外周血Th17與Treg細(xì)胞失衡與兒童EB病毒感染的相關(guān)性*

周洋 陳芳芳 王桂蘭 齊曦明 康厚鑫 吳小波

(秦皇島市第一醫(yī)院 1.兒科一病區(qū);2.中心實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066000)

Epstein-Barr病毒，簡稱EB病毒(EBV)，是目前兒科臨床最常見的感染性疾病之一，主要通過唾液、輸血、器官移植等進(jìn)行傳播，是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的主要病毒，其感染的普遍性及感染后終生潛伏而不能被機(jī)體免疫系統(tǒng)徹底清除[1-2]。兒童中非腫瘤性EBV感染疾病主要包括傳染性單核細(xì)胞增多(IM)、慢性活動(dòng)性EBV感染(CAEBV)、EBV相關(guān)噬血淋巴組織細(xì)胞增生癥(EBV-HLH)，后兩種疾病是較為嚴(yán)重的EBV感染相關(guān)疾病，預(yù)后不良，病死率高[3]。但目前我國兒童EBV的流行病學(xué)、并發(fā)癥、臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查特征、機(jī)體對EBV的細(xì)胞免疫和體液免疫特點(diǎn)等缺乏系統(tǒng)性研究，而且對EBV相關(guān)疾病及重癥EBV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷、免疫學(xué)研究及相關(guān)治療報(bào)道較少。輔助性T細(xì)胞(T helper cell 17,Th17)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)是近年免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)[4-5]。有研究表明，其平衡機(jī)制及其相關(guān)因子白介素17(interleukin 17,IL-17)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factorbeta 1,TGF-β1)的變化，在機(jī)體促進(jìn)清除胞外病原體的入侵和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[6]。為了進(jìn)一步探索Th17、Treg細(xì)胞在EBV兒童中表達(dá)的機(jī)制，本研究檢測EBV患兒、健康兒童外周血T淋巴細(xì)胞中Th17、Treg細(xì)胞、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)率及其相關(guān)特征性細(xì)胞因子(IL-17、TGF-β1)的水平變化，旨在從分子學(xué)水平對EBV的臨床診斷與治療提供進(jìn)一步的免疫學(xué)支持，為兒童EBV的預(yù)防及疫苗的開發(fā)提供新的思路與方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年12月～2020年5月秦皇島市第一醫(yī)院兒科收治的EBV感染患兒58例(經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查，EB病毒DNA、 EB病毒抗體檢測陽性的患兒，診斷為EBV感染)為EBV感染組。另選擇同期本院健康體檢兒童50例為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有EBV感染患兒診斷均符合胡亞美等編著的《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》[7]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。②年齡 6個(gè)月～14歲。③均為首發(fā)EBV感染患兒。④患兒均處于亞急性感染階段。⑤患兒及家長知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①特殊遺傳代謝性疾病者。②血液系統(tǒng)疾病者。③自身免疫性疾病者。④寄生蟲感染性疾病者。⑤腫瘤疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2 方法 EBV感染組于入院48 h內(nèi)、對照組于健康體檢時(shí)采集空腹靜脈血6 mL，肝素抗凝，3500 r/min 5 min離心，留取上層血清，采用FACS流式細(xì)胞儀檢測外周血Th17、Treg細(xì)胞；采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，以RORγt mRNA、Foxp3 mRNA特異性引物在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈連鎖反應(yīng)(RT-PCR)，反應(yīng)條件25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，4 ℃長時(shí)間保存。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳成像系統(tǒng)掃描，與內(nèi)參照的條帶灰度值比值作為標(biāo)準(zhǔn)定量分析，計(jì)算待測樣本目的基因的相對表達(dá)水平；采用ELISA抗體雙夾心法檢測細(xì)胞相關(guān)特征性細(xì)胞因子IL-17、TGF-β1水平，嚴(yán)格按照說明書操作進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，行2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBV感染組和對照組一般資料比較 EBV感染組和對照組性別、年齡一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 EBV感染組和對照組外周血Th17、Treg細(xì)胞表達(dá)率比較 EBV感染組患兒外周血Th17細(xì)胞表達(dá)率明顯高于對照組，Treg細(xì)胞表達(dá)率和Treg/Th17細(xì)胞比率明顯低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 EBV感染組和對照組外周血Th17、Treg細(xì)胞表達(dá)率比較

2.3 EBV感染組和對照組轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)率比較 EBV感染組患兒RORγt mRNA表達(dá)率明顯高于對照組，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)率明顯低于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 EBV感染組和對照組轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)率比較

2.4 EBV感染組和對照組細(xì)胞相關(guān)特征性細(xì)胞因子水平比較 EBV感染組患兒IL-17水平明顯高于對照組，TGF-β1水平明顯低于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 EBV感染組和對照組細(xì)胞相關(guān)特征性細(xì)胞因子水平比較

