高溫條件下澳洲堅(jiān)果葉片黃化的生理特性

楊為?！≡x　萬(wàn)繼鋒　張漢周　陸超忠

摘 ?要：為探明高溫條件下澳洲堅(jiān)果葉片黃化的生理特性，以澳洲堅(jiān)果品種‘HAES344的葉片為試材，對(duì)湛江地區(qū)2019年6月份的氣溫進(jìn)行調(diào)查，初步研究葉片的一些生理生化指標(biāo)的變化。結(jié)果表明：湛江地區(qū)6月份的晝/夜平均溫度高達(dá)33.6 ℃/28.5 ℃，特別是遭遇了3次較長(zhǎng)時(shí)間的溫度高峰期，其每日的晝/夜平均溫度均超過(guò)35 ℃/29 ℃，可能導(dǎo)致了黃化葉片發(fā)生。隨著葉片黃化程度的加深，葉片的SPAD值、SOD活性以及葉綠素（Chla+Chlb、Chla與Chlb）含量及其熒光參數(shù)（Fo、Fm與Fv / Fm）均顯著下降，而丙二醛（MDA）和過(guò)氧化氫（H2O2）含量以及POD活性均顯著升高，CAT活性則保持相對(duì)穩(wěn)定。但同正常葉片相比，黃化葉片的SPAD值、葉綠素含量及其熒光參數(shù)均顯著降低，而MDA和H2O2含量以及POD與CAT活性卻顯著升高。相關(guān)性分析結(jié)果表明，F(xiàn)o、Fm、Fv / Fm、MDA、Chla、CAT、SOD、POD等8個(gè)指標(biāo)間存在一定的顯著相關(guān)性。該結(jié)果對(duì)于了解澳洲堅(jiān)果葉片黃化具有參考價(jià)值，為進(jìn)一步開展相關(guān)分子機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：澳洲堅(jiān)果;高溫;葉片黃化;葉綠素?zé)晒?/p>

中圖分類號(hào)：S667.9 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Preliminary Study on Physiological Characteristics of Macadamia Leaf Etiolation under High Temperature

YANG Weihai1， ZENG Hui2，3， WAN Jifeng2，3， ZHANG Hanzhou2，3， LU Chaozhong2，3*

1. College of Life Science and Resources and Environment， Yichun University， Yichun， Jiangxi 336000， China; 2. South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 3. Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract： In order to find the physiological characteristics of macadamia leaf etiolation under high temperature， taking the leaves of ‘HAES344 macadamia as the test materials， the trial studied the temperature of June， 2019 in Zhanjiang area， and the changes of several related physiological indexes in the leaves were preliminarily investigated. The results showed that the average day/night temperature in June was as high as 33.6 ℃/28.5 ℃， especially the three long temperature peaks whose daily day/night average temperature exceeded 35 ℃/29 ℃， which probably caused the yellowing of the leaves. With the intensification of leaf etiolation， the SPAD value， SOD activity， chlorophyll （Chla+Chlab， Chla and Chlb） content and its fluorescence parameters （Fo， Fm and Fv / Fm） of the leaves decreased significantly， while the contents of malondialdehyde （MDA） and H2O2 and the activity of POD increased obviously， but the CAT activity remained relatively stable. However， compared with normal leaves， the SPAD value， chlorophyll content and fluorescence parameters of the etiolation leaves were significantly reduced， while MDA and H2O2 contents and POD and CAT activities significantly increased. The correlation analysis showed that there was a certain significant correlation among Fo， Fm， Fv/Fm， MDA， Chla， CAT， SOD and POD. The results would provide the reference value in understanding the yellowing leaves of macadamia and establishing a foundation for further research on relevant molecular mechanism.

Keywords： macadamia; high temperature; leaf etiolation; chlorophyll fluorescence

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.031

澳洲堅(jiān)果（Macadamia integrifolia，M. tetraphylla）是我國(guó)南亞熱帶地區(qū)新興的常綠喬木果樹，已在我國(guó)云南、廣西、廣東、貴州等省（區(qū)）推廣種植約200 000 hm2，成為了一個(gè)經(jīng)濟(jì)與生態(tài)效益俱佳的新興特色產(chǎn)業(yè)。然而，隨著全球氣候變暖，高溫對(duì)作物生育和產(chǎn)量的威脅已是一個(gè)全球性的熱點(diǎn)問(wèn)題[1]。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在夏季持續(xù)的高溫條件下，廣東與廣西的堅(jiān)果園中一些耐熱性較差的澳洲堅(jiān)果品種（如‘HAES344‘桂熱1號(hào)等）的新梢葉片容易發(fā)生黃化，甚至失水干枯，影響果實(shí)產(chǎn)量，而在貴州與云南產(chǎn)區(qū)則少見此類現(xiàn)象。然而，迄今有關(guān)澳洲堅(jiān)果葉片黃化的生理特性研究尚未見報(bào)道。

