2 型糖尿病氣陰兩虛病證結(jié)合動物模型的制備及評價指標的建立

張譯心王鑫劉博紀鳳蘭溫富春丁濤徐惠波?

(1. 吉林省中醫(yī)藥科學院,長春 130012; 2. 長春中醫(yī)藥大學,長春 130117)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種以糖脂代謝紊亂為特征的慢性代謝病,屬于中醫(yī)“消渴”范疇,臨床上可將2 型糖尿病分為氣陰兩虛證、陰陽兩虛證、血瘀氣滯證和陰虛熱盛證4 個證型[1-2]。為了在基礎研究中實現(xiàn)對糖尿病的不同證型進行對證治療,以更好地了解并詮釋中藥治療的機制,采用“擬臨床研究”的原則制備病證結(jié)合動物模型不失為一種較好的研究方法之一。病證結(jié)合動物模型的建立,一方面可為臨床治療提供可靠有效的實驗依據(jù),從而進一步了解臨床疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律;另一方面,它既能反映中醫(yī)證候特點,又能體現(xiàn)疾病的病理變化,與單一疾病模型比較,在研究中藥作用時能更充分地突顯傳統(tǒng)醫(yī)學對疾病治療的優(yōu)勢[3-4]。本文通過高糖高脂喂養(yǎng)結(jié)合腹腔注射鏈脲佐菌素(steptozocin,STZ)制備2 型糖尿病氣陰兩虛證大鼠模型,通過采集大鼠體征變化和實驗室指標,對氣陰兩虛證大鼠模型進行評價,為2 型糖尿病氣陰兩虛證模型的評價標準的建立提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

48 只健康 6 周齡雄性 SPF 級 SD 大鼠,體重(160 ± 10)g,購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司【SCXK(遼)-2020-0001】,飼養(yǎng)于吉林省中醫(yī)藥科學研究院屏蔽環(huán)境動物室【SYXK(吉)2020-0009】,室溫18 ～25℃,相對濕度50% ～60%,每天12 h光照,12 h 黑暗循環(huán),大鼠適應性飼養(yǎng)1 周,用于實驗。本實驗經(jīng)過吉林省中醫(yī)藥科學院動物倫理委員會批準實施(倫理審批號:JLSZKYDWLL2019-001)。

1.1.2 飼料

高糖高脂KK 飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司,維持飼料購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(Sigma 公司,WXBC7268 V),檸檬酸(北京化工廠,20150925),檸檬酸鈉(北京化工廠,20180103),肝素鈉(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司,151809086A),甲醛(天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司,20170305)葡萄糖試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司,193691),cAMP、cGMP 試劑盒(美國 RD 公司,201912),CD4、CD8 試劑盒(美國RD 公司,202006)。

BGM506 型血糖儀(深圳市家康科技有限公司,中國),HS11 型數(shù)碼相機(富士公司,日本),PowerLab/8S 型多導生物記錄儀(AD Instruments,日本),ELx800 型酶標儀(BioTek Instruments Inc,美國),GF-D800 型半自動生化分析儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司,中國),CS-600B 型全自動生化分析儀(長春迪瑞實業(yè)有限公司,中國),YLS-13 A型大鼠抓力測定儀(山東省醫(yī)學科學院濟南益延科技發(fā)展有限公司,中國),DT5-3 型低速臺式自動平衡離心機(北京時代北利離心機有限公司,中國),Leica RM2255 型石蠟切片機(Leica,德國),Leica EG1140 型石蠟包埋機(Leica,德國),OlympusBX51型光學顯微鏡(Olympus,日本),NIS-ELEMNT BR 型圖像分析系統(tǒng)(NIKON,日本)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模

SD 大鼠 48 只隨機分為空白組(A 組 12 只)、病證模型組(B 組20 只)和高糖高脂組(C 組16 只),A 組喂飼普通飼料,其余兩組喂飼高脂飼料。飼養(yǎng)4 周后,B 組大鼠禁食12 h 以40 mg/kg 劑量腹腔注射STZ(在4℃冰浴中,以0.1 mol/L 濃度 pH=4.4檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制),A 組和C 組腹腔注射同體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射1 周后測定B 組大鼠空腹血糖,空腹血糖值大于11.1 mmol/L 即視為糖尿病造模成功,繼續(xù)飼養(yǎng)至14 周試驗結(jié)束。

