• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測算紅螯螯蝦實(shí)體組織的細(xì)胞數(shù)量

    2021-05-19 08:53:40鄭在超
    關(guān)鍵詞:血細(xì)胞胰腺基因組

    鄭在超,李 鈁,楊 豐

    (自然資源部第三海洋研究所、海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361005)

    在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究中,細(xì)胞數(shù)量是一個(gè)常用的生理指標(biāo)。例如,在人類疾病研究中,血細(xì)胞數(shù)量被用作貧血和炎癥的指標(biāo)[1],血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞數(shù)目[2]和浸潤在組織中的腫瘤細(xì)胞數(shù)目[3]被作為癌癥檢測的重要指標(biāo)。在微生物研究中,藻類[4]和細(xì)菌[5]的數(shù)量被作為環(huán)境監(jiān)測指標(biāo)。而在水產(chǎn)動(dòng)物的研究中,循環(huán)血細(xì)胞數(shù)量是評(píng)估甲殼動(dòng)物[6]、軟體動(dòng)物[7]、魚類[8]等的免疫狀態(tài)的指標(biāo)。

    細(xì)胞計(jì)數(shù)的常見方法有直接法和間接法。直接法即直接對細(xì)胞群進(jìn)行計(jì)數(shù),例如,血球計(jì)數(shù)板法是將細(xì)胞懸液滴在劃有方格的玻璃上通過鏡檢計(jì)數(shù)[9];連續(xù)稀釋法是將菌液稀釋涂布后對單菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)[10];電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是基于庫爾特計(jì)數(shù)原理,在細(xì)胞通過充滿電解質(zhì)的測定管后,根據(jù)電阻的變化計(jì)算細(xì)胞直徑,最后統(tǒng)計(jì)出給定大小的細(xì)胞數(shù)目[11];流式細(xì)胞儀可以將單個(gè)細(xì)胞一一分開分別測定熒光值等指標(biāo)并進(jìn)行計(jì)數(shù)[12]。間接法中,可以根據(jù)菌液濁度估算細(xì)胞數(shù)量[9];MTT法利用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]被活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶氧化為藍(lán)色的甲臜,再加入二甲基亞砜(DMSO)溶解并測定其光吸收值來估算活細(xì)胞數(shù)量[13]。雖然細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法種類繁多,但是上述方法均不適合用于直接測定實(shí)體組織的細(xì)胞數(shù)。對于實(shí)體組織而言,通常需要利用膠原酶[14]、胰蛋白酶[15],或纖維素酶[16]等將塊狀組織消化為單細(xì)胞懸液再進(jìn)行計(jì)數(shù),而這個(gè)方法也并不適用于所有實(shí)體組織,且操作繁瑣,組織消化的充分程度直接影響準(zhǔn)確性。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time Fluorescence Quantitative PCR, qPCR)可用于定量分析特定基因的拷貝數(shù)[17],因此,這一方法被廣泛用于病毒[18]、細(xì)菌[19]等微生物數(shù)量的測定。雖然這個(gè)方法較少用于動(dòng)植物細(xì)胞計(jì)數(shù),但確有學(xué)者通過qPCR檢測特定基因來評(píng)估血液和組織中某些特殊的細(xì)胞的含量[20]。

    在對螯蝦、對蝦、蟹類等養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物的研究中,研究者多以實(shí)體組織的整體為單位來評(píng)價(jià)病原的感染增殖或分析宿主和病原基因的表達(dá)。實(shí)際上不同組織的細(xì)胞含量存在較大差異,因此,在進(jìn)行組織間比較時(shí),整體組織水平的檢測無法完全反映單細(xì)胞水平的情況。此外,病原感染、外傷等外界刺激也有可能引起實(shí)體組織中細(xì)胞數(shù)量的改變,目前尚未有合適的方法對此進(jìn)行定量分析。

