小白菊內(nèi)酯對腦缺血大鼠的腦保護作用及機制

喬會敏 陳林玉 杜媛媛 吳冰潔 董梅 張祥建

在急性腦卒中中，氧化應(yīng)激和炎癥在神經(jīng)功能缺損中起重要作用。小白菊內(nèi)酯是甘菊(tanacetum parthenium)中發(fā)現(xiàn)的主要倍半萜內(nèi)酯，具有廣泛的藥理和生物活性，包括抗炎和抗氧化等[1,2]。重要的是，其親脂性有利于良好的血腦屏障(BBB)通透性[3]。小白菊內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)明確。已被廣泛用于多種炎癥性疾病的治療，包括發(fā)熱和偏頭痛，不良反應(yīng)很少[4,5]。近期研究表明小白菊內(nèi)酯對心臟缺血再灌注損傷有保護作用[6]。然而，小白菊內(nèi)酯對腦梗死是否具有腦保護作用，其機制如何，研究較少。因此，本研究通過腦缺血模型，觀察小白菊內(nèi)酯的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 采用健康成年清潔級雄性SD大鼠72只[購自北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(京2016-0006)]，體重230～289 g。分為假手術(shù)組(sham+0.05% Tween80)，溶劑對照組(MCAO+0.05% Tween80)和小白菊內(nèi)酯組(MCAO+小白菊內(nèi)酯 500 μg/kg，含0.05% Tween80)。

1.2 藥品與試劑 小白菊內(nèi)酯(美國 Santa Cruz 公司)，兔抗TLR4多克隆抗體(1∶500，美國 Santa Cruz 公司)，兔抗 NF-κB 多克隆抗體(1∶300美國 Santa Cruz)，兔抗GAPDH 多克隆抗體(1∶500，北京中山生物技術(shù)有限公司)，兔抗Claudin-5多克隆抗體(1∶150，美國 Santa Cruz 公司)， SOD，CAT，MDA測定試劑盒(中國南京建成公司)。

1.3 動物模型 (1)溶劑對照組:參照Longa等[7]線栓法改良后制備大鼠右側(cè)大腦中動脈閉塞模型(MCAO)。腹腔注射0.05% Tween80。(2)假手術(shù)組:除不插線栓外，其余同溶劑對照組。(3)小白菊內(nèi)酯組:制備腦缺血模型后即刻腹腔注射小白菊內(nèi)酯500 μg/kg。

1.4 實驗方法

1.4.1 神經(jīng)功能缺損評分:采用Longa等[7]的6級5分法。

1.4.2 腦組織含水量測定:采用干濕法[8]在腦缺后24 h測定腦組織含水量。

1.4.3 腦梗死體積測定:將腦組織切成切片(3 mm厚)，37℃2% TTC染色20 min,4%多聚甲醛固定。TTC染色切片拍照。計算：梗死體積百分比=(矯正梗死體積/非缺血側(cè)半球體積)×100%。

1.4.4 Western-blot:取梗死側(cè)皮層腦組織，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，再用BCA試劑盒測蛋白濃度，制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜。加入一抗，TLR4、NF-κB、Claudin-5多克隆抗體。過夜后加二抗，以 GAPDH 的做為內(nèi)參，各指標(biāo)與GAPDH的比值代表蛋白相對表達水平。最后掃膜并采集圖像。

1.4.5 實時定量PCR:取梗死側(cè)皮層腦組織，立即加入液氮，再放入-80℃冰箱，按照說明書，使用Trizol試劑從冰凍缺血缺血腦組織提取總RNA。然后用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后采用實時熒光定量 PCR 檢測Claudin-5，NF-κB，TLR4和 mRNA 表達，以GADPH作為內(nèi)參基因，與對照組相比，得到目的基因表達的CT值，進行數(shù)據(jù)相對定量分析(n=6)。見表1。

表1 引物如下

2 結(jié)果

2.1 小白菊內(nèi)酯的腦保護作用

2.1.1 小白菊內(nèi)酯對腦水腫的作用:患側(cè)腦組織含水量結(jié)果顯示，溶劑對照組(86.53±1.37)%明顯高于假手術(shù)組(78.16±1.55)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；小白菊內(nèi)酯組(81.06±1.12)%明顯低于溶劑對照組(86.53±1.37)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.1.2 小白菊內(nèi)酯對神經(jīng)功能缺損評分的作用:神經(jīng)功能缺損評分顯示，假手術(shù)組神經(jīng)功能評分均為0分，未見神經(jīng)功能缺損，小白菊內(nèi)酯組神經(jīng)功能缺損評分(1.8±0.25)分,明顯低于溶劑對照組(3.3±0.3)分(P<0.05)。

2.1.3 小白菊內(nèi)酯對腦梗死體積的作用:TTC染色后，梗死體積顯示，假手術(shù)組未見梗死灶，小白菊內(nèi)酯組梗死體積(32.36%±6.9%),明顯低于溶劑對照組(44.87%±4.6%)(P<0.05 ) 。