1.2.2 模型評估標準

《中藥新藥臨床研究指導原則》中2 型糖尿病氣陰兩虛證候表現(xiàn)如下:咽干口燥、倦怠乏力、多食易饑、口渴喜飲、氣短懶言、舌紅少津液、脈細數(shù)無力[5]。以氣陰兩虛證候的臨床表現(xiàn)為依據(jù),設計“大鼠體征采集表”,采集相關(guān)指標作為模型評價標準(見表1,2)。

1.2.3 大鼠一般狀態(tài)

每周觀察大鼠體征變化,對照評分表記錄每只大鼠的運動、精神狀態(tài)的分值,分值越高,運動、精神狀態(tài)越差,表明大鼠體征越符合氣陰兩虛證候表現(xiàn)。

1.2.4 體重、進食量、飲水量測定

每周稱量大鼠體重,記錄大鼠24 h 進食量和飲水量1 次,進食量=(每籠飼料添加量-24 h 后飼料剩余量)/每籠動物只數(shù),飲水量=(每籠飲水添加量-24 h 后飲水剩余量)/每籠動物只數(shù)。

1.2.5 抓力測定

每4 周測定1 次:先用右手將大鼠按放在抓力板上,左手向前推抓力板,然后右手滑至鼠尾部,左手松開抓力板,待大鼠用力抓住抓力板時,及時加力后拉,以得到最大抓力,各組每只大鼠連續(xù)測量3次,取平均值。

1.2.6 呼吸、脈搏測定

于實驗第14 周測定大鼠呼吸、脈搏:大鼠麻醉狀態(tài)下背部朝上放在置于桌面上(自然俯臥狀態(tài)),將呼吸傳感器的壓力帶自然平鋪在于大鼠背腹部上;將脈搏傳感器對準大鼠尾根處的靜脈血管,纏繞壓力帶時注意力度適中,連接多導生理記錄儀,使用Lab Chart7 軟件記錄各組大鼠的呼吸頻率及脈搏幅度。

表1 大鼠體征采集表Table 1 Evaluation criteria for collecting rat signs

表2 運動、精神狀態(tài)評分表Table 2 A rating scale for state of motion and state of mind

1.2.7 舌象分析

于實驗第14 周采集大鼠舌象信息:大鼠麻醉狀態(tài)下,輕背位固定,皮筋牽拉大鼠口腔,使舌體自動暴露,數(shù)碼相機關(guān)閉閃光燈,近景拍攝模式下,將大鼠舌面與標準色卡對照拍攝。分析采用Photoshop 7.0 軟件,設定色階:黑色:L:22,a:0,b:0;灰色:L:58,a:0,b:0;白色:L:93,a:0,b:0。使用套圈工具,選定舌面(從舌尖到舌面中部),利用Photoshop 7.0軟件中“直方圖”工具,計算該區(qū)域的紅色值(R值)、綠色值(G 值)、藍色值(B 值)。R、G、B 值均為0 時為純黑色,均為255 時為純白色,提示舌象R、G、B 值減小,表明舌體顏色越暗,越接近純黑色,血瘀證時舌體顏色呈暗紫色[6]。

1.2.8 血糖測定

從第4 周開始,每隔1 周測定1 次大鼠的隨機血糖、空腹血糖(禁食12 h),尾靜脈采血,采用血糖儀測定血糖值。

1.2.9 尿糖檢測

于實驗第 8、12、14 周,每組隨機選取 10 只大鼠,收集尿液,進行尿糖檢測。

1.2.10 糖耐量測定

實驗第14 周最后1 d,每組隨機選取8 只大鼠禁食12 h,灌胃葡萄糖溶液(2 g/kg),尾靜脈取血,測定大鼠服糖后0、30、60、120 min 的血糖值,繪制糖耐量曲線。采用近似梯形法計算口服糖耐量試驗過程中血糖曲線下面積(area under curve,AUC)。

1.2.11 凝血功能檢測

實驗結(jié)束,大鼠腹腔麻醉,每組隨機選取8 只大鼠,腹主動脈取血0.5 mL,3.8%檸檬酸鈉抗凝,全自動生化分析儀進行活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)檢測。

1.2.12 血清 TC、TG、LDL-C 指標檢測

每組隨機選取8 只大鼠,腹主動脈取血,全自動生化分析儀分析膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)。