    本研究建立了基于基因拷貝數(shù)的紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)細(xì)胞數(shù)量測定方法。該方法以beta-actin基因?yàn)槟繕?biāo)基因,以已知數(shù)量的血細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)樣,通過qPCR測定實(shí)體組織的細(xì)胞數(shù)量,具有方便快捷和高通量的優(yōu)點(diǎn)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    紅螯螯蝦購自汕頭紀(jì)雄水產(chǎn)有限公司,飼養(yǎng)于25 ℃左右環(huán)境中,隔天喂食換水,實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)一個(gè)月左右,檢測未見蝦類常見病原。

    1.2 基因克隆和測序

    根據(jù)beta-actin(GenBank登錄號(hào): MN396754.1)和GAPDH(GenBank登錄號(hào): KM538172.1)兩個(gè)基因的mRNA序列設(shè)計(jì)引物(表1)。使用天根生化科技(北京)有限公司的海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取螯蝦鰓組織DNA。使用Takara公司的PrimeSTAR HS試劑盒進(jìn)行PCR。PCR程序設(shè)置為98 ℃變性15 s,55 ℃/58 ℃(GAPDH/beta-actin)退火5 s,72 ℃延伸120 s,共25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離,明亮的條帶切膠回收后委托鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。

    1.3 qPCR引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)所獲得的兩個(gè)基因的DNA序列,設(shè)計(jì)qPCR引物(表1),使一對引物中的一條位于內(nèi)含子區(qū),一條位于外顯子區(qū)。

    表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

    1.4 樣品制備

    1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品制備 取3只紅螯螯蝦,分別抽取約2 mL血淋巴;用Orfol公司的Moxi Z細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定血細(xì)胞數(shù)目。從每一份樣品中取5×106個(gè)血細(xì)胞,按“1.2”所述方法提取基因組DNA。然后取相當(dāng)于1×105、1×104、1×103、1×102、1×10個(gè)血細(xì)胞的DNA樣品作為qPCR的標(biāo)準(zhǔn)模板,共有來源于3只不同螯蝦的3組樣品。

    1.4.2 待測樣品制備 取10 mg鰓或肝胰腺組織,按“1.2”所述方法提取基因組DNA,產(chǎn)物用100 μL無菌水溶解,取2 μL (相當(dāng)于0.2 mg組織的DNA)作為qPCR模板。

    1.5 qPCR(染料法)

    使用TOYOBO的SYBR? Green Realtime PCR Master Mix試劑盒和Applied Biosystems StepOneTMqPCR儀。反應(yīng)體系中含DNA模板2 μL,正反向引物(10 μmol/L) 各1 μL,去離子水6 μL,PCR預(yù)混液10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性15 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s,共40個(gè)循環(huán)。

    1.6 擴(kuò)增效率分析

    取3只紅螯螯蝦,按“1.4”所述方法分別制備血細(xì)胞、鰓和肝胰腺組織的基因組DNA樣品。取相當(dāng)于1×105個(gè)血細(xì)胞,或者相當(dāng)于0.2 mg鰓和肝胰腺組織的基因組DNA。每個(gè)樣品制備成:原濃度、10倍稀釋、100倍稀釋、1 000倍稀釋共4個(gè)梯度。對上述樣品進(jìn)行beta-actin基因的qPCR檢測,獲得Ct值,并計(jì)算擴(kuò)增效率和擬合優(yōu)度(R2)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 基因克隆

    通常來說,基因組拷貝數(shù)在同一物種不同組織的體細(xì)胞中是相同的,處于有絲分裂S、 G2、 M期、染色體倍性異常的細(xì)胞,以及多核細(xì)胞等特殊情況除外。因此,通常同等數(shù)量的不同組織細(xì)胞,其某個(gè)基因的拷貝數(shù)是一致的,可以通過對基因的定量來測算細(xì)胞數(shù)。我們選擇了GAPDH、beta-actin這兩個(gè)常見的看家基因作為目標(biāo)基因,根據(jù)其mRNA序列設(shè)計(jì)了引物(表1)。用紅螯螯蝦鰓組織的基因組DNA作為模板分別擴(kuò)增這兩個(gè)基因的DNA序列,均得到了清晰明亮的單一條帶。GAPDH的PCR產(chǎn)物長度約為2 000 bp,beta-actin的PCR產(chǎn)物長度在1 000~2 000 bp之間(圖1)。測序結(jié)果表明GAPDH基因片段長度為2 066 bp (GenBank登錄號(hào): MN918114.1),beta-actin基因片段長度為1 641 bp(GenBank登錄號(hào): MN918115.1),與瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果相符。我們將兩個(gè)基因片段與對應(yīng)的mRNA序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)兩種基因的序列中各含一個(gè)內(nèi)含子,其中GAPDH的內(nèi)含子長654 bp,beta-actin的內(nèi)含子長191 bp。

    圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis analysis of PCR productsM:分子量標(biāo)準(zhǔn); a: beta-actin; b: GAPDH。

    2.2 qPCR的引物設(shè)計(jì)和熔解曲線分析

    根據(jù)獲得的GAPDH和beta-actin基因片段設(shè)計(jì)qPCR引物(表1),其中一條設(shè)計(jì)在外顯子區(qū),另一條設(shè)計(jì)在內(nèi)含子區(qū),使其僅能以基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。其中GAPDH的qPCR產(chǎn)物長100 bp,beta-actin的qPCR產(chǎn)物長56 bp。進(jìn)一步以多個(gè)血細(xì)胞和鰓組織的基因組DNA樣本為模板,對兩個(gè)基因qPCR的熔解曲線進(jìn)行檢測,結(jié)果表明GAPDH的熔解曲線存在雜峰,說明擴(kuò)增產(chǎn)物不均一;而beta-actin的熔解曲線呈現(xiàn)出單峰,沒有非特異性擴(kuò)增,效果較好(圖2)。因此我們選用beta-actin作為qPCR的目標(biāo)基因。

    2.3 beta-actin基因在不同組織中的擴(kuò)增效率分析

    血細(xì)胞是均勻分散的單個(gè)細(xì)胞,可以采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)。成熟血細(xì)胞不具有分裂能力[21],基因組DNA不復(fù)制,因此其目標(biāo)基因的含量可以直接與細(xì)胞數(shù)量對應(yīng)。所以,本研究選擇血細(xì)胞作為細(xì)胞計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品;以血細(xì)胞數(shù)目為基準(zhǔn),用qPCR相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法測算實(shí)體組織的細(xì)胞數(shù)目。在qPCR中,擴(kuò)增效率對于實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。因此,我們以梯度稀釋的鰓、肝胰腺和血細(xì)胞的基因組DNA為模板,測算了beta-actin基因的qPCR擴(kuò)增效率。結(jié)果顯示,以3種組織的基因組DNA為模板,beta-actin基因的擴(kuò)增效率均達(dá)到qPCR要求的90%~110%范圍[22],擴(kuò)增效率基本一致(表2)。因此,利用血細(xì)胞樣品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠用于測算其他組織的細(xì)胞含量。

    2.4 利用qPCR進(jìn)行實(shí)體組織細(xì)胞計(jì)數(shù)

    2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取3只紅螯螯蝦,分別抽取約2 mL血淋巴,用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定血細(xì)胞數(shù)目,提取基因組DNA。取相當(dāng)于1×105、1×104、1×103、1×102、1×10個(gè)血細(xì)胞的DNA樣品作為標(biāo)準(zhǔn)模板,進(jìn)行beta-actin基因的qPCR分析。以血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品的細(xì)胞數(shù)對數(shù)值和所對應(yīng)的Ct值作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,不同批次樣品之間的重復(fù)性良好;在測試范圍內(nèi)(1×10~1×105個(gè)細(xì)胞),qPCR的Ct值與細(xì)胞數(shù)的對數(shù)之間呈良好的線性關(guān)系,線性回歸得到回歸曲線(圖3)和回歸方程Ct=38.30-3.37 lg (N),其中,N是細(xì)胞數(shù)量。此外,測得R2=0.992,擴(kuò)增效率為97.74%。

