乳腺癌超聲造影指標(biāo)與臨床病理及腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性

崇樂(lè)，夏露花，趙亮，李維芝，冷曉玲

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1超聲科，2核醫(yī)學(xué)科，新疆烏魯木齊 830011；3咸陽(yáng)市中心醫(yī)院超聲科，陜西咸陽(yáng)712000

乳腺癌是女性惡性腫瘤的主要致死疾病之一，WHO最新關(guān)于中國(guó)女性癌癥數(shù)據(jù)報(bào)告中顯示乳腺癌年新發(fā)病例逐年增長(zhǎng)［1］，乳腺癌高發(fā)病率對(duì)于其的診斷提出了更高的要求［2］。目前常用于診斷乳腺癌的手段有乳腺X線攝影、CT及MRI，但X線主要用于診斷鈣化性乳腺癌，其為重疊圖像，對(duì)致密性乳腺癌有一定的局限性，且具有一定放射性［3］；CT主要用于評(píng)估乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分期，一般只作為補(bǔ)充檢查［4］；MRI對(duì)于乳腺癌的診斷有較高的敏感性，但其特異性較低，增加了良性病變的活檢率，而且價(jià)格昂貴［5］。近年較多研究發(fā)現(xiàn)超聲造影作為一種新檢查手段，對(duì)于乳腺癌的診斷有很好的效能［6］。超聲造影通過(guò)靜脈注入造影劑，提高乳腺腫瘤與周圍組織回聲對(duì)比，利用不同組織的灌注時(shí)相差異，提高超聲診斷敏感性，在二維超聲的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察乳腺癌腫塊的血流灌注情況及與周邊組織的關(guān)系［7］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤的血流分布與腫瘤周邊的微環(huán)境及相關(guān)因子密切相關(guān)［8］，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（TAF）促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲［9］，是乳腺癌基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成輔助腫瘤生長(zhǎng)的因子，是組成乳腺癌微環(huán)境重要的因子之一［10-11］，但TAF與乳腺癌超聲造影指標(biāo)的關(guān)系目前缺乏充足證據(jù)［12-13］。本研究旨在探索乳腺癌常見(jiàn)臨床病理因子與超聲造影指標(biāo)的關(guān)系，分析二者之間的相關(guān)性，分析臨床病理因子在超聲造影指標(biāo)中的差異性，進(jìn)一步探究TAF在不同區(qū)域的分布特點(diǎn)及其與超聲造影指標(biāo)及臨床病理因子之間的相關(guān)性，從而論證乳腺癌超聲造影指標(biāo)與臨床病理因子及TAF的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2018年1月～2020年6月收入新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理確診為乳腺癌并最終手術(shù)的119例患者，所有患者均有完整的臨床資料、手術(shù)病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床及影像學(xué)懷疑乳腺癌收住入院治療的患者，在超聲造影之前及術(shù)前未行空芯針活檢、放療、化療及內(nèi)分泌治療，手術(shù)治療，需取得完整術(shù)后病理結(jié)果及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，乳腺腫瘤<2個(gè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：造影劑過(guò)敏，造血功能及心肝腎功能不全，其他部位原發(fā)灶，乳腺轉(zhuǎn)移性癌，一側(cè)乳腺的多中心性病變，超過(guò)普通超聲探頭的掃描范圍，且難以保證病灶旁乳腺組織的參照屬性，雙側(cè)乳腺癌，對(duì)于通過(guò)體格檢查及相關(guān)輔助檢查（胸部及腹部CT、骨掃描等）發(fā)現(xiàn)存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的臨床Ⅳ期病例予以排除。119例患者的年齡為28～85歲，其中導(dǎo)管內(nèi)癌6例，浸潤(rùn)型導(dǎo)管癌80例，浸潤(rùn)型小葉癌20例，浸潤(rùn)性癌合并原位癌13例，病灶最大徑0.6～8 cm，平均2.8 cm。納入的患者基本特征（表1）。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審查并同意，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均告知造影可能出現(xiàn)的狀況并簽署造影知情同意書(shū)。