1.2.13 血清 cAMP、cGMP 含量測定及 cAMP/cGMP 計算

每組隨機選取8 只大鼠,腹主動脈取血,分離血清,-80℃保存?zhèn)溆?。用酶?lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清中環(huán)腺苷酸(cAMP)、環(huán)鳥甘酸(cGMP)的含量,并計算cAMP/cGMP 值。

1.2.14 血清CD4、CD8 含量測定及CD4/CD8 計算

每組隨機選取8 只大鼠,腹主動脈取血,分離血清,-80℃保存?zhèn)溆谩Ｓ妹嘎?lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清中環(huán)腺苷酸(cAMP)、環(huán)鳥甘酸(cGMP)的含量,并計算cAMP/cGMP 值。

1.2.15 胸腺指數(shù)測定

每組隨機選取8 只大鼠,稱量大鼠麻醉前體重,腹主動脈取血,稱取胸腺重量,計算胸腺指數(shù),胸腺指數(shù)=胸腺重量/體重×100%。

1.2.16 胰腺組織HE 染色觀察

每組隨機選取8 只大鼠,摘取胰腺,將其固定于10%福爾馬林溶液中,HE 染色,做光鏡下胰腺組織形態(tài)學觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計,數(shù)據(jù)以平均值 ± 標準差(±s)表示,統(tǒng)計學處理方法采用SPSS 22.0 One-way ANOVA 最小顯著性差異法(LSD)作兩兩比較,以P< 0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)的觀察

結(jié)果顯示,第0 ～14 周時A 組大鼠精神狀態(tài)良好、活躍好動、反應靈敏迅速;與A 組比較,第8 ～14 周 B 組大鼠精神、運動評分均顯著升高(P<0.01),從第8 周開始精神、運動評分均逐漸升高,說明B 組大鼠精神狀態(tài)逐漸由正常轉(zhuǎn)為呆滯,行動逐漸變得遲緩,14 周時大鼠對外界刺激無反應或反應遲鈍;C 組大鼠精神、運動評分與A 組比較始終無顯著性差異,表明大鼠精神狀態(tài)良好,行動活躍(圖1)。

2.2 大鼠不同時間體重、進食量、飲水量測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠體重從第4 周開始顯著降低(P< 0.05 或P< 0.01),進食量和飲水量均從第8 周開始顯著增加(P< 0.05 或P< 0.01);C組大鼠體重在第14 周時顯著增加,進食量在第12 周時顯著降低,飲水量在第4、12 周時顯著降低,均具有顯著性差異(P< 0.05 或P< 0.01)(圖2)。

2.3 大鼠不同時間抓力測定結(jié)果

結(jié)果顯示,B 組大鼠第 0 周、4 周、8 周的抓力值與A 組比較無顯著性差異,從第8 周開始抓力呈降低趨勢,第12、14 周時大鼠抓力顯著低于A 組(P<0.01);C 組大鼠第 0、4、14 周的抓力與 A 組比較無顯著性差異,第8、12 周的抓力顯著低于與A 組(P<0.01)(圖3)。

2.4 大鼠呼吸頻率和脈搏幅度測定結(jié)果

結(jié)果顯示,從第0 周開始至第14 周,B 組大鼠呼吸頻率逐漸減弱,第14 周時呼吸頻率顯著低于A 組(P< 0.01);與A 組比較,B 組大鼠脈搏幅度在第8周、14 周時顯著降低(P< 0.01)。C 組大鼠第0 ～ 12周時呼吸頻率逐漸降低,第14 周時升高,與A 組比較始終無顯著性差異;第4 周時大鼠脈搏幅度降低,第8～14 周保持不變,與A 組比較,第14 周時C 組大鼠脈搏幅度顯著高于A 組(P< 0.05)(圖4)。

2.5 大鼠舌象分析結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠舌象的R、G、B值均顯著降低(P< 0.05 或P< 0.01);C 組大鼠舌象的 R 值顯著低于 A 組(P< 0.05),G、B 值與 A 組比較無顯著性差異(圖5)。

2.6 大鼠血糖測定結(jié)果

結(jié)果顯示,第4 周時(STZ 注射前),B 組大鼠的隨機血糖、空腹血糖與A 組比均無顯著性差異;第6～14 周,B 組大鼠的隨機血糖、空腹血糖均顯著高于A 組(P< 0.01)。與 A 組比,第 6 ～ 12 周時,C 組大鼠隨機血糖顯著升高(P< 0.05 或P< 0.01);第10 周時空腹血糖顯著升高(P< 0.05),其余時間與A 組大鼠空腹血糖比較均無顯著性差異(圖6)。