    圖2 qPCR熔解曲線Fig. 2 qPCR melt curves縱坐標(biāo)中F為熒光強(qiáng)度,T為溫度。

    表2 不同組織樣品的qPCR擴(kuò)增效率分析Tab. 2 qPCR amplification efficiency analysis with different tissue samples

    圖3 qPCR組織細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 qPCR standard curve of cell counting

    2.4.2 實(shí)體組織的細(xì)胞計(jì)數(shù) 取3只螯蝦,分別取10 mg鰓組織和肝胰腺組織,提取基因組DNA。隨后每個(gè)樣品取相當(dāng)于0.2 mg 組織的DNA作為模板進(jìn)行beta-actin基因的qPCR分析。測得0.2 mg鰓組織樣品對應(yīng)的Ct值為22.65~22.96,根據(jù)上述公式計(jì)算可得細(xì)胞數(shù)為3.6×104~4.4×104;0.2 mg肝胰腺組織的Ct值為21.21~21.29,計(jì)算可得細(xì)胞數(shù)為1.1×105~1.2×105。所以鰓組織中平均細(xì)胞含量約為2.0×105個(gè)細(xì)胞/mg,肝胰腺組織中平均細(xì)胞含量約為5.8×105個(gè)細(xì)胞/mg,說明不同組織的細(xì)胞含量存在明顯差異,相同質(zhì)量的鰓組織中的細(xì)胞數(shù)目較少,而肝胰腺組織的細(xì)胞數(shù)較多。而同一組織不同樣本之間的差異較少,鰓組織在1.8×105~2.2×105個(gè)細(xì)胞/mg之間,肝胰腺組織在5.5×105~6.0×105個(gè)細(xì)胞/mg之間。上述結(jié)果表明qPCR相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法能夠有效地測算實(shí)體組織的細(xì)胞數(shù)目(表3)。

    2.5 討論

    本研究建立了基于基因拷貝數(shù)和qPCR的實(shí)體組織細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。利用這一方法,首先可以定量分析螯蝦不同組織在細(xì)胞含量上的差異,加深對不同組織結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)。其次,在對養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物病毒性疾病的研究中,研究者多以實(shí)體組織的整體為單位來評(píng)價(jià)病毒的組織特異性,比較在不同組織中的增殖效率。而病毒是在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖的,同等質(zhì)量的不同組織細(xì)胞含量存在差異。因此以組織質(zhì)量為單位來衡量病毒在某種細(xì)胞中的增殖情況存在一定的不足。通過對特定組織中的病毒量和細(xì)胞數(shù)的定量分析,可以得出平均每個(gè)細(xì)胞的病毒載量,能夠更準(zhǔn)確的了解病毒對不同組織細(xì)胞的嗜性。再次,研究者在分析宿主基因表達(dá)的時(shí)候,也往往以表達(dá)量與組織質(zhì)量的比值作為指標(biāo)。通過對目標(biāo)組織進(jìn)行定量,可以使我們對不同組織基因表達(dá)分析的精度提高到細(xì)胞水平,提升了組織間基因表達(dá)橫向比較的維度。此外,研究表明,甲殼動(dòng)物血細(xì)胞數(shù)量會(huì)受到病原感染、蛻殼周期,晝夜節(jié)律等的影響。實(shí)體組織中的細(xì)胞含量(特別是像鰓這樣包含了許多血細(xì)胞的實(shí)體組織),是否也有可能會(huì)受到上述因素的影響目前尚未可知。本研究所建立的方法為探究這一問題提供了技術(shù)手段。

    表3 鰓和肝胰腺組織細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果Tab. 3 Cell count results of gill and hepatopancreas