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，葉色變化對(duì)植物的光合作用與生長(zhǎng)發(fā)育有著直接影響。通常情況下，常綠植物葉色的主要決定因子是葉片中的葉綠素和類胡蘿卜素含量，葉片黃化主要是由于葉綠素的合成或者降解受到不可避免的影響而改變了葉綠素和類胡蘿卜素的比例，進(jìn)而表現(xiàn)出不正常的褪綠[2]。在高溫條件下，植物會(huì)通過(guò)感受逆境信號(hào)而改變其光合生理生化反應(yīng)，造成外觀形態(tài)上的熱害癥狀，甚至萎蔫死亡[3]。高溫脅迫不僅破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，影響葉綠素合成，還能夠引發(fā)光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）受損，造成光合系統(tǒng)活性降低[4-5]。一般認(rèn)為，高溫脅迫主要通過(guò)產(chǎn)生過(guò)剩激發(fā)能，誘導(dǎo)葉綠體中過(guò)量活性氧（ROS）生成，使得光合膜脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致PSⅡ蛋白損傷與葉綠素降解[6-7]。研究表明，在40 ℃/30 ℃（晝/夜）的高溫處理下，蝴蝶蘭幼苗葉片明顯黃化，ROS和丙二醛（MDA）水平增加，而抗氧化酶（SOD、POD與CAT）活性顯著下降[8]。通過(guò)高溫脅迫（40 ℃/35 ℃）處理后發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓植株葉色變黃，且葉綠素含量及SOD活性下降[9];芍藥葉綠體及其光合機(jī)構(gòu)受到不可逆損傷，造成葉綠素的相對(duì)含量（SPAD）和PSⅡ的F_o、F_m、F_v/F_m等葉綠素?zé)晒鈪?shù)顯著降低，導(dǎo)致植株葉片發(fā)生黃化，光合能力明顯下降[10]。馮建燦等[11]認(rèn)為，植物的葉綠素?zé)晒夂蚉SⅡ原初反應(yīng)有著密切關(guān)系。高溫條件下葉綠素?zé)晒鈪?shù)迅速下降，PSⅡ反應(yīng)中心活性受抑制[12-14]。但是，不同植物的PSⅡ在高溫條件下吸收光能分配比例存在較大差異，反映出不同植物對(duì)高溫的耐性不同[15]。目前，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)被廣泛應(yīng)用于指示植物的脅迫應(yīng)答反應(yīng)和評(píng)價(jià)植株的抗逆性[16-18]，這在澳洲堅(jiān)果水分脅迫方面已有報(bào)道[19]。然而，有關(guān)高溫下澳洲堅(jiān)果葉片的葉綠素?zé)晒馓匦院蚏OS代謝還鮮見報(bào)道。因此，研究和探討高溫條件下澳洲堅(jiān)果黃化葉片的生理代謝變化，對(duì)澳洲堅(jiān)果抗熱害栽培具有重要意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

試驗(yàn)于2019年6月在廣東省湛江市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所的澳洲堅(jiān)果試驗(yàn)基地（110°24? E、21°12? N）內(nèi)進(jìn)行，以8～10年生的‘HAES344澳洲堅(jiān)果正常植株為供試材料。

1.2 ?方法

1.2.1 ?試驗(yàn)設(shè)計(jì) ?經(jīng)田間觀察，于2019年6月1日選擇3株生長(zhǎng)一致且已抽發(fā)正常夏梢的植株，在其樹冠外圍選擇12個(gè)長(zhǎng)勢(shì)基本相當(dāng)?shù)男律?，并?duì)新梢上初始成熟的第4～5輪葉片進(jìn)行標(biāo)記觀察和葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定，同時(shí)收集相同葉位上的部份成熟葉片為分析樣品。隨后每日拍照觀察，待標(biāo)記葉片已出現(xiàn)肉眼可見的黃色小斑點(diǎn)時(shí)（6月12日），開始跟蹤葉片的黃化程度變化，并選取不同黃化程度的葉片進(jìn)行采樣和葉綠素?zé)晒庥^測(cè)，直至6月30日結(jié)束試驗(yàn)。整個(gè)試驗(yàn)期間，植株按常規(guī)的水、肥管理。

