預(yù)處理方式對鳙魚骨蛋白酶解液游離氨基酸和揮發(fā)性成分的影響

董 燁，張益奇,2,3,*，姚洪正，何光喜，戴志遠(yuǎn),2,3,*

（1.浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310035；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 杭州 310035；3.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116000；4.杭州千島湖發(fā)展集團(tuán)有限公司，浙江 杭州 311701）

鳙魚（Aristichthys nobilis）為我國著名的“四大家魚”之一，其繁殖速度快，產(chǎn)量大。鳙魚頭因其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛[1]。由于對鳙魚頭的需求不斷增長，在加工過程中產(chǎn)生了大量的魚鱗、魚骨及魚皮等副產(chǎn)物。其中，魚骨富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、鈣、磷等營養(yǎng)成分[2]，但由于我國目前對魚骨的開發(fā)研究較為落后，其通常被直接丟棄，造成資源浪費及環(huán)境污染。因此，豐富魚骨蛋白資源的高值化利用，具有一定的研究意義。

蛋白質(zhì)酶解技術(shù)反應(yīng)條件溫和，較為安全，近年來被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)蛋白資源的開發(fā)利用[3]。但是魚骨結(jié)構(gòu)堅固，因此直接酶解效率低，所需時間長。研究發(fā)現(xiàn)，適度熱處理可以使蛋白質(zhì)的剛性結(jié)構(gòu)柔性化，從而利于蛋白的提取或酶解，提高酶解效率[4]。Fan Weiwei等[5]采用熱處理技術(shù)將虹鱒魚骨于121 ℃處理30 min提取魚骨蛋白進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解效率最高，其水解度可達(dá)15.03%，水解過程中氣味發(fā)生了變化，酶解液中共檢測到18 種游離氨基酸和71 種揮發(fā)性成分。Tan Xiaoyi等[6]將鱈魚骨于121 ℃處理90 min，對所得魚骨蛋白進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)酶解液具有較好的營養(yǎng)價值。近年來，汽爆處理作為一種綠色高效的物理化學(xué)預(yù)處理方法，廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)原料的預(yù)處理。其基于短時高溫高壓蒸煮，高壓蒸汽進(jìn)入原料內(nèi)部空隙，然后瞬間泄壓，將蒸汽內(nèi)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能并作用于物料，使物料充分解離[7]。目前，汽爆技術(shù)在預(yù)處理動物材料方面，尤其是處理堅硬骨質(zhì)方面的研究，得到越來越廣泛的關(guān)注。采用汽爆技術(shù)處理動物骨，使其在高溫條件下發(fā)生軟化，在飽和水蒸汽作用下，骨質(zhì)被潤脹，孔隙中充滿蒸汽，當(dāng)瞬間泄壓時，介質(zhì)急劇膨脹，水蒸氣進(jìn)行絕熱膨脹做功，蒸汽內(nèi)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能作用于骨質(zhì)層間，骨質(zhì)解離內(nèi)部膠原蛋白發(fā)生裂解，骨質(zhì)內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)流出，同時酶切位點暴露，提高酶解效率。張?zhí)禊i等[8]采用汽爆技術(shù)處理雞骨，當(dāng)壓力2.4 MPa、保壓時間680 s時，可以較好地提取雞骨架中的營養(yǎng)物質(zhì)。Shen Qingshan等[9]發(fā)現(xiàn)采用汽爆技術(shù)液化雞胸骨軟骨，可以用于硫酸軟骨素的分離，并取得了較好的效果。涂丹等[10]采用汽爆輔助酶解魚皮制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽，經(jīng)0.6 MPa/0.5 min汽爆處理的魚皮，水解度比未處理組提高了1.8 倍，ACE抑制率比未處理組提高了27.14%。但目前，汽爆預(yù)處理魚骨對酶解液游離氨基酸和揮發(fā)性成分的影響仍鮮見報道。