    利用本研究所建立的方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),需要注意以下幾點(diǎn):①實(shí)驗(yàn)中所取的樣品量直接影響計(jì)數(shù)結(jié)果,因此每個(gè)組織至少需要取3個(gè)平行樣品以減小取樣不均造成的誤差。②不同基因組DNA提取試劑盒的提取效率不同,在實(shí)驗(yàn)過程中盡量選擇同一種試劑盒。此外,在DNA稀釋的過程中需盡量準(zhǔn)確,避免操作誤差。③qPCR過程中,標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增效率極為重要,首先要保證待測組織和血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率相近,才能對待測組織進(jìn)行測算。如果對于細(xì)胞數(shù)目的測定精度要求較高,可以考慮增加參考基因數(shù)目。除了本實(shí)驗(yàn)提供的beta-actin基因,還可設(shè)計(jì)2~3對其他基因的跨內(nèi)含子、外顯子引物,使用多個(gè)基因進(jìn)行校準(zhǔn)。④由于本方法是基于基因拷貝數(shù)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),因此對處于有絲分裂期的細(xì)胞的測算會(huì)存在一定的偏差。如果組織中處于S和M期的細(xì)胞比例較高,需要根據(jù)比例對細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行一定的校正。此外,多核細(xì)胞無法用本法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

    3 結(jié)論

    綜上所述,本研究建立了基于基因拷貝數(shù)和qPCR的螯蝦實(shí)體組織細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。根據(jù)螯蝦成熟血細(xì)胞不能增殖,且其單細(xì)胞懸液可以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的特點(diǎn),選取已知數(shù)量的血細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)樣。通過熔解曲線分析,選擇了beta-actin基因作為目標(biāo)基因。利用血細(xì)胞基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)模板,進(jìn)行beta-actin基因的qPCR分析;基于細(xì)胞數(shù)和Ct值繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出了細(xì)胞數(shù)量與Ct值的換算公式。并利用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法成功測定了鰓組織和肝胰腺組織的細(xì)胞數(shù)目。該方法具有簡單便捷的優(yōu)點(diǎn),可以實(shí)現(xiàn)對實(shí)體組織細(xì)胞數(shù)量的高通量測定。

