缺血缺氧性腦病新生兒microRNA-21表達(dá)及臨床價(jià)值

卞偉妮，吳新婷

（西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，陜西 西安710038）

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是圍生期新生兒發(fā)生窒息后產(chǎn)生的嚴(yán)重并發(fā)癥，可造成新生兒神經(jīng)系統(tǒng)腦水腫和腦壞死[1]。臨床研究顯示，約50%的腦癱患兒是由HIE 引起的。引發(fā)HIE 原因較多，如母體妊娠高血壓、胎盤異常、胎盤早剝、胎兒發(fā)育遲緩、臍帶脫落、分娩中出現(xiàn)臍帶繞頸和打結(jié)等[2]。因此，發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標(biāo)志物用于早期診斷HIE及預(yù)測(cè)HIE 的預(yù)后顯得尤為重要[3-4]。

MicroRNA 是一條具有20～25 個(gè)核苷酸序列的內(nèi)源性非編碼RNA，廣泛參與到器官發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡，腫瘤發(fā)生及代謝等各種生理病理過(guò)程[5-7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)血清microRNA-21（miR-21）在HIE 患兒和正常新生兒之間的表達(dá)差異，以及與腦功能評(píng)分（NBNA）的關(guān)系，以探究miR-21 在HIE 診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年3月—2019年6月西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院新生兒HIE 患兒56 例（HIE 組）。其中，男性31 例，女性25 例；剖宮產(chǎn)20 例，順產(chǎn)36 例；胎齡38～40 周，平均（39.1±0.8）周；出生體重2 750～4 100 g，平均（3 219.7±251.6）g。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合世界衛(wèi)生組織制定的新生兒缺氧缺血性腦病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；母體妊娠期間無(wú)其他并發(fā)癥；出生體重2 630～4 000 g；胎齡37～42 周。排除標(biāo)準(zhǔn)：先天性病變引發(fā)的腦損傷者；伴有顱內(nèi)出血、宮內(nèi)窘迫因素引發(fā)的感染和抽搐；對(duì)本研究結(jié)果會(huì)產(chǎn)生影響的感染性病變、肝腎功能障礙者。同時(shí)選取健康新生兒60 例為對(duì)照組。其中男性28 例，女性32 例；剖宮產(chǎn)22 例，順產(chǎn)38 例；胎齡38～40 周，平均（39.0±0.6）周；出生體重2 600～4 215 g，平均（3 180±247.2）g。

1.2 研究對(duì)象血液樣本采集

HIE 組在出生后24 h（急性期）、7 d（恢復(fù)期）分別采集2 ml 股靜脈血；對(duì)照組于出生后24 h采集2 ml 股靜脈血。血液樣品于常溫下放置1 h 后3 000 r/min 離心20 min，取上層1 ml 血清至EP 管中，于-80℃冰箱冷凍保存。

1.3 試劑

RNAsimple 總RNA 提取試劑盒（DP419）購(gòu)自天根（北京）生物科技有限公司，PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列信息見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。實(shí)時(shí)定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Red 公司。置入-80℃冰箱冷凍保存（購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司）。

表1 引物序列

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA的表達(dá)

通過(guò)總RNA 提取試劑盒提取血液樣本中的總RNA，進(jìn)行擦除DNA 和逆轉(zhuǎn)錄操作，得到cDNA 用于逆轉(zhuǎn)錄，按照PCR 試劑盒說(shuō)明書配制逆轉(zhuǎn)錄體系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采取二步法，條件如下：95℃預(yù)變性30 s；PCR 反應(yīng)，95℃預(yù)變性5 s，60℃變性30 s。共循環(huán)40 次。通過(guò)2-ΔΔCt法檢測(cè)miR-21的表達(dá)水平。

1.5 新生兒神經(jīng)行為測(cè)定

出生后30 d 對(duì)兩組新生兒進(jìn)行新生兒神經(jīng)行為測(cè)定（neurobehavioral measurement in neonates,NBNA）[9]，包括27 項(xiàng)行為能力和20 項(xiàng)神經(jīng)反射，總分40 分，評(píng)分越高表明新生兒神經(jīng)功能越好。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法，繪制ROC 曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

兩組性別構(gòu)成、生產(chǎn)方式、體重、胎齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組一般情況的比較

2.2 兩組血清miR-21表達(dá)水平的比較

在HIE 發(fā)生的急性期（出生后24 h），HIE 組患兒血清miR-21 表達(dá)水平與對(duì)照組新生兒比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.470，P=0.000），HIE 組患兒血清miR-21 表達(dá)水平（1.857±0.136）高于對(duì)照組新生兒（0.826±0.127）。見(jiàn)圖1。

圖1 血清miR-21表達(dá)水平的比較

2.3 急性期miR-21表達(dá)的診斷學(xué)意義

通過(guò)繪制miR-21在兩組血清中表達(dá)水平的ROC曲線，評(píng)價(jià)miR-21 對(duì)新生兒HIE 的診斷效能。ROC曲線下面積以0.5作為參考界值，miR-21表達(dá)水平對(duì)HIE 預(yù)測(cè)的ROC曲線下面積為0.758 （95% CI：67.32，85.78）。結(jié)果提示，血清miR-21 的表達(dá)水平對(duì)診斷新生兒HIE具有較高的診斷價(jià)值。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-21診斷新生兒HIE的ROC曲線