2.1.4 小白菊內(nèi)酯對Claudin-5基因表達的影響：與溶劑對照組比較，小白菊內(nèi)酯組Claudin-5的基因表達明顯高于溶劑對照組(P<0.05)。見表2。

2.1.5 小白菊內(nèi)酯對Claudin-5蛋白表達的影響：與溶劑對照組比較，小白菊內(nèi)酯組Claudin-5的基因表達明顯高于溶劑對照組(P<0.05)。見表2。

表2 Claudin-5的基因及蛋白表達水平

2.2 小白菊內(nèi)酯對腦梗死的抗氧化作用

2.2.1 小白菊內(nèi)酯對腦梗死大鼠SOD活性的影響:SOD活性結(jié)果顯示，溶劑對照組(66.79±2.527)U/mg明顯低于假手術(shù)組(123.22±3.956)U/mg(P<0.05)；小白菊內(nèi)酯組(102.36±5.331)U/mg明顯高于溶劑對照組(66.79±2.527)U/mg(P<0.05)。見表3。

2.2.2 小白菊內(nèi)酯對腦梗死大鼠CAT活性的影響:溶劑對照組(1.621±0.097)U/mg明顯低于假手術(shù)組(2.733±0.126)U/mg(P<0.05)；小白菊內(nèi)酯組(2.372±0.155)U/mg明顯高于溶劑對照組(1.621±0.097)U/mg(P<0.05)。見表3。

2.2.3 小白菊內(nèi)酯對腦梗死大鼠MDA水平的影響:溶劑對照組(4.799±0.208)nmol/mg明顯高于假手術(shù)組(2.057±0.109)nmol/mg(P<0.05)；小白菊內(nèi)酯組(2.906±0.137)nmol/mg明顯低于溶劑對照組(P<0.05)。見表3。

表3 3組SOD、CAT、MDA活性比較

2.3 小白菊內(nèi)酯對腦梗死的抗炎作用

2.3.1 小白菊內(nèi)酯對TLR4和NF-κB基因表達的影響：與溶劑對照組比較，小白菊內(nèi)酯組TLR4基因表達明顯低于溶劑對照組(P<0.05)；小白菊內(nèi)酯組NF-κB基因表達明顯低于溶劑對照組(P<0.05)。見表4。

表4 TLR4和NF-κB的基因表達水平

2.3.2 小白菊內(nèi)酯對TLR4和NF-κB蛋白表達的影響：與溶劑對照組比較，小白菊內(nèi)酯組TLR4蛋白表達明顯低于溶劑對照組(P<0.05)；小白菊內(nèi)酯組TLR4蛋白表達明顯低于溶劑對照組(P<0.05)。見表5。

表5 TLR4和NF-κB的蛋白表達水平

3 討論

SOD是一種重要的自由基清除劑，能特異地將超氧自由基解毒給過氧化氫，保護機體免受自由基的侵害。SOD1作為SOD家族的重要成員之一，可在缺血后急性期減少神經(jīng)元丟失，減少梗死面積[9,10]。在生理條件下，受內(nèi)源性抗氧化劑如SOD、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽和CAT的控制，ROS的生成水平較低[11,12]。SOD通過滅活氧自由基保護人體免受過氧化和組織損傷。CAT是一種常見的酶，幾乎存在于所有暴露在氧氣中的生物體內(nèi)，是所有酶中周轉(zhuǎn)次數(shù)最高的酶之一[13]。過氧化氫可能轉(zhuǎn)化為其他自由基，而谷胱甘肽過氧化物酶可以消除過氧化氫[14]。MDA是脂質(zhì)過氧化的一種有毒終產(chǎn)物，是典型的氧化應(yīng)激標(biāo)志物之一。其表達水平可直接反映脂質(zhì)過氧化的速率和程度，間接反映清除自由基的能力。線粒體在功能失常的情況下產(chǎn)生更多的活性氧簇(ROS)，ROS介導(dǎo)的線粒體氧化損傷有助于更多ROS的產(chǎn)生[15,16]。因此減少MDA的表達可以減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]。本研究中，大鼠腦缺血后24 h，小白菊內(nèi)酯治療組SOD及CAT活性明顯升高，MDA水平明顯降低，說明小白菊內(nèi)酯在腦缺血后起到抗氧化作用。