1.2 儀器

檢查儀器采用Aix Plorer型超聲診斷儀（Supersonic Imagine），超聲造影劑采用聲諾維（Bracco）干粉劑，與5.0 mL生理鹽水稀釋震蕩備用［14］。

1.3 超聲造影檢查

患者取平臥位及側(cè)臥位，檢查雙側(cè)乳房及腋窩，觀察病灶，記錄象限、距皮膚及乳頭距離、大小、數(shù)目、回聲特征及血流分布特征［15］。根據(jù)北美放射學(xué)會(huì)制定的乳腺超聲BI-RADS分類標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)乳腺腫塊進(jìn)行BI-RADS分類［16］。再行超聲造影檢查，詢問(wèn)患者詳細(xì)病史，準(zhǔn)備搶救藥物及設(shè)備，簽署造影知情同意書(shū)，選取二維超聲檢查的最可疑的病灶位置，選取病灶得最大切面或病灶血流最豐富的切面，啟動(dòng)超聲造影模式，經(jīng)肘正中靜脈注射造影劑4.8 mL，后注入5.0 mL生理鹽水沖管。觀察造影過(guò)程中，患者體位不變及平靜呼吸，保持探頭穩(wěn)定，并同時(shí)連續(xù)實(shí)時(shí)觀察病灶的動(dòng)態(tài)灌注過(guò)程（3～5 min），且進(jìn)行圖像的存儲(chǔ)［17］。由2位副高以上的超聲醫(yī)生在未知患者臨床資料的前提下閱讀所存儲(chǔ)的圖像，通過(guò)超聲造影顯像分析乳腺腫瘤灌注的血流形態(tài)學(xué)特征［18］。采用QLAB分析軟件，繞過(guò)腫瘤的滋養(yǎng)血管，對(duì)病變邊緣血流顯像最豐富區(qū)域及病灶旁乳腺組織取樣獲得ROI，得到不同區(qū)域時(shí)間強(qiáng)度曲線（TIC）。乳腺癌不同區(qū)域的界定方法如下：在同一深度、同一屏幕的乳腺腺體組織中，采用超聲造影后病灶增強(qiáng)范圍的邊界為活躍邊緣區(qū)域，取樣框采用橢圓形，繞過(guò)滋養(yǎng)血管。取活躍邊緣區(qū)域1 cm處為病灶正常區(qū)域。用美蘭標(biāo)記腫塊的研究切面，在邊緣帶的取樣區(qū)域留下美蘭，并且在研究切面的皮膚層劃線［17,19］（圖1）。

表1 納入119例患者基本特征Tab.1 Basic characteristics of 119 patients included

圖1 超聲造影ROI取樣方法Fig.1 ROI sampling method for contrast-enhanced ultrasound.

1.4 免疫組化檢查

對(duì)TAF進(jìn)行CD34和α-SMA的染色（連續(xù)切片法），結(jié)果CD34/α-SMA+為激活的成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞在光鏡下形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，核細(xì)長(zhǎng)，CD34和α-SMA以間質(zhì)成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性［20-21］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲造影指標(biāo)與臨床病理的關(guān)系

腫塊大小、組織學(xué)分級(jí)及臨床分期與超聲造影指標(biāo)相關(guān)（P<0.05，表2）。

表2 超聲造影指標(biāo)與臨床病理因子的關(guān)系Tab.2 Relationship between CEUS index and clinic-pathological factors

2.2 臨床病理因子在超聲造影指標(biāo)的差異

當(dāng)乳腺癌腫塊>2 cm，組織學(xué)分級(jí)較高，臨床分期早時(shí)，造影后腫塊范圍增大，呈高增強(qiáng)，灌注缺損的概率也高（P<0.05），當(dāng)乳腺癌腫塊>2 cm，造影后呈現(xiàn)穿支血流的概率也高（P<0.05），當(dāng)乳腺癌臨床分期較早時(shí)，造影后腫塊呈現(xiàn)增強(qiáng)邊界不清晰的概率也高（P<0.05，表3）。