對(duì)不同黃化程度的成熟葉片，可按其黃化面積大小分為4組：全綠葉片（S0，于6月1日采集）、輕度黃化葉片（S1，黃化面積低于25%，于6月15日采集）、中度黃化葉片（S2，黃化面積介于50%～75%之間，于6月20日采集）與重度黃化葉片（S3，黃化面積接近100%，于6月28日采集）（圖1）。

1.2.2 ?溫度數(shù)據(jù)采集 ?于2019年6月1日應(yīng)用ZDR-20型溫濕度記錄儀采集溫度數(shù)據(jù)，每隔30 min自動(dòng)記錄溫度1次，連續(xù)追蹤樹冠頂端葉面處的溫度變化，直至6月30日結(jié)束。計(jì)算日平均溫度與晝/夜各個(gè)時(shí)段的平均溫度，并統(tǒng)計(jì)晝/夜各個(gè)溫度段的總時(shí)數(shù)與平均時(shí)數(shù)。

1.2.3 ?測(cè)定項(xiàng)目與方法 ?（1）SPAD值測(cè)定。利用葉綠素儀SPAD-502 plus（Konica Minolta， INC， Japan）對(duì)植株的取樣葉片進(jìn)行測(cè)定，在主葉脈兩側(cè)各取3個(gè)不同部位測(cè)定其SPAD值，并計(jì)算平均值。

（2）葉綠素含量測(cè)定。參照孔祥生[20]的方法，應(yīng)用UV-1800型紫外分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和總?cè)~綠素（Chla+Chlb）含量。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

（3）葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定。參考Morison等^[21]的方法，利用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)（CFImager;Technologica Ltd.， Colehester， UK）測(cè)定葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)。檢測(cè)前先將葉片充分暗適應(yīng)30 min，用弱檢測(cè)光[0.5 μmol/（m²·s）]測(cè)定最小熒光F_o，再給周期性的飽和脈沖光[6000 μmol/（m²·s），脈沖時(shí)間0.8 s]，誘導(dǎo)最大熒光F_m;然后，打開作用光[750 μmol/（m²·s）]，讓葉片充分光適應(yīng)30 min，待光下穩(wěn)態(tài)熒光F?穩(wěn)定后，再用飽和脈沖光測(cè)定F_m?。由系統(tǒng)計(jì)算出F_v/F_m、F_v?/F_m?、F_q?/F_m?和NPQ。單個(gè)葉片樣品重復(fù)測(cè)定3次，每株取3個(gè)葉片測(cè)定。

（4）MDA與H₂O₂含量測(cè)定。MDA含量參照趙世杰等^[22]的硫代巴比妥酸（TBA）顯色法進(jìn)行測(cè)定。稱取0.5 g樣品，加入6 mL磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8，含0.2 mmol/L EDTA和2% PVP）進(jìn)行冰浴研磨，于4?℃下10000?×g離心20?min后，取上清液1 mL，加入3 mL TBA反應(yīng)液（2% TBA與30%三氯乙酸的混合液），于95?℃水浴30 min后離心，再取上清液分別測(cè)定波長(zhǎng)450、532、600 nm處的吸光度值，并計(jì)算單位葉片鮮重的MDA含量（nmol/g）。H₂O₂含量應(yīng)用北京索萊寶科技有限公司的H₂O₂試劑盒測(cè)定，具體操作參照說(shuō)明書。

（5）抗氧化酶活性測(cè)定。稱取0.5 g樣品，加入5 mL磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8，含1% PVP）進(jìn)行冰浴研磨，于4 ℃下10 000×g離心15 min，上清液即為粗酶提取液，用于酶活性測(cè)定。超氧化物歧化酶（SOD）活性應(yīng)用北京索萊寶科技有限公司SOD活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定，以“酶活力單位/克鮮重（U/g）”表示酶促反應(yīng)活性。過(guò)氧化物酶（POD）活性參照曾韶西等[23]的愈創(chuàng)木酚氧化法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性參照Cakmak等[24]的紫外吸收法測(cè)定，按每分鐘內(nèi)OD值變化0.01定義為1個(gè)活力單位（U），以“酶活力單位/克鮮重/分鐘[U/（g·min）]”表示酶促反應(yīng)活性。重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析和One-Way ANOVA檢驗(yàn)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?試驗(yàn)期間的氣溫變化情況