本實驗采用胰蛋白酶對經(jīng)汽爆水提處理和熱處理的2 種魚骨蛋白進(jìn)行酶解，對所得2 種酶解液中游離氨基酸、揮發(fā)性物質(zhì)及分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，旨在為提高魚骨資源利用率及其應(yīng)用領(lǐng)域提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳙魚魚骨 杭州千島湖發(fā)展集團(tuán)有限公司；氫氧化鈉、胰蛋白酶、甲醛（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳酸酐酶（29 kDa）、細(xì)胞色素C（12.4 kDa）、抑肽酶（6.5 kDa）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-histidyl-leucine，HHL）（429 Da）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QBS 200B汽爆機(jī) 正道生物能源公司；MLS-3781L高壓滅菌鍋 日本Panasonic公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷涂層萃取頭 美國Supelco公司；7890A氣相色譜儀 美國Agilent公司；Trace GC Ultra氣相色譜-DSQ II質(zhì)譜聯(lián)用儀、Fresco 21冷凍高速離心機(jī) 美國Thermo Fisher Scientific公司；S-433D全自動氨基酸分析儀 德國Sykam公司；e2695高效液相色譜 美國Waters公司；400Y多功能粉碎機(jī)永康市鉑歐五金制品有限公司；DGG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；K-360凱氏定氮儀、K-425快速消解儀 瑞士Büchi公司。

1.3 方法

1.3.1 汽爆處理

新鮮魚骨用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡4 h，每2 h換一次溶液，除去雜蛋白，流水沖至中性，瀝干備用。取200 g斬碎至6 cm左右的魚骨置于預(yù)熱好的汽爆機(jī)內(nèi)，于0.6 MPa保壓2 min，然后在0.1 s內(nèi)瞬間泄壓，將樣品噴至接收器中，收集汽爆后的樣品粉碎至40 目左右后，于60 ℃水中攪拌使骨蛋白溶于水中，過濾去除骨殘渣，收集濾液為得到的魚骨蛋白提取溶液，冷凍干燥。

1.3.2 熱處理

將魚骨斬碎至0.5 cm左右的骨塊，按料液比1∶3（g/mL）加入蒸餾水，121 ℃提取70 min，過濾去除骨殘渣，收集濾液冷凍干燥。

1.3.3 酶解液的制備

取魚骨蛋白的凍干粉配制成3 g/100 mL的魚骨蛋白溶液，維持溶液pH值為8，酶解溫度為37 ℃，酶比底1∶50（m/m），加入胰蛋白酶，酶解3 h后，于沸水浴中滅酶10 min，8 000 r/min離心15 min，得到2 種酶解物上清液（汽爆預(yù)處理魚骨蛋白酶解液記為SFBPH，熱預(yù)處理組魚骨蛋白酶解液記為HFBPH）。

1.3.4 水解度測定

采用甲醛滴定法[11]，按下式計算：

1.3.5 游離氨基酸測定及滋味貢獻(xiàn)評價

游離氨基酸采用氨基酸自動分析儀進(jìn)行測定，分別統(tǒng)計總游離氨基酸、必需氨基酸和呈味氨基酸的含量。滋味貢獻(xiàn)評價采用呈味強(qiáng)度值（taste activity value，TAV），即某一呈味物質(zhì)的濃度與其閾值的比值[12]。

1.3.6 揮發(fā)性成分分析

固相微萃取條件：將2 mL酶解液置于頂空瓶中，然后將密封小瓶在50 ℃下保溫10 min。并將活化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入進(jìn)樣瓶頂空部分，60 ℃吸附30 min，取出后插入氣相色譜進(jìn)樣口，250 ℃解吸3 min。

氣相色譜條件：TR-35 MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度35 ℃，保持3 min，以2.5 ℃/min升至70 ℃，再以8 ℃/min升至150 ℃，最后以20 ℃/min的速率上升到230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：檢測器溫度280 ℃；離子源溫度200 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z30～500。

1.3.7 分子質(zhì)量分布

參照Zhang Yiqi等[13]的方法。采用Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)和紫外-可見檢測器，檢測波長220 nm，色譜柱為G2000 SWxl（7.8 mm×300 mm），流動相A為乙腈，流動相B為0.1%三氟乙酸溶液，45% A、55% B等度洗脫，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，時間30 min。分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為：HHL（429 Da）、抑肽酶（6 500 Da）、細(xì)胞色素C（12 400 Da）、碳酸酐酶（29 000 Da）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