注:與 A 組比較,*P< 0.05,??P< 0.01。(下圖同)圖1 大鼠一般狀態(tài)評分觀察Note. Compared with group A, *P< 0.05, ??P< 0.01. (The same in the following figures)Figure 1 Observation of general status score of rats

圖2 大鼠不同時間體重、進食量和飲水量測定結(jié)果Figure 2 Measurement results of weight, food intake and water intake of rats at different times

圖3 大鼠不同時間抓力測定結(jié)果Figure 3 Grasping force measurement results of rats at different times

圖5 大鼠舌象分析結(jié)果Figure 5 Analysis results of tongue image of rats

圖6 大鼠血糖測定結(jié)果Figure 6 Measurement results of blood glucose in rats

2.7 大鼠尿糖檢測結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠3 次尿糖檢測結(jié)果均顯著升高(P<0.01);C 組大鼠3 次尿糖檢測結(jié)果與A 組比較均無顯著性差異(圖7)。

2.8 大鼠糖耐量測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠灌胃葡萄糖后各時間點血糖值均顯著升高(P< 0.01),B 組AUC 顯著高于 A 組(P< 0.01);C 組大鼠灌胃后120 min 血糖值顯著高于A 組(P< 0.01),其余時間點的血糖值及AUC 與A 組比較均無顯著性差異(圖8)。

2.9 大鼠凝血功能指標測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與 A 組比較,B 組大鼠 PT、APTT 均顯著減少(P< 0.05 或P< 0.01),C 組大鼠 PT、APTT 均無顯著性差異(圖9)。

2.10 大鼠血清TC、TG、LDL-C 指標測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠血清TC、TG、LDL-C 含量均顯著升高(P< 0.01);C 組大鼠TG 含量顯著升高(P< 0.01),TC、LDL-C 含量無顯著性差異(圖10)。

圖7 大鼠尿糖檢測結(jié)果(n=8)Figure 7 Urine glucose detection results of rats(n=8)

圖8 大鼠糖耐量測定結(jié)果(n=8)Figure 8 Measurement results of glucose tolerance in rats(n=8)

圖9 大鼠凝血功能指標測定結(jié)果(n=8)Figure 9 Measurement results of coagulation function indexes in rats(n=8)

圖10 血清TC、TG 和LDL-C 指標測定結(jié)果(n=8)Figure 10 Measurement results of serum TC, TG and LDL-C indexes(n=8)

2.11 大鼠血清 cAMP、cGMP 含量及 cAMP/cGMP 測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠血清中cAMP含量和cAMP/cGMP 比值均顯著升高(P< 0.05 或P< 0.01);C 組大鼠血清中cGMP 含量顯著低于A組,cAMP/cGMP 比值顯著高于A 組,均有顯著性差異(P< 0.01)(圖11)。

圖11 血清cAMP、cGMP 含量測定結(jié)果(n=8)Figure 11 Determination of cAMP and cGMP in serum(n=8)

2.12 大鼠血清 CD4、CD8 含量及 CD4/CD8 測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠血清中CD4含量和CD4/CD8 比值均顯著降低(P< 0.05 或P<0.01);C 組大鼠血清中 CD4 含量顯著降低(P<0.05)(圖12)。

圖12 大鼠血清CD4、CD8 含量測定結(jié)果(n=8)Figure 12 Determination of CD4 and CD8 in serum of rats(n=8)

2.13 大鼠胸腺指數(shù)測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠胸腺指數(shù)顯著降低(P< 0.01),C 組大鼠胸腺指數(shù)無顯著性差異(圖13)。

圖13 大鼠胸腺指數(shù)測定結(jié)果(n=8)Figure 13 Measurement results of thymus index in rats(n=8)

2.14 大鼠胰腺組織HE 染色結(jié)果

結(jié)果顯示,A 組大鼠的胰腺組織內(nèi)可見體積較大的胰島組織,形態(tài)圓,分布數(shù)量較多,間質(zhì)疏松;細胞胞漿充盈正常,未見細胞空泡變性,未見細胞固縮現(xiàn)象。