2.4 恢復(fù)期miR-21表達(dá)水平與NBNA的相關(guān)性分析

新生兒HIE患兒治療7 d時(shí)miR-21血清表達(dá)水平與恢復(fù)30 d 時(shí)NBNA 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.746，P=0.000）。見(jiàn)圖3。

圖3 恢復(fù)期miR-21與NBNA評(píng)分的相關(guān)性

3 討論

近年來(lái)隨著居民生活水平的提高，產(chǎn)前和新生兒護(hù)理?xiàng)l件得到顯著改善。但HIE 仍然是全世界新生兒發(fā)病和死亡的重要原因[10]。新生兒HIE 并非罕見(jiàn)病，在新生兒中的發(fā)病率約為2‰～3‰。在一些發(fā)展中國(guó)家，其發(fā)生頻率甚至可上升到26‰。這些HIE 患兒中約24%在急性期死亡；其余存活的新生兒中，也會(huì)伴隨腦癱（10%～20%），視覺(jué)和聽(tīng)覺(jué)障礙（約40%）以及運(yùn)動(dòng)和行為損害，例如癲癇，整體發(fā)育遲緩和自閉癥等后遺癥[11-12]。HIE 對(duì)社會(huì)和家庭帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，現(xiàn)在已有大量的研究聚焦HIE 的診斷、干預(yù)和治療。

HIE 可以發(fā)生于產(chǎn)前，圍生期或產(chǎn)后等各個(gè)時(shí)期，呈急性或慢性發(fā)展[13]。在損傷的潛伏期（1～6 h），發(fā)生氧化代謝、炎癥和凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活。HIE損傷后6～48 h，發(fā)生高能磷酸化合物的消耗以及興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和自由基的釋放[14-15]。在急性缺血長(zhǎng)達(dá)1 個(gè)月后，發(fā)生晚期細(xì)胞死亡，受傷的大腦重塑和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生[16-18]。HIE 的基本病理過(guò)程包括：線粒體損傷、自由基生成、一氧化氮合成酶（NOS）的激活、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

MicroRNA（miRNA）是由基因組內(nèi)的短反向重復(fù)編碼的約22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源非編碼單鏈RNA[19]。第一個(gè)miRNA，lin-4，于1993年在線蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)。脊椎動(dòng)物中miRNA 的存在于2001年得到證實(shí)。目前，已有超過(guò)800 種miRNA 在人類中被克隆和測(cè)序，并且人類基因組中miRNA 基因的估計(jì)數(shù)量高達(dá)1 000。miR-21 由單個(gè)基因編碼，在各種脊椎動(dòng)物物種中表現(xiàn)出強(qiáng)大的進(jìn)化保守性[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-21 在新生兒HIE 急性期大量表達(dá)，可作為新生兒HIE 的早期標(biāo)志物，為HIE的診斷提供新的生物學(xué)標(biāo)志物。而在HIE 恢復(fù)期，給予常規(guī)治療的HIE 患兒，發(fā)病后7 d 的miR-21 表達(dá)水平與發(fā)病30 d 后NBNA 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明恢復(fù)早期miR-21 水平對(duì)HIE 患兒后期神經(jīng)功能恢復(fù)具有預(yù)測(cè)作用，為HIE 的后期康復(fù)治療提供重要依據(jù)。miR-21 的生物學(xué)作用在腫瘤研究中得到了很好的證實(shí)。實(shí)際上，已發(fā)現(xiàn)miR-21 在多種腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，同時(shí)miR-21 可作為胰腺癌、結(jié)腸癌等多種癌癥的生物學(xué)標(biāo)志物。在免疫系統(tǒng)，miR-21可通過(guò)介導(dǎo)Th17 細(xì)胞分化參與多種自身免疫性疾病的發(fā)展[20-22]。在循環(huán)系統(tǒng)中，miR-21 通過(guò)腎素-血管緊張素系統(tǒng)、炎癥因子激活和內(nèi)皮功能障礙參與高血壓的發(fā)病和靶器官的損傷[23]。而miR-21 在HIE 患兒疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的作用可能包括以下幾個(gè)方面：①miR-21 通過(guò)直接作用于PDCD4 分子調(diào)節(jié)免疫功能，降低IL-6 水平，升高IL-10 水平[24-25]，并可以調(diào)節(jié)Smad7 分子通過(guò)Th17 細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫功能[26-27]；②miR-21 通過(guò)PTEN-Akt 信號(hào)通路作用于Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax 等分子，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡；③miR-21 通過(guò)PDCD4 分子和PTEN-Akt 信號(hào)通路抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，表性變化和病理性肥大。

綜上所述，本研究通過(guò)觀察新生兒HIE 患兒血清miR-21 表達(dá)水平和NBNA 評(píng)分，發(fā)現(xiàn)miR-21 表達(dá)水平在HIE發(fā)病早期上升，并且在恢復(fù)期miR-21水平與NBNA 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。miR-21 對(duì)HIE 具有早期診斷意義，miR-21 對(duì)HIE 的病情進(jìn)展具有早期預(yù)測(cè)效果，為HIE 的早期診斷和病情進(jìn)展提供新的依據(jù)和生物學(xué)標(biāo)志物。