酶解液中揮發(fā)性成分通過NIST 2.0譜庫進(jìn)行定性分析，且僅當(dāng)正反匹配度均大于800（最大值為1 000）的鑒定結(jié)果予以保留。采用OriginPro 2018繪圖，SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及顯著性檢驗，P＜0.05，差異顯著，實驗重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度分析

圖1 預(yù)處理對魚骨蛋白酶解液水解度的影響Fig. 1 Effects of different pretreatments on the hydrolysis degree of fish bone protein hydrolysates

魚骨汽爆水提處理后所得凍干粉蛋白質(zhì)得率為11.83%，而熱處理后蛋白質(zhì)得率為8.57%，這可能是汽爆處理使膠原蛋白鏈展開，在60 ℃水提作用下，促進(jìn)魚骨蛋白的溶出。采用胰蛋白酶對這2 種凍干粉酶解3 h，如圖1所示，HFBPH的水解度為20.59%，SFBPH的水解度為24.85%，高于HFBPH，這可能是在汽爆作用下，魚骨膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)破壞程度大，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏展，部分蛋白直接降解為小分子物質(zhì)，暴露出更多酶切位點，更易于酶切，水解度增大，酶解效率高。后續(xù)可對經(jīng)汽爆處理后的魚骨表面黏液測定其分子質(zhì)量，驗證魚骨膠原蛋白經(jīng)汽爆處理后發(fā)生了降解。

2.2 酶解液游離氨基酸分析

由表1可知，2 種酶解液中均檢測出20 種游離氨基酸，SFBPH總游離氨基酸質(zhì)量濃度為28.36 mg/mL，是HFBPH（21.78 mg/mL）的1.3 倍，其中亮氨酸在2 種酶解液中的含量最高，分別占總游離氨基酸的25.07%和18.45%。其次為賴氨酸，分別占總游離氨基酸的15.83%和13.91%，均為苦味氨基酸。游離氨基酸對酶解液的整體風(fēng)味影響較大，是重要的滋味物質(zhì)，也是香味的前體物質(zhì)。每種氨基酸的結(jié)構(gòu)特性不同，產(chǎn)生了其獨特的口味特征，根據(jù)氨基酸的呈味特性，分為鮮味、甜味、苦味3 種[14]。SFBPH和HFBPH中呈味氨基酸含量豐富，分別占總游離氨基酸的78.70%和78.60%，其中疏水性氨基酸分別占54.78%和56.06%，游離氨基酸的呈味特性與氨基酸的疏水性大小有關(guān)，當(dāng)疏水性大時主要呈苦味，疏水性小時主要呈甜味。

表1 2 種魚骨蛋白酶解液中游離氨基酸分類及含量Table 1 Composition and contents of free amino acids in two fish bone protein hydrolysates

表2 2 種魚骨蛋白酶解液中呈味游離氨基酸TAVTable 2 Taste activity values of free amino acids in two fish bone protein hydrolysates

TAV大于1時，表示該物質(zhì)對樣品的呈味有貢獻(xiàn)，值越大其貢獻(xiàn)越大，當(dāng)TAV小于1時，該物質(zhì)對樣品的呈味無貢獻(xiàn)[15]。表2對SFBPH和HFBPH的呈味氨基酸TAV進(jìn)行比較。鮮味氨基酸中，2 種酶解液的谷氨酸TAV均大于1，且在SFBPH中稍高于HFBPH，表明SFBPH鮮味較HFBPH突出。天冬氨酸的TAV均小于1，對酶解液鮮味貢獻(xiàn)較小，谷氨酸對魚骨酶解液鮮味的貢獻(xiàn)大于天冬氨酸。SFBPH和HFBPH中甜味氨基酸分別占總游離氨基酸的10.22%和10.05%，2 種酶解液中甜味氨基酸的TAV均較低，說明甜味在魚骨酶解液的滋味中體現(xiàn)較少。2 種酶解液中纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸這3 種苦味氨基酸的TAV均小于1，研究發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸和酪氨酸等苦味氨基酸，當(dāng)其含量低于呈味閾值時，可增加其他氨基酸的鮮味和甜味[16]。SFBPH和HFBPH中苦味氨基酸TAV大于1的共有5 種，分別為亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、甲硫氨酸和精氨酸。TAV最高的苦味氨基酸分別是賴氨酸和甲硫氨酸。HFBPH中甲硫氨酸TAV高達(dá)8.80，SFBPH中甲硫氨酸TAV為5.29。甲硫氨酸這類含硫氨基酸對熟肉香味的形成具有重要貢獻(xiàn)[17]。在SFBPH中精氨酸TAV大于1，精氨酸雖顯苦味，但有增加呈味復(fù)雜性和提高鮮度的作用[18]。SFBPH和HFBPH的苦味氨基酸含量較高，在總游離氨基酸中百分比分別為64.88%和64.23%，2 種酶解液的整體風(fēng)味以苦味為主，如何脫苦改善酶解液風(fēng)味，是亟待解決的問題。