2.3 乳腺癌活性邊緣區(qū)域與正常區(qū)域TAF在超聲造影特征中的差異

將乳腺癌活躍的邊緣區(qū)域與病灶旁乳腺正常組織區(qū)域間質(zhì)中的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞認(rèn)定為TAF，用免疫組化標(biāo)記的方法及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定及標(biāo)記，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌造影后病灶的增強(qiáng)范圍在病灶邊緣區(qū)域、癌旁正常區(qū)域的TAF數(shù)量均無(wú)關(guān)聯(lián)（P>0.05），乳腺癌造影后是否出現(xiàn)充盈缺損在邊緣活躍區(qū)域的TAF的分布無(wú)關(guān)聯(lián)，但若出現(xiàn)充盈缺損，癌旁正常區(qū)域的TAF數(shù)量增加（P<0.05）；乳腺癌造影后如果呈高增強(qiáng)，病灶邊緣活躍區(qū)域的TAF數(shù)量較多（P<0.05），但病灶的增強(qiáng)程度與癌旁的正常區(qū)域的TAF數(shù)量無(wú)關(guān)（表4）。

2.4 乳腺癌活性邊緣帶與正常帶TAF在臨床病理指標(biāo)中分布的差異

病灶大小與癌旁正常區(qū)域的TAF的數(shù)量無(wú)關(guān)系（P>0.05），但當(dāng)病灶>2 cm時(shí)，活躍邊緣區(qū)域的TAF的數(shù)量較多（P<0.05）。臨床分期較早時(shí)，邊緣活躍區(qū)域、癌旁正常區(qū)域TAF的數(shù)量較多（P<0.05）。組織學(xué)分級(jí)高，兩個(gè)區(qū)域的TAF數(shù)量均較多（P<0.05，表5）。

2.5 超聲造影與乳腺癌惡性基質(zhì)化區(qū)域性特點(diǎn)的關(guān)系

根據(jù)上述結(jié)果，增強(qiáng)范圍與TAF在2個(gè)不同區(qū)域的分布沒(méi)有關(guān)聯(lián)（P>0.05），但充盈缺損、增強(qiáng)強(qiáng)度與惡性基質(zhì)細(xì)胞在3個(gè)區(qū)域的分布具有關(guān)聯(lián)。造影出現(xiàn)充盈缺損的乳腺癌的癌旁正常區(qū)域TAF數(shù)量較多，呈高增強(qiáng)的乳腺癌邊緣區(qū)域TAF數(shù)量較多，病灶>2 cm，乳腺癌邊緣區(qū)域TAF數(shù)量較多，臨床分期較早時(shí)，癌邊緣區(qū)域TAF較多，組織學(xué)分級(jí)較高時(shí)，兩個(gè)區(qū)域TAF數(shù)量較多（圖2）。

表3 臨床病理因子在超聲造影中的分布差異Tab.3 Distribution difference of prognostic factors in CEUS[n(%)]

表4 乳腺癌活性邊緣帶與正常帶TAF在超聲造影特征中的差異Tab.4 Difference of CEUS characteristics between active marginal band and normal band TAF in breast cancer(Mean±SD)

表5 乳腺癌活性邊緣帶與正常帶TAF在預(yù)后因子分布中的差異Tab.5 Difference of prognostic factor distribution between active marginal band and normal band TAF in breast cancer(Mean±SD)

3 討論

超聲造影是一種無(wú)創(chuàng)性檢查手段，診斷乳腺癌有重要的作用［22-24］。近年研究表明，超聲造影與乳腺癌的臨床病理有一定的關(guān)系［25］，為了進(jìn)一步確定乳腺癌與臨床病理的相關(guān)性，本研究收集119例乳腺癌，研究其相關(guān)性及臨床病理在超聲造影指標(biāo)中的分布差異，這與目前一些研究具有相同的論點(diǎn)［26］。但關(guān)于超聲造影、臨床病理及TAF因子三者之間的相關(guān)性研究還缺乏較明確的證據(jù)［27-28］。