于2019年6月，利用溫濕度記錄儀測(cè)得澳洲堅(jiān)果樹冠頂端的氣溫變化如圖2所示。整個(gè)6月份的平均溫度為31.1 ℃，月平均最低氣溫為26.9 ℃，月平均最高氣溫達(dá)38.2 ℃;其中，日最高氣溫超過(guò)35 ℃的天數(shù)有27 d，而超過(guò)38 ℃的天數(shù)達(dá)18 d，甚至超過(guò)40 ℃的天數(shù)有6 d（圖2A）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，6月份≥35 ℃的總時(shí)數(shù)達(dá)172.5 h，平均每天約5.8 h;其中，≥38 ℃的時(shí)數(shù)為55.5 h，平均每天約1.9 h。值得注意的是，整月夜間≥28 ℃的總時(shí)數(shù)達(dá)239.5 h，平均約8.0 h/d;其中，≥30 ℃的時(shí)數(shù)有58.5 h，平均約2.0 h/d（表1）。因此，澳洲堅(jiān)果植株在6月份生長(zhǎng)期間遭受了長(zhǎng)時(shí)間的晝/夜高溫環(huán)境影響。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，整月的晝平均氣溫為33.6 ℃，上午（06：00—12：00）、下午（12：00—18：00）兩個(gè)時(shí)段的平均溫度相當(dāng)（圖2B）。在夜間，整月的夜溫均較高，平均氣溫達(dá)28.5 ℃，其上半夜（18：00—24：00）的平均溫度（29.2 ℃）比下半夜（24：00—06：00）高出1.3 ℃（圖2C）。期間，晝、夜平均氣溫還先后出現(xiàn)了3次高峰，分別在6月7—11日、6月20—23日和6月26—29日，其每日的晝、夜平均溫度大致分別高于35 ℃與29 ℃。結(jié)合不同黃化程度葉片產(chǎn)生的時(shí)期發(fā)現(xiàn)，從6月1日的全綠葉片至6月15日的輕度黃化葉片產(chǎn)生時(shí)其晝/夜平均氣溫由30.0 ℃/25.6 ℃升高至32.9 ℃/28.2 ℃，而由輕度至中度黃化葉片時(shí)（6月16—20日）以及中度至重度黃化葉片時(shí)（6月21—28日），晝/夜平均溫度則分別增加至33.0 ℃/ 28.6 ℃和35.4 ℃/29.1 ℃。綜合分析可知，晝/夜高溫可能對(duì)‘HAES344澳洲堅(jiān)果葉片生長(zhǎng)造成了高溫脅迫影響。

2.2 ?葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化

隨著葉片黃化程度的加重，F_o、F_m與F_v/F_m均發(fā)生明顯下降（圖3）。其中，F_o值在輕度黃化葉片（S₁）中最高，顯著高于其他3種葉片，而全綠葉片（S₀）的F_o值亦顯著高于中度黃化葉片（S₂）與重度黃化葉片（S₃）（圖3A）。F_m值在全綠葉片與輕度黃化葉片間無(wú)顯著差異，但二者均顯著高于中度與重度黃化葉片（圖3B）。全綠葉片的F_v/F_m值與黃化葉片差異顯著，而輕度黃化葉片的F_v/F_m值與中度黃化葉片差異不明顯，但二者均顯著高于重度黃化葉片（圖3C）。然而，NPQ、F_v?/F_m?和F_q?/F_m?在不同黃化程度葉片間無(wú)顯著性差異（圖3D～圖3F）。

2.3 ?葉片葉綠素含量的變化

葉綠素含量的高低直接影響著植物光合作用的強(qiáng)弱，而SPAD值能反映葉綠素的相對(duì)含量。由圖4A可知，葉片的SPAD值隨著葉片黃化程

度的加劇而發(fā)生明顯下降，且在各葉色間均呈顯著性差異。與之相對(duì)應(yīng)的是，Chla+Chlb、Chla與Chlb含量均隨著葉片綠色面積比例的下降而顯著減少（圖4B）。與全綠葉片（S0）相比，重度黃化葉片（S3）的Chla+Chlb、Chla與Chlb含量分別僅約為全綠葉片的9.3%、9.6%與8.1%。