2.3 固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜分析

圖2 2 種魚骨蛋白酶解液中揮發(fā)性物質(zhì)含量和組成Fig. 2 Contents of various classes of volatile substances in two fish bone protein hydrolysates

如圖2所示，實驗測得含量較多的物質(zhì)是烴類和醛類，SFBPH和HFBPH中烴類和醛類物質(zhì)之和，分別占總揮發(fā)性物質(zhì)的44.69%和21.2%。在SFBPH中醛類、烴類、酮類和雜環(huán)類的相對含量高于HFBPH，而醇類、酸類和酯類的相對含量低于HFBPH，這可能較長的熱處理過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)或氨基酸的熱分解反應(yīng)。表3列出了2 種酶解液中的各自含有的揮發(fā)性化合物，共檢測出77 種。其中SFBPH揮發(fā)性化合物數(shù)量最多達(dá)61 種，而HFBPH為47 種，其中共有成分有31 種。

表3 2 種魚骨蛋白酶解液的揮發(fā)性成分組成Table 3 Compositions of volatile components in two fish bone protein hydrolysates

續(xù)表3

烴類物質(zhì)主要是烷烴類和烯烴類。烴類物質(zhì)閾值相對較高，對酶解液的整體風(fēng)味作用不大[19]，其主要是源于脂肪酸烷氧自由基的裂解。而當(dāng)存在支鏈烷烴、芳香烴和烯烴時，可能對酶解液的風(fēng)味有一定的貢獻(xiàn)[20]。由表3可知，SFBPH中烴類物質(zhì)主要有十七烷、十八烷和(Z)-3-十七烯，HFBPH中主要有十七烷和十八烷。SFBPH中烴類物質(zhì)相對含量高于HFBPH，可能與其水解度較高有關(guān)。芳香烴可能由芳香族的游離氨基酸氧化產(chǎn)生，酶解液中還檢測到的對二甲苯和萘等芳香烴化合物會導(dǎo)致酶解液異味的產(chǎn)生，可能與魚類生長環(huán)境受到污染有關(guān)[21-22]。

SFBPH和HFBPH中共檢測出8 種雜環(huán)類化合物，主要有呋喃、吡啶和噻唑，其中SFBPH中檢測出的雜環(huán)化合物相對含量稍高，而HFBPH中檢測出的雜環(huán)化合物種類相對較多。雜環(huán)類化合物一般閾值較低，對酶解液整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。呋喃類主要是氨基酸的熱分解、脂肪氧化和美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，通常具有很強(qiáng)的肉香味，可以起到一定的增香作用，如2-戊基呋喃具有類似火腿的香味[23]。此外，2 種酶解液中還檢測到少量酸類、酯類和酚類物質(zhì)。酸類物質(zhì)的閾值很高，對酶解液的風(fēng)味影響不大。酚類相對含量低，對酶解液的整體風(fēng)味影響不大，酯類通常具有果香和清香氣味，與酮類共存時對酶解液的風(fēng)味有協(xié)調(diào)和平衡的作用[24]。