有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌的腫瘤細(xì)胞與周圍間質(zhì)有著復(fù)雜的關(guān)系［17］。TAF就是存在于腫瘤基質(zhì)中被稱之為被“激活”的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞［17,29］，既往國(guó)外研究表明［30-31］，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞是一種“促癌因子”，它能分泌一些生長(zhǎng)因子和蛋白酶類，這些因子利用旁分泌途徑作用于癌細(xì)胞和基質(zhì)，加速癌細(xì)胞增殖，改變基質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，從而加強(qiáng)腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移［32］。分析乳腺癌超聲造影指標(biāo)、臨床病理因子與其的關(guān)系能更加清晰評(píng)估超聲造影在腫瘤預(yù)后中的價(jià)值。

圖2 超聲造影后呈高增強(qiáng)的乳腺癌TAF細(xì)胞分布的區(qū)域性特點(diǎn)Fig.2 Regional characteristics of the distribution of breast cancer TAF cells with high enhancement after CEUS

本研究顯示，增強(qiáng)范圍在病灶活躍邊緣帶與正常帶的TAF分布均無(wú)關(guān)聯(lián)，即無(wú)論造影后乳腺癌病灶范圍是否大于二維超聲顯示的范圍，TAF在兩個(gè)區(qū)域的分布均沒(méi)有差異。增強(qiáng)范圍對(duì)乳腺疾病良惡病灶有較高的診斷效能，TAF數(shù)量與增強(qiáng)范圍的擴(kuò)大無(wú)關(guān)，這表明增強(qiáng)范圍擴(kuò)大的因素并是唯一相關(guān)，進(jìn)一步推測(cè)可能與乳腺癌的周圍組織浸潤(rùn)有關(guān)，存在一定的局限性。本研究顯示乳腺癌造影呈充盈缺損，病灶活躍邊緣區(qū)域的TAF數(shù)量多，造影呈充盈缺損提示乳腺癌病灶內(nèi)微血管分布密集，則充盈缺損是與乳腺癌預(yù)后有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)的造影指標(biāo)，因此充盈缺損時(shí)TAF的分布特點(diǎn)說(shuō)明TAF與腫瘤微血管具有相關(guān)性。造影后呈高增強(qiáng)，病灶邊緣活躍區(qū)域的TAF數(shù)量多，進(jìn)一步驗(yàn)證了TAF的分布與乳腺癌微血管密度的關(guān)系。本研究提示TAF數(shù)量與充盈缺損及增強(qiáng)程度的關(guān)聯(lián)表明，TAF數(shù)量分布于微血管密集的病灶。TAF在邊緣活躍區(qū)域的數(shù)量與腫瘤大小存在正增長(zhǎng)，乳腺癌越大，邊緣區(qū)域的TAF數(shù)量越多，且TAF數(shù)量與臨床分期、組織學(xué)分級(jí)在乳腺癌各個(gè)區(qū)域均存在關(guān)系，表明TAF細(xì)胞的分布具有很強(qiáng)的評(píng)估預(yù)后的能力，也提示TAF是乳腺癌預(yù)后不良的因素。

本研究也發(fā)現(xiàn)乳腺癌邊緣活躍區(qū)域與癌旁正常區(qū)域的超聲造影特征與TAF的關(guān)聯(lián)并不一致，也研究了TAF數(shù)量與臨床病理因子的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TAF的數(shù)量在正常區(qū)域中與腫瘤大小無(wú)關(guān)系，但與臨床分級(jí)及組織學(xué)分級(jí)具有明顯的關(guān)聯(lián)，結(jié)果說(shuō)明在組織分化程度差，轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的乳腺癌中，TAF存在數(shù)量更多，TAF在一定程度上反映腫瘤的分化和轉(zhuǎn)移能力，因此TAF細(xì)胞是乳腺癌惡性基質(zhì)化體現(xiàn)。通過(guò)乳腺癌超聲造影、臨床病理指標(biāo)及TAF三者之間的關(guān)系進(jìn)行研究證明，TAF是乳腺癌的侵襲性相關(guān)的因素，且超聲造影對(duì)于乳腺癌的診斷及預(yù)后的評(píng)估能力具有重要意義［33］。