    猜你喜歡
    血細(xì)胞胰腺基因組
    牛參考基因組中發(fā)現(xiàn)被忽視基因
    同時(shí)多層擴(kuò)散成像對胰腺病變的診斷效能
    施氏魮(Barbonymus schwanenfeldii)外周血液及造血器官血細(xì)胞發(fā)生的觀察
    血細(xì)胞分析中危急值的應(yīng)用評(píng)價(jià)
    沙塘鱧的血細(xì)胞分析
    全血細(xì)胞分析儀配套操作臺(tái)使用體會(huì)
    哪些胰腺“病變”不需要外科治療
    18例異位胰腺的診斷與治療分析
    基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
    有趣的植物基因組
    午夜福利乱码中文字幕| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久免费观看电影| 精品国产一区二区久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 考比视频在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 久久久精品94久久精品| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲成人免费av在线播放| 岛国毛片在线播放| 中文欧美无线码| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲成人手机| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 成人手机av| 啦啦啦在线观看免费高清www| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲九九香蕉| 各种免费的搞黄视频| 日日爽夜夜爽网站| 免费在线观看影片大全网站 | 国产成人免费观看mmmm| 一本久久精品| 国产在线观看jvid| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品免费大片| 久久精品久久精品一区二区三区| 水蜜桃什么品种好| 成人午夜精彩视频在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 最黄视频免费看| 亚洲免费av在线视频| av一本久久久久| 久久久久久久久免费视频了| 久久国产精品影院| 1024香蕉在线观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产片内射在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 尾随美女入室| 亚洲熟女精品中文字幕| 日日爽夜夜爽网站| av在线app专区| 视频区欧美日本亚洲| 国产熟女午夜一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 蜜桃国产av成人99| 国产精品九九99| 日本午夜av视频| 脱女人内裤的视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 看十八女毛片水多多多| 精品国产乱码久久久久久小说| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲三区欧美一区| 国产在线视频一区二区| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 手机成人av网站| 午夜影院在线不卡| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品日本国产第一区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 夫妻性生交免费视频一级片| 各种免费的搞黄视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| av线在线观看网站| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 两个人免费观看高清视频| 女人久久www免费人成看片| 日本色播在线视频| 一级毛片女人18水好多 | 99久久精品国产亚洲精品| 中文字幕av电影在线播放| 热re99久久精品国产66热6| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 99香蕉大伊视频| 91精品国产国语对白视频| 久久久久久久国产电影| 丝袜美腿诱惑在线| 国产成人啪精品午夜网站| 啦啦啦在线免费观看视频4| 99国产精品一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 热re99久久国产66热| 美国免费a级毛片| 男女国产视频网站| 制服人妻中文乱码| 91老司机精品| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品一区二区在线不卡| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 丰满饥渴人妻一区二区三| 五月天丁香电影| 久久久久网色| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲欧美激情在线| 激情视频va一区二区三区| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲三区欧美一区| www.自偷自拍.com| 亚洲第一青青草原| 成年人黄色毛片网站| av天堂久久9| 亚洲精品在线美女| 90打野战视频偷拍视频| 国产亚洲欧美精品永久| 一级黄片播放器| 1024香蕉在线观看| 极品人妻少妇av视频| 咕卡用的链子| 亚洲视频免费观看视频| 日本一区二区免费在线视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲成人国产一区在线观看 | 久热爱精品视频在线9| 两个人免费观看高清视频| 国产黄频视频在线观看| 9191精品国产免费久久| 两个人免费观看高清视频| 久久精品亚洲av国产电影网| netflix在线观看网站| 97在线人人人人妻| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产xxxxx性猛交| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产野战对白在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| xxxhd国产人妻xxx| 欧美av亚洲av综合av国产av| 一区二区三区精品91| av国产精品久久久久影院| 好男人电影高清在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 狂野欧美激情性xxxx| 手机成人av网站| 亚洲av美国av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 女性被躁到高潮视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲成人国产一区在线观看 | 国产又爽黄色视频| 制服诱惑二区| 大片免费播放器 马上看| 国产免费又黄又爽又色| 成人黄色视频免费在线看| 男男h啪啪无遮挡| 午夜影院在线不卡| 精品熟女少妇八av免费久了| a级毛片黄视频| 亚洲第一青青草原| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲精品第二区| 在线精品无人区一区二区三| 久久久国产一区二区| 麻豆乱淫一区二区| 叶爱在线成人免费视频播放| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 成人免费观看视频高清| 丝袜人妻中文字幕| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 只有这里有精品99| 婷婷丁香在线五月| 男男h啪啪无遮挡| av在线app专区| 女人久久www免费人成看片| 日韩伦理黄色片| 欧美久久黑人一区二区| 黄色视频在线播放观看不卡| 丝瓜视频免费看黄片| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产日韩欧美视频二区| 麻豆av在线久日| 国产精品一国产av| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 