與A 組比較,B 組大鼠胰腺組織內(nèi)極少見到胰島組織分布,胰島數(shù)量顯著減少;殘存胰島組織體積較小,其內(nèi)細胞數(shù)量顯著減少,細胞胞漿含量顯著減少,可見細胞固縮現(xiàn)象,表明STZ 導致動物胰腺內(nèi)胰島組織損傷,胰島形態(tài)明顯改變,功能明顯下降。

與A 組比較,C 組大鼠胰腺組織內(nèi)胰島數(shù)量顯著增多,體積較大,形態(tài)圓,細胞胞漿豐富,胞漿量增多;少數(shù)胰島細胞出現(xiàn)空泡變性,提示動物需要增強胰島功能,增加胰島細胞分泌量,以滿足機體對胰島所產(chǎn)內(nèi)分泌激素的需求(圖14)。

圖14 大鼠胰腺組織病理結(jié)果Figure 14 Histopathological results of pancreas in rats

3 討論

辨證施治是傳統(tǒng)醫(yī)學治病的精髓,如何在基礎研究中突出中藥的治療特點一直是中藥藥效研究亟待解決的問題,病證結(jié)合動物模型及其評價方法的建立可以較好地解決這一問題。本文通過高糖高脂飼養(yǎng)結(jié)合腹腔注射鏈脲佐菌素制備2 型糖尿病大鼠模型,根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導原則》中2型糖尿病氣陰兩虛證候的臨床表現(xiàn),我們嘗試設計了相應的動物體征采集表,對動物在糖尿病發(fā)展過程中的癥狀、體征表現(xiàn)盡量做到定量客觀化描述,以此建立一個可操作的2 型糖尿病氣陰兩虛病證結(jié)合動物模型及其評價標準。

中醫(yī)臨床通過“望聞問切”的方法對病證進行判斷,本實驗以模擬中醫(yī)臨床表現(xiàn)為原則,嘗試將四診法轉(zhuǎn)換為大鼠體征的采集方法,并著重于望診信息的采集。氣陰兩虛是糖尿病的核心病機,貫穿糖尿病病程發(fā)展的始末[7]。糖尿病患者飲食多肥厚油膩,易積食氣滯,脾胃郁結(jié),脾胃受損則無以消化精微,致體內(nèi)運化失常,陰虛陽盛,陽氣升而體內(nèi)熱,內(nèi)熱久積而傷陰,陰精虧虛而耗氣,消渴日久,循環(huán)往復,耗氣傷陰,致氣陰兩虛[8]。臨床認為氣陰兩虛型2 型糖尿病表現(xiàn)為咽干口燥,倦怠乏力,多食易饑,口渴喜飲,氣短懶言,舌紅少津液,脈細數(shù)無力;將臨床表現(xiàn)與大鼠體征、評價指標及實驗室指標相對應,通過記錄客觀指標,觀察體征變化,對模型進行評價。

首先通過對動物一般狀態(tài)進行評分反映大鼠運動、精神狀態(tài)的變化特點,分值越高,動物一般狀態(tài)越差,以此說明大鼠倦怠懶言的體征特點越明顯;通過對抓力、呼吸、脈搏等進行測定,抓力值降低,說明大鼠出現(xiàn)乏力狀態(tài),呼吸、脈搏減弱,表明大鼠出現(xiàn)氣短、脈細無力等體征改變。

舌象的觀察。血液在脈絡中的正常運行取決于體內(nèi)氣的充盈和推動,氣虛不足則推力弱,致血流不暢;作為血液的載體,脈絡還需要陰液的滋養(yǎng),陰液缺乏會導致脈絡阻滯,血液瘀阻,故氣陰兩虛日久生瘀。試驗結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠舌象的 R、G、B 值均顯著降低,R、G、B 值減小,表明舌體顏色變暗;舌體顏色呈暗紫色,表現(xiàn)為瘀證。說明在模型制備過程中,B 組大鼠可能表現(xiàn)為氣陰兩虛夾瘀[9-11]。

進食量和飲水量的觀察。中醫(yī)臨床氣陰兩虛具有咽干口燥、多食易饑、口渴喜飲的證候表現(xiàn),我們通過監(jiān)測進食飲水量來反映這種體征。試驗顯示,B 組的進食量、飲水量較A 組顯著增加,結(jié)合血糖、尿糖、糖耐量等糖尿病基礎檢測指標的測定,也可綜合評價2 型糖尿病氣陰兩虛證動物模型的證候表現(xiàn)。

