粒品種，均值范圍分別為63.30%～78.81%和36.3%～ 71.35%。本研究中，紅粒小麥SGR顯著低于紅粒小麥，這與前人研究結(jié)果一致。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，種子顏色目測(cè)法數(shù)據(jù)、色差計(jì)法參數(shù)值a*/b*和b*/a*與小麥穗發(fā)芽相關(guān)性強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)分別為0.854、-0.831和0.835；其次是a*/L*與小麥穗發(fā)芽的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為-0.735。單獨(dú)分析紅粒小麥和白粒小麥時(shí)，a*/b*和b*/a*與穗發(fā)芽的相關(guān)性也高于a*/L*，因此在分析顏色與穗發(fā)芽抗性關(guān)系時(shí)，可以考慮用色差計(jì)參數(shù)a*/b*和b*/a*。線性回歸分析顯示，種子顏色目測(cè)法數(shù)據(jù)和色差計(jì)參數(shù)可分別解釋小麥穗發(fā)芽抗性72.9%和72.5%的變異。這說(shuō)明小麥種子顏色對(duì)小麥穗發(fā)芽抗性的影響較大。但單獨(dú)分析紅粒小麥或白粒小麥時(shí)，色差計(jì)參數(shù)與穗發(fā)芽抗性相關(guān)性弱，相關(guān)系數(shù)最大為0.244。線性回歸分析表明，色差計(jì)只能分別解釋紅粒和白粒小麥穗發(fā)芽抗性的11.4%和8.7%變異，說(shuō)明在紅粒小麥中或白粒小麥中，顏色對(duì)穗發(fā)芽抗性影響較小，還存在其他影響穗發(fā)芽抗性的因素，如抗性基因或抗性QTLs等[9-13]。

790份小麥材料中，紅粒小麥材料和白粒小麥材料的SGR范圍分別為0～100%和4.33%～99.58%，說(shuō)明紅粒和白粒小麥中都有抗性和感性品種。特別是455份紅粒小麥中，穗發(fā)芽率變異系數(shù)高達(dá)122.36%。因此，必須通過(guò)穗發(fā)芽鑒定實(shí)驗(yàn)確定小麥品種(系)的穗發(fā)芽抗性，而不能僅憑顏色或色差計(jì)數(shù)據(jù)。