少妇 在线观看| 亚洲成人免费av在线播放| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久九九热精品免费| 国产免费一区二区三区四区乱码| kizo精华| 少妇人妻久久综合中文| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 一本色道久久久久久精品综合| 97精品久久久久久久久久精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品一区在线观看国产| 国产成人欧美| 精品免费久久久久久久清纯 | 色94色欧美一区二区| 色综合欧美亚洲国产小说| 丰满饥渴人妻一区二区三| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久精品免费免费高清| 日本一区二区免费在线视频| 午夜两性在线视频| 亚洲七黄色美女视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产一区二区三区av在线| 国产精品久久久久成人av| a级片在线免费高清观看视频| 一区二区av电影网| 亚洲熟女毛片儿| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产高清videossex| 好男人电影高清在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产av国产精品国产| 在线观看一区二区三区激情| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲五月色婷婷综合| 久久久国产精品麻豆| 日韩av免费高清视频| 免费在线观看影片大全网站 | 午夜91福利影院| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品久久久久久电影网| 超碰97精品在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 91老司机精品| 国产欧美日韩一区二区三 | 日韩av免费高清视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 制服诱惑二区| 国产精品99久久99久久久不卡| 黄色视频不卡| 欧美精品av麻豆av| 精品一区二区三卡| 国产成人91sexporn| 国产亚洲av高清不卡| 免费高清在线观看日韩| 丁香六月欧美| 亚洲第一青青草原| 久久久精品94久久精品| 男人添女人高潮全过程视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品国产av成人精品| 男女床上黄色一级片免费看| 多毛熟女@视频| 久久久久久人人人人人| 久久99精品国语久久久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 日日爽夜夜爽网站| 91精品三级在线观看| 国产精品免费大片| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 99香蕉大伊视频| 久久国产精品影院| 欧美在线一区亚洲| 我要看黄色一级片免费的| 成年人免费黄色播放视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产免费又黄又爽又色| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 热re99久久精品国产66热6| 欧美在线一区亚洲| 老司机亚洲免费影院| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲五月色婷婷综合| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 丝袜美足系列| 国产一区二区激情短视频 | 在线观看www视频免费| 欧美xxⅹ黑人| 我要看黄色一级片免费的| 国产欧美亚洲国产| 久久久久久久精品精品| 亚洲精品一二三| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美在线黄色| 99久久精品国产亚洲精品| 免费在线观看影片大全网站 | 亚洲中文日韩欧美视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久9热在线精品视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 久久99精品国语久久久| 99热全是精品| 国产成人影院久久av| 老司机影院成人| 国产精品av久久久久免费| 久久99热这里只频精品6学生| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久精品94久久精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产成人系列免费观看| 女人精品久久久久毛片| 丁香六月天网| 首页视频小说图片口味搜索 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日本五十路高清| 一区在线观看完整版| 亚洲三区欧美一区| 一区二区三区精品91| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| www日本在线高清视频| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 一本综合久久免费| 免费观看人在逋| netflix在线观看网站| 美女高潮到喷水免费观看| 国产一区二区 视频在线| 成年动漫av网址| 少妇人妻 视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产一卡二卡三卡精品| 国产伦人伦偷精品视频| svipshipincom国产片| 一区二区三区激情视频| 视频在线观看一区二区三区| 久久ye,这里只有精品| 亚洲图色成人| a级毛片在线看网站| 美女福利国产在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 在线精品无人区一区二区三| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美国产精品va在线观看不卡| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日本色播在线视频| 一本大道久久a久久精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 午夜激情av网站| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 午夜免费观看性视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 2021少妇久久久久久久久久久| 蜜桃在线观看..| 视频区图区小说| 在线观看www视频免费| 一区二区三区精品91| 欧美成人午夜精品| 成年人黄色毛片网站| 在线观看www视频免费| 亚洲五月婷婷丁香| 黄色 视频免费看| 久久九九热精品免费| 亚洲精品在线美女| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 18禁观看日本| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产男人的电影天堂91| 久久狼人影院| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产又色又爽无遮挡免| 人人澡人人妻人| 尾随美女入室| 日日夜夜操网爽| 国产一区二区激情短视频 | 嫩草影视91久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲专区中文字幕在线| 久久这里只有精品19| 午夜免费成人在线视频| 精品久久蜜臀av无| h视频一区二区三区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 免费少妇av软件| xxx大片免费视频| 国产精品久久久av美女十八| 午夜久久久在线观看| 一区福利在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 黄片小视频在线播放| 国产精品一区二区在线不卡| 久久久久精品人妻al黑| 高清不卡的av网站| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 