內(nèi)源性和外源性凝血功能APTT、PT 的觀察。傳統(tǒng)醫(yī)學認為氣為血之帥,血為氣之母,氣不足無以攝血;陰虛則血脈不充,血流運行不暢。氣陰兩虛則致瘀血阻滯,血凝速度加快。結(jié)果顯示,B 組APTT、PT 較A 組明顯縮短,說明可能出現(xiàn)瘀血阻滯,間接反映機體處于氣陰兩虛狀態(tài)[12-13]。

血脂的觀察。氣陰兩虛時脾胃損傷不能升清降濁,可誘發(fā)“痰濁”,痰飲內(nèi)阻致血液粘稠而瘀血內(nèi)生,血流不暢致氣化失常而留滯成痰,故TC、TG和LDL-C 是中醫(yī)痰濁評價的重要生化指標[14-15]。試驗結(jié)果顯示,B 組 TC、TG 和 LDL-C 值均升高;即在血糖代謝異常同時出現(xiàn)了血脂代謝異常;既反映了2 型糖尿病的特點,又符合氣陰兩虛,痰濁內(nèi)生的機體狀態(tài)。

免疫功能的觀察。氣虛由于機體元氣不足,氣的推動、固攝、運化、溫煦等功能減退,或臟腑機能減退,在現(xiàn)代醫(yī)學中表現(xiàn)為免疫功能紊亂[16]。胸腺是機體重要的中樞免疫器官,CD4、CD8 細胞屬于機體免疫細胞—T 淋巴細胞的亞群,二者數(shù)量及比例平衡是保持體內(nèi)免疫功能穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。上述指標都是評價機體免疫力的重要指標[17-18]。結(jié)果顯示,與 A 組比較,B 組大鼠胸腺指數(shù)、CD4、CD4/CD8 值均明顯降低,從而反映機體可能處于氣陰兩虛狀態(tài)。

cAMP 和 cGMP 的觀察。cAMP、cGMP 是反映體液免疫功能的重要指標,其含量可影響機體神經(jīng)內(nèi)分泌功能[19-20]。研究表明,陰虛時機體交感神經(jīng)-腎上腺系統(tǒng)功能偏高,表現(xiàn)為第二信使cAMP 活性升高,而cAMP/cGMP 比值升高較單一cAMP 升高更具特異性[21]。結(jié)果顯示,B 組 cAMP、cAMP/cGMP 值均顯著高于A 組,說明機體陰虛狀態(tài)顯現(xiàn)。

總結(jié)本實驗結(jié)果,病證模型動物的體征表現(xiàn)可概括為:精神萎靡,行動遲緩,進食量、飲水量增加,抓力降低,呼吸、脈搏減弱,舌體顏色呈暗紫色等;反映了臨床2 型糖尿病氣陰兩虛證中咽干口燥、多食易饑、口渴喜飲、倦怠乏力、氣短懶言、脈細無力、舌色暗紫等證候特點;同時實驗室指標也出現(xiàn)了血糖、尿糖、糖耐量及 TC、TG、LDL-C 值均顯著升高,PT、APTT、胸腺指數(shù)顯著下降,cAMP 和 cAMP/cGMP 值顯著升高,CD4、CD4/CD8 值顯著降低,胰腺內(nèi)胰島組織損傷、功能顯著下降等變化,也輔助證明了B 組大鼠出現(xiàn)2 型糖尿病氣陰兩虛證臨床表現(xiàn)。而單純高糖高脂喂養(yǎng)14 周的大鼠各項指標與 A 組比較,隨機血糖、TG、cGMP、CD4 及舌象的 R值等指標有顯著性差異,其余各項指標檢測結(jié)果無顯著性差異,因此,認為該模型還不能全面地反映出2 型糖尿病氣陰兩虛證的證候特點。

綜上,大鼠高糖高脂喂養(yǎng)4 周后腹腔注射STZ 40 mg/kg,繼續(xù)高糖高脂飼養(yǎng)至14 周制備的動物模型可較好地反映2 型糖尿病氣陰兩虛證的特點。由此說明,通過對動物體征指標進行監(jiān)測可反映中醫(yī)證候的發(fā)展過程,結(jié)合實驗室指標進行定量化描述可進一步輔助驗證病證結(jié)合動物模型的成立及證候特點的表達,二者結(jié)合有助于模型的評價,同時也使模型評價更為直觀、客觀、可操作,標準更易于統(tǒng)一。