2.4 ?葉片MDA與H2O2含量的變化

H2O2是植物響應(yīng)逆境脅迫所產(chǎn)生的一種非常重要的ROS，其作用于質(zhì)膜的產(chǎn)物MDA是反映膜脂過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)，MDA含量越高，膜脂過(guò)氧化程度或者質(zhì)膜受損程度越大。由圖5可見，MDA和H2O2在全綠葉片中的含量均顯著低于黃化葉片，二者在不同黃化程度葉片間均達(dá)到顯著性差異水平。隨著葉片黃化程度的加重，MDA含量逐漸顯著增加，而H2O2含量表現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)，且在中度黃化葉片中達(dá)到最大值。

2.5 ?葉片抗氧化酶活性的變化

由圖6可知，隨著葉片黃化程度的加劇，SOD活性呈先增加后下降的變化趨勢(shì)，而POD與CAT活性逐漸增強(qiáng)。其中，全綠葉片的SOD活性顯著低于輕度黃化葉片，但顯著高于重度黃化葉片;黃化葉片的POD和CAT活性均顯著高于全綠葉片，且POD和SOD活性在輕度、中度與重度黃化葉片間基本上達(dá)到顯著性差異水平，但CAT活性在這3種黃化葉片間無(wú)顯著性差異。

2.6 ?葉片生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

對(duì)高溫條件下有關(guān)葉片黃化生理特性的9個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，各指標(biāo)之間存在一定的顯著相關(guān)性（表2）。其中，CAT與POD酶活性呈顯著正相關(guān)，SOD活性與Fo則呈極顯著正相關(guān);Chla含量與Fv/Fm亦呈顯著正相關(guān)，但與POD活性呈顯著負(fù)相關(guān);MDA含量與Fm、Fv/Fm間也均呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 ?討論

植物在長(zhǎng)期的自然進(jìn)化過(guò)程中形成了適應(yīng)生長(zhǎng)的溫度環(huán)境。但隨著全球氣候變暖，溫室效應(yīng)加劇，高溫對(duì)植物的正常生長(zhǎng)造成了嚴(yán)重影響。研究發(fā)現(xiàn)，夏季高溫可造成芍藥莖葉萎蔫與葉色變黃[25-26]，導(dǎo)致葡萄葉片失水干枯甚至死亡[27]。陳作泉等[28]認(rèn)為，澳洲堅(jiān)果的適宜生長(zhǎng)溫度是10～30 ℃。在35 ℃以上的自然高溫條件下，如‘HAES344‘HAES508等澳洲堅(jiān)果品種的新梢葉片易出現(xiàn)褪綠變黃現(xiàn)象[29]。本研究中，‘HAES344澳洲堅(jiān)果在整個(gè)試驗(yàn)期間基本上長(zhǎng)期處于35 ℃以上高溫環(huán)境，且遭遇了超過(guò)38 ℃的極端高溫，與葉片黃化產(chǎn)生及其黃化癥狀不斷加深的時(shí)間大致吻合，暗示高溫可能導(dǎo)致了葉片黃化，也印證了前人的相關(guān)報(bào)道。一般情況下，不同種類的作物或者同一種作物的不同基因型對(duì)高溫的敏感性不同，因而表現(xiàn)出不同的耐熱性[3， 25]。在田間自然高溫條件下，‘HAES344澳洲堅(jiān)果產(chǎn)生葉片黃化，表明其對(duì)高溫的敏感性要強(qiáng)于其他未發(fā)生葉片黃化的品種。研究表明，40 ℃/30 ℃（晝/夜）處理蝴蝶蘭幼苗6 d后葉片產(chǎn)生明顯黃化[8]，40 ℃/35 ℃（晝/夜）處理芍藥植株12 d后葉片失綠變黃[10]，而藍(lán)莓植株在40 ℃/35 ℃（晝/ 夜）處理4 d后就發(fā)生葉片黃化和萎蔫[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，‘HAES344澳洲堅(jiān)果新梢葉片從綠變黃所經(jīng)歷的晝夜平均氣溫是由30.0 ℃/25.6 ℃升高至32.9 ℃/28.2 ℃，而造成‘HAES344發(fā)生葉片黃化的臨界高溫及其時(shí)長(zhǎng)還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量在一定程度上反映了其光合作用潛力的大小，是植物生長(zhǎng)狀況的重要指示劑[30]。葉片的SPAD值與葉綠素含量間存在正相關(guān)關(guān)系，能有效反映出葉片的葉綠素狀況[31]，這與本研究結(jié)果相一致。葉綠素對(duì)高溫很敏感，其含量是衡量植物耐熱性的一個(gè)參考指標(biāo)[32]。在高溫脅迫下，耐熱性強(qiáng)的植物始終能夠?qū)⑷~綠素含量保持在較高水平，但熱敏感型植物的葉綠素容易遭到破壞和降解[9， 25]。植物葉色變黃與葉綠素含量降低有密切關(guān)系[33]。本研究中，‘HAES344澳洲堅(jiān)果葉片的葉綠素含量隨著葉片黃化程度的加深而顯著減少，說(shuō)明高溫可能造成了葉綠素的合成受阻或降解加速，導(dǎo)致葉綠素含量大幅下降，引發(fā)葉片失綠變黃，這與藍(lán)莓[9]、芍藥[10]及葡萄[34]等作物上的報(bào)道相一致，也暗示了‘HAES344澳洲堅(jiān)果對(duì)高溫比較敏感，但調(diào)控其葉色變黃的分子生理機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