Toll樣受體(TLRs)可以識別受傷或壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性危險信號，并促進炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的啟動[18]。各種證據(jù)證實Toll樣受體4(TLR4)參與缺血后的炎性反應(yīng)[19-21]，到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有11個人類和13個小鼠TLR[22]。TLR4在細(xì)胞內(nèi)信號通路均通過MyD88-TRAF6通路。髓樣分化因子88(MyD88)招募啟動白細(xì)胞介素1受體關(guān)聯(lián)激酶4(IRAK4)的激活和白細(xì)胞介素1受體關(guān)聯(lián)激酶1(IRAK1)磷酸化，導(dǎo)致TNF受體關(guān)聯(lián)因子6(TRAF6)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)激活激酶1 (TAK1)。這些事件在絲裂原激活蛋白激酶p38和核因子-κB(NF-κB)的激活中達到高潮，這兩者對于激活誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的表達是必需的，包括趨化因子和細(xì)胞因子[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血24 h后，TLR4表達上調(diào)，而小白菊內(nèi)酯明顯降低了這些因子的表達。

眾所周知，TLR-MyD88關(guān)聯(lián)激活NF-κB級聯(lián)反應(yīng)，這兩者對激活誘導(dǎo)的炎性介質(zhì)的表達都是至關(guān)重要的[26]?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，TLR4缺乏小鼠對缺血性腦損傷有保護作用。NF-κB在炎性反應(yīng)和細(xì)胞生存中扮演重要角色，它可以控制大量的基因比如編碼細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素1α(IL-1α)，白細(xì)胞介素6(IL-6)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)等)，以及死亡和生存的蛋白質(zhì)B淋巴細(xì)胞瘤2基因(Bcl-2)、p53、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)]、細(xì)胞間粘附分子(ICAM)cyclooxygenase-2 (cox-2)和誘導(dǎo)一氧化氮合酶[27]。NF-κB作為死亡和存活蛋白的調(diào)節(jié)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的存活中發(fā)揮著雙重作用，這取決于缺血性損傷的性質(zhì)(永久性或短暫性、持續(xù)時間和缺血再灌注的嚴(yán)重程度)[28]，NF-κB的短暫激活有助于缺血損傷后神經(jīng)元的存活，NF-κB的持續(xù)激活使神經(jīng)元易受缺血損傷。而在本研究中，小白菊內(nèi)酯能抑制TLR4及NF-κB的表達，說明小白菊內(nèi)酯在腦缺血中發(fā)揮了抗炎癥作用。

小白菊內(nèi)酯作為一種抗氧化劑和抗炎劑，在多種疾病中發(fā)揮著重要的保護作用。已經(jīng)證明，小白菊內(nèi)酯可以抑制促炎細(xì)胞因子，例如在體外研究中，降低TNF-α，環(huán)氧合酶2(cox-2)， 單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的表達[29,30]。小白菊內(nèi)酯還可以減輕心血管損傷，延緩動脈粥樣 硬化病變，對心肌缺血有有益作用[31]。小白菊內(nèi)酯通過抑制過氧化氫，升高SOD的表達減輕成骨細(xì)胞凋亡[32]。此外，近期研究表明小白菊內(nèi)酯還可以作為NF-κB的天然抑制劑，對抗腫瘤[33]。因此我們推測，小白菊內(nèi)酯可能通過調(diào)節(jié)SOD、CAT、MDA、TLR4和NF-κB的表達保護腦缺血損傷。

BBB將中樞神經(jīng)系統(tǒng)的循環(huán)血液與腦脊液分離，并且BBB的通透性較低[34]。腦損傷后BBB的破壞會導(dǎo)致血管源性腦水腫的發(fā)生，這是腦梗死后最嚴(yán)重的并發(fā)癥[35]。所以保護BBB也是治療腦梗死的關(guān)鍵步驟。緊密連接發(fā)育良好，在血腦屏障的形成中起著核心作用[36]。緊密連接蛋白5(Claudin-5)是腦內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的主要細(xì)胞黏附分子，在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障特性的出現(xiàn)中起關(guān)鍵作用。已有研究證明，僅破壞claudin-5就足以引起B(yǎng)BB的功能改變[37]。通過降解claudin-5可以打開BBB，增加BBB的通透性[38]。鑒于claudin-5在調(diào)節(jié)BBB通透性和維持腦血管內(nèi)皮細(xì)胞血腦屏障完整性方面的基礎(chǔ)作用，我們評估小白菊內(nèi)酯是否對claudin-5有影響。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)酯著增加了腦缺血后claudin-5的表達。提示小白菊內(nèi)酯可能通過誘導(dǎo)claudin-5來改善缺血后血腦屏障的破壞。

總之，我們已經(jīng)表明小白菊內(nèi)酯對腦缺血大鼠具有神經(jīng)保護作用，可以減輕腦水腫，減小腦梗死體積，降低神經(jīng)功能缺損評分，這個作用可能是通過升高SOD和CAT的水平，降低MDA的水平，下調(diào)TLR4和NF-κB的表達，增加Claudin-5的表達實現(xiàn)的，但是小白菊內(nèi)酯應(yīng)用的劑量，應(yīng)用的時間，以及是否還通過其他途徑起到腦保護作用，還需進一步研究。