3 討論

EBV于1964年由Epstein、Barr等首次在非洲兒童惡性淋巴瘤(伯基特淋巴瘤)組織培養(yǎng)中被發(fā)現(xiàn)，屬于皰疹病毒γ亞科，為雙鏈DNA病毒[8]。EBV感染世界各地均有發(fā)生，多呈散發(fā)，也可引起小范圍流行，四季均可發(fā)病，患者和EBV攜帶者為傳染源，病毒大量存在于唾液腺及唾液中，可持續(xù)或間斷排毒數(shù)周、數(shù)月甚至數(shù)年，經(jīng)EBV原發(fā)感染后，大多數(shù)患者無臨床癥狀，尤其是6歲以下幼兒多表現(xiàn)為隱性或輕型發(fā)病，但在兒童期、青春期和青年期，約50%的原發(fā)性感染者均表現(xiàn)為傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)[9-10]。血清流行病學(xué)調(diào)查顯示EBV在人群中的感染率超過95%[11]，發(fā)展中國家2歲以下兒童EBV血清陽性轉(zhuǎn)化率可達(dá)95%以上，EBV作為臨床主要的致腫瘤病毒，其感染的普遍性及感染后終生潛伏而不能被機(jī)體免疫系統(tǒng)徹底清除，故被稱為“無處不在的成功病毒”[12-13]。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)了表現(xiàn)為慢性疲勞綜合征的慢性EBV感染，淋巴組織異常增殖可能為淋巴瘤的前期表現(xiàn)[14]。近年有研究顯示EBV感染患兒體內(nèi)存在體液免疫紊亂、T淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)及細(xì)胞因子分泌異常等多種免疫功能失衡，且這一現(xiàn)象與其病理和臨床表現(xiàn)有關(guān)[15-16]。

Th17、Treg細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞新亞型，研究表明，初始的CD4+T細(xì)胞在不同細(xì)胞因子的作用下，可以向不同的方向分化[17]。大量研究表明，Th17、Treg細(xì)胞不同于Th1和Th2細(xì)胞。根據(jù)人胸腺、扁桃體、淋巴結(jié)和外周血中對Th17、Treg細(xì)胞的檢測，證實(shí)Th17細(xì)胞可通過特征性分泌IL-17誘導(dǎo)粒細(xì)胞集落刺激因子、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、前列腺素E2及其他一些炎癥因子的表達(dá)產(chǎn)生強(qiáng)烈的致炎效應(yīng)，參與各種自身免疫病、器官移植排斥反應(yīng)和寄生蟲感染等多種疾病的促炎癥反應(yīng)[18-19]。而Treg細(xì)胞是通過表面膜分子Foxp3，與其他細(xì)胞直接接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子IL-17和TGF-β1等方式，來抑制體內(nèi)的CD4+T細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的活化和增殖[20]。有研究表明，其平衡機(jī)制及其相關(guān)因子(Th17、TGF-β)的變化，在機(jī)體促進(jìn)清除胞外病原體的入侵和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[21]。Th17與Treg細(xì)胞失衡與自身免疫性疾病、腫瘤、抑制免疫和寄生蟲感染性疾病的免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[22]，但本研究納入對象中排除了上述疾病患者，可較好的避免其他因素的感染，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EBV感染組患兒外周血Th17細(xì)胞表達(dá)率明顯高于對照組，Treg細(xì)胞表達(dá)率和Treg/Th17細(xì)胞比率明顯低于對照組，與國外Humblet-Baron S[23]等人研究相一致，但與之相比較，本研究還進(jìn)一步深入分析了EBV感染患兒mRNA相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況，結(jié)果顯示EBV感染組患兒RORγt mRNA表達(dá)率明顯高于對照組，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)率明顯低于對照組，提示調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞減少并由此引發(fā)的免疫抑制效應(yīng)不足可能是EBV感染患兒免疫失衡的重要原因[24-25]，這也是本研究的創(chuàng)新點(diǎn)，但目前關(guān)于其具體機(jī)制研究報(bào)道較少，故仍有待于進(jìn)一步研究。Th17和TGF-β是兩種誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子[26-27]，本研究EBV感染組患兒IL-17水平明顯高于對照組，TGF-β1水平明顯低于對照組，提示EBV感染患兒Th17細(xì)胞過度活化及Treg細(xì)胞表達(dá)不足可能與感染誘導(dǎo)的IL-17高表達(dá)及Treg/Th17失衡有關(guān)。

4 結(jié)論與啟示

EBV感染患兒外周血中Th17細(xì)胞及其調(diào)控因子IL-17水平增高，Treg細(xì)胞及其調(diào)控因子TGF-β1水平降低，從細(xì)胞和細(xì)胞調(diào)控因子水平證實(shí)EBV感染患兒體內(nèi)存在Treg/Th17失衡。本研究仍存在不足之處，納入對象均為亞急性感染階段，未對EBV感染后不同階段進(jìn)行比較研究，可能會(huì)對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，且其具體機(jī)制及能否通過臨床介導(dǎo)調(diào)控因子的表達(dá)控制患兒的免疫炎癥反應(yīng)還需更多研究探討。