高溫通常會(huì)導(dǎo)致光合機(jī)構(gòu)的損傷^[35]。研究表明，PSⅡ是容易遭受高溫傷害的主要位點(diǎn)，在高溫脅迫下PSⅡ的結(jié)構(gòu)和功能易發(fā)生改變甚至損傷^[36]。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)能夠直接反映PSⅡ的光化學(xué)活性。其中，最大熒光F_m反映PSⅡ的電子傳遞情況，F_m減少表示植物受到光抑制^[37];F_v/F_m是反映PSⅡ最大光化學(xué)效率的參數(shù)，屬于熱敏指標(biāo)^[38]，常作為PSⅡ反應(yīng)中心的探針應(yīng)用于作物的耐熱性評(píng)價(jià)^{[14， 16， 39]}。在葡萄^[40]、芍藥^[10]等作物上的研究表明，高溫脅迫下PSⅡ反應(yīng)中心受損，阻礙了PSⅡ的正常功能，導(dǎo)致電子傳遞效率減弱，進(jìn)而造成光化學(xué)效率下降，表現(xiàn)為F_m、F_v/F_m的降低。當(dāng)遭受嚴(yán)重高溫時(shí)，PSⅡ活性中心受到不可逆損傷，F_o、F_m和F_v/F_m等葉綠素?zé)晒鈪?shù)均發(fā)生明顯降低^{[10， 27]}。本研究中，F_m與F_v/F_m均隨著葉片黃化癥狀的加劇而顯著下降，表明PSⅡ的受損程度不斷加重，熱害程度逐步增強(qiáng)，這可能與其所遭受的高溫時(shí)長(zhǎng)或者強(qiáng)度增加有關(guān)。初始熒光F_o既能夠反映PSⅡ結(jié)構(gòu)的基本狀態(tài)，又可反映類囊體膜的受損程度。盧從明等^[41]認(rèn)為，F_o與葉綠素含量有關(guān)。Tu等^[42]發(fā)現(xiàn)，類囊體膜受損和PSⅡ反應(yīng)中心出現(xiàn)可逆性失活均會(huì)導(dǎo)致F_o升高。本研究結(jié)果表明，輕度黃化葉片的F_o明顯高于全綠葉片，表明輕度黃化葉片的PSⅡ反應(yīng)中心發(fā)生部分失活，這可能與高溫下葉綠素降解或者類囊體結(jié)構(gòu)受損有關(guān)，與前人在柑橘^[43]、芍藥^[10]和葡萄^{[27， 34]}上的研究報(bào)道一致。但是，中度與重度黃化葉片的F_o顯著低于全綠葉片，暗示這兩類黃化葉片的PSⅡ已遭受不可逆破壞，這與朱曉靜等^[33]在中華金葉榆上的研究結(jié)果類似。