久热爱精品视频在线9| 18在线观看网站| 一级黄片播放器| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产成人欧美| 性少妇av在线| 国产成人系列免费观看| 欧美另类一区| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 久久亚洲国产成人精品v| 久久久久久久久免费视频了| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一本久久精品| 伊人亚洲综合成人网| 欧美精品亚洲一区二区| 日本av免费视频播放| 亚洲国产成人一精品久久久| 七月丁香在线播放| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品欧美亚洲77777| 国产av一区二区精品久久| 国产视频首页在线观看| 在线天堂中文资源库| 国产成人精品久久二区二区免费| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 美女视频免费永久观看网站| 午夜老司机福利片| 国产免费又黄又爽又色| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲国产最新在线播放| 精品福利永久在线观看| 在线观看www视频免费| 在线观看免费午夜福利视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产精品免费大片| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲精品av麻豆狂野| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 婷婷色综合www| 男的添女的下面高潮视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 999久久久国产精品视频| 两人在一起打扑克的视频| 国产成人系列免费观看| 中文字幕最新亚洲高清| 久久鲁丝午夜福利片| 精品少妇内射三级| 99国产精品一区二区蜜桃av | 精品国产乱码久久久久久小说| 午夜91福利影院| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲中文字幕日韩| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产精品 欧美亚洲| 欧美黑人欧美精品刺激| 精品少妇内射三级| 交换朋友夫妻互换小说| 婷婷成人精品国产| 精品久久久久久电影网| 国产主播在线观看一区二区 | 国产精品国产av在线观看| 一级毛片女人18水好多 | 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产三级黄色录像| 一本大道久久a久久精品| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品久久久久久精品古装| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产一区有黄有色的免费视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 美女高潮到喷水免费观看| 老司机深夜福利视频在线观看 | 黑人猛操日本美女一级片| www.999成人在线观看| 久久精品国产综合久久久| 亚洲黑人精品在线| 欧美 日韩 精品 国产| 成人国产av品久久久| 亚洲专区国产一区二区| 在线观看免费午夜福利视频| 国产又爽黄色视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 免费高清在线观看日韩| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 成人手机av| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲七黄色美女视频| 又紧又爽又黄一区二区| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产免费又黄又爽又色| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 天天添夜夜摸| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 少妇人妻 视频| 青春草视频在线免费观看| 午夜免费鲁丝| 日本a在线网址| 国产成人av激情在线播放| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 少妇 在线观看| 国产成人av教育| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲精品一二三| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 一个人免费看片子| 中文欧美无线码| 男男h啪啪无遮挡| 午夜福利一区二区在线看| 日韩av免费高清视频| 久久亚洲精品不卡| 多毛熟女@视频| 国产主播在线观看一区二区 | 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美在线黄色| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一区二区日韩欧美中文字幕| 精品一区在线观看国产| a级片在线免费高清观看视频| 国产精品一区二区免费欧美 | 丝袜美腿诱惑在线| 不卡av一区二区三区| 欧美在线一区亚洲| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 男人舔女人的私密视频| 操美女的视频在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一级片'在线观看视频| 午夜福利一区二区在线看| 9色porny在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产免费视频播放在线视频| 成在线人永久免费视频| 国产精品久久久久成人av| 中文字幕制服av| 国产成人影院久久av| 多毛熟女@视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 中文字幕亚洲精品专区| 在线观看免费日韩欧美大片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 成人国语在线视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品欧美亚洲77777| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲情色 制服丝袜| 国产在线免费精品| 一级毛片我不卡| 国产成人精品久久久久久| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲av国产av综合av卡| 美女视频免费永久观看网站| 国产一区二区在线观看av| 国产日韩欧美在线精品| 欧美另类一区| 久久久久精品人妻al黑| 丝袜美足系列| 在线看a的网站| 麻豆乱淫一区二区| 欧美日韩福利视频一区二区| av线在线观看网站| 777米奇影视久久| av视频免费观看在线观看| 午夜免费鲁丝| 国产男女超爽视频在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 超色免费av| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 两人在一起打扑克的视频| h视频一区二区三区| 国产成人av激情在线播放| 久久国产精品大桥未久av| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看 | 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| www.精华液| 国产高清不卡午夜福利| 欧美亚洲日本最大视频资源| 夫妻午夜视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 男女国产视频网站| 51午夜福利影视在线观看| 悠悠久久av| 国产人伦9x9x在线观看| 男女免费视频国产| 亚洲精品一区蜜桃| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲av国产av综合av卡| 日本欧美视频一区| 午夜日韩欧美国产|