醛類是酶解液主要的揮發(fā)性物質(zhì)之一，2 種酶解液中共檢測出17 種醛類物質(zhì)。其中SFBPH中共檢出16 種醛類化合物，相對含量為15.63%，相對含量較高的有壬醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-2-癸烯醛、2,4-二甲基苯甲醛、十二醛。HFBPH中共檢測出11 種，相對含量為4.11%，相對含量較高的有2,5-二甲基苯甲醛和壬醛。SFBPH中醛類的揮發(fā)性成分相對含量高于HFBPH。醛類物質(zhì)主要源于氨基酸的Strecker降解反應(yīng)或脂肪的氧化，其碳原子個數(shù)為6～9的醛具有果香、清香和脂肪香味[25]，閾值較低，具有與其他物質(zhì)重疊的風(fēng)味效應(yīng)，對酶解液的整體風(fēng)味特征具有貢獻(xiàn)[26]。壬醛具有油脂和甜橙氣息，己醛通常產(chǎn)生一種原生味、鮮香和類醛的特征香味，相對含量較高時，具有青草味-脂肪味，(E)-2-辛烯醛呈脂肪味[27]，(E,Z)-2,6-壬二烯醛是產(chǎn)生魚腥味的主要化合物[28]，苯甲醛具有強(qiáng)烈的堅果香，在SFBPH中相對含量較高。

2 種酶解液中酮類物質(zhì)和醇類物質(zhì)相對含量和種類較少。在SFBPH中檢測到4 種酮類，含量稍高的是2,3-辛二酮，其具有強(qiáng)烈的奶油味，是新鮮水產(chǎn)品的重要風(fēng)味物質(zhì)[29]。2-壬酮具有水果香和花香。酮類物質(zhì)閾值一般高于醛類，但其具有特殊的花香、清香和水果香，對酶解液的風(fēng)味形成具有一定作用。醇類主要來源于氨基酸和糖的還原、脂肪酸酶促氧化和醛類物質(zhì)等[30]，其中HFBPH中醇類物質(zhì)相對含量高于SFBPH。醇類物質(zhì)一般具有獨特的花香、果香、清香和甜味等令人愉悅的風(fēng)味。2 種酶解液中共檢測到9 種醇類物質(zhì)，主要是飽和醇類。飽和醇類的閾值較高，對酶解液風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。

2.4 酶解液分子質(zhì)量分布

進(jìn)一步測定2 種魚骨蛋白酶解液分子質(zhì)量分布。以分子質(zhì)量的對數(shù)（lgM）為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)品保留時間（t）為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線lgM=-0.209t＋6.992，決定系數(shù)R2為0.991 3，根據(jù)回歸方程計算出樣品分子質(zhì)量在各范圍的分布情況，將主要分子質(zhì)量分布分為3 個部分：大于1 000、1 000～500 Da和小于500 Da。由表4、圖3可知，SFBPH分子質(zhì)量更小，小于1 000 Da的小分子占73.78%，其中小于500 Da的占35.59%，HFBPH中分子質(zhì)量小于500 Da的占29%，說明經(jīng)汽爆預(yù)處理的魚骨蛋白酶解更徹底。

表4 2 種魚骨蛋白酶解液分子質(zhì)量分布情況Table 4 Relative molecular mass distribution of two fish bone protein hydrolysates

圖3 酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布色譜圖Fig. 3 Chromatograms showing the relative molecular mass distribution of two fish bone protein hydrolysates

3 結(jié) 論

研究汽爆和熱處理2 種不同預(yù)處理方式對魚骨蛋白酶解液游離氨基酸和揮發(fā)性成分的影響。結(jié)果表明，經(jīng)胰蛋白酶酶解3 h后，SFBPH的水解度為24.85%，高于HFBPH（20.59%），2 種酶解液中分子質(zhì)量分布小于1 000 Da的小分子分別占73.78%和66.56%。SFBPH中游離氨基酸總量達(dá)到28.36 mg/mL，是HFBPH的1.3 倍，SFBPH中TAV最大的為賴氨酸，HFBPH中TVA最大的為甲硫氨酸。SFBPH和HFBPH中呈苦味氨基酸分別占總氨基酸的64.88%和64.23%，可見2 種酶解液整體滋味以苦味為主，如何脫苦是需要解亟待解決的問題。固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜共鑒定出77 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，SFBPH中共檢測出61 種揮發(fā)性化合物，HFBPH中檢測出47 種，其中烴類和醛類物質(zhì)最豐富。SFBPH中酮類、醛類、烴類和雜環(huán)類物質(zhì)相對含量高于HFBPH，而在HFBPH中雜環(huán)類種類較多，酸類和酯類物質(zhì)相對含量高于SFBPH。