高溫脅迫主要通過(guò)產(chǎn)生過(guò)剩激發(fā)能，導(dǎo)致過(guò)量ROS生成，進(jìn)而損傷光系統(tǒng)^[7]，同時(shí)抑制PSⅡ修復(fù)過(guò)程，破壞光合機(jī)構(gòu)，使得植物產(chǎn)生光抑制^[44]。Chen等^[45]認(rèn)為，耐熱型植物可通過(guò)耗散過(guò)剩激發(fā)能來(lái)防止電子傳遞鏈的過(guò)度還原以及PSⅡ中ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)較高的耐熱性。本研究中，H₂O₂與MDA含量均隨著葉片黃化程度的加深而顯著增加，與其F_m、F_v/F_m的變化規(guī)律恰好相反，這說(shuō)明高溫條件下‘HAES344澳洲堅(jiān)果葉片的光合電子傳遞能力減弱與光抑制加劇，使得過(guò)剩激發(fā)能不能夠得到及時(shí)耗散，導(dǎo)致其ROS過(guò)度積累，造成類囊體膜脂過(guò)氧化和PSⅡ氧化損傷，最終引起PSⅡ光化學(xué)活性的喪失。相關(guān)性分析表明，MDA含量與F_m、F_v/F_m間均呈顯著負(fù)相關(guān)，這表明類囊體膜結(jié)構(gòu)破壞與PSⅡ功能受損密切相關(guān)。重度黃化葉片的H₂O₂含量明顯低于中度黃化葉片，這可能與重度黃化葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)與功能遭到不可逆破壞有關(guān)，導(dǎo)致其H₂O₂合成明顯受到抑制，這與葡萄^[36]、小麥^[46]等作物上的報(bào)道一致。劉春英等^[13]研究表明，ROS還可直接氧化損傷其周邊的胡蘿卜素與葉綠素。本研究中，黃化葉片的產(chǎn)生及其癥狀的加劇，可能與ROS引起的葉綠素降解與葉綠體結(jié)構(gòu)解體有關(guān)。

在高溫下，植物會(huì)誘導(dǎo)抗氧化酶系統(tǒng)來(lái)清除過(guò)量的ROS，使植物免受熱脅迫傷害^[47]。SOD、POD和CAT是植物細(xì)胞中清除ROS的主要酶類，其活性的高低對(duì)維持ROS平衡至關(guān)重要。一般認(rèn)為，SOD活性既受超氧陰離子自由基的誘導(dǎo)，又可將它歧化為H₂O₂，但生成的H₂O₂又能誘導(dǎo)POD和CAT活性的提高，并將H₂O₂清除，以避免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。本研究表明，輕度黃化葉片的SOD活性顯著高于全綠葉片，推測(cè)高溫可能導(dǎo)致超氧陰離子自由基在輕度黃化葉片中爆發(fā)，誘導(dǎo)了SOD活性的增強(qiáng);而SOD活性與F_o呈極顯著正相關(guān)，意味著在葉片變黃初期類囊體結(jié)構(gòu)的破壞和葉綠素的降解可能是受到超氧陰離子自由基的毒害所致^[8]。試驗(yàn)結(jié)果表明，在H₂O₂與MDA含量明顯增加的同時(shí)，黃化葉片的POD和CAT活性也相應(yīng)增強(qiáng)，提高了清除H₂O₂的能力，說(shuō)明這兩種細(xì)胞保護(hù)酶在高溫所引起的黃化葉片中起到一定的積極保護(hù)作用。有證據(jù)表明，高溫能鈍化SOD活性^[48]。本研究中，SOD活性隨著葉片黃化程度的加劇而顯著下降，可能與高溫超出了葉片的耐受能力而導(dǎo)致SOD酶活性明顯受抑有關(guān)，這與高溫脅迫下菊花^[48]和蝴蝶蘭^[8]的結(jié)果相一致。然而，POD活性持續(xù)增加，CAT也保持相對(duì)恒定的高活性，這意味著POD與CAT酶蛋白的高溫耐受性可能要比SOD高，也表明POD活性可能是伴隨葉綠體受損程度的加深而被激發(fā)，并與相對(duì)恒定的高活性CAT共同作用，以增強(qiáng)高溫條件下葉片的抗氧化能力，這可以從CAT與POD活性的顯著正相關(guān)關(guān)系中得到反映。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)

收稿日期 ?2020-03-28;修回日期 ?2020-05-21

基金項(xiàng)目 ?滇桂黔石漠化地區(qū)特色作物產(chǎn)業(yè)發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)集成示范項(xiàng)目（No. SMH2019-2021）;國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 31572082）;廣東省科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項(xiàng)資金（No. 2018B020402）。

作者簡(jiǎn)介 ?楊為海（1978—），男，博士，副研究員，研究方向：果樹栽培與生理學(xué)。*通信作者（Corresponding author）：陸超忠（LU Chaozhong），E-mail：lcz.163@163.com。