臘肉拮抗菌分離及抗真菌脂肽特性分析

高兆建，秦宸鍇，黃亮浩，朱 雙，朱勁虎，趙宜峰

（1.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.長(zhǎng)江桂柳食品睢寧有限公司，江蘇 徐州 221000）

隨著全球?qū)κ称钒踩娜找嬷匾?，食品防腐劑作為一種食品工業(yè)中重要的添加劑逐漸得到廣泛關(guān)注。為防止食品腐敗變質(zhì)延長(zhǎng)貨架期，向加工食品中添加防腐劑是最常用的方法。食品防腐劑按來(lái)源分為化學(xué)合成防腐劑和天然防腐劑，其中化學(xué)防腐劑如亞硝酸鈉、苯甲酸鈉、苯甲酸等使用最多。然而，化學(xué)防腐劑存在潛在危害。發(fā)掘并使用天然無(wú)毒的抗菌劑是目前研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，抗菌脂肽作為一種天然抗菌物質(zhì)，有望成為化學(xué)防腐劑的理想替代品。

芽孢桿菌屬菌株是一類分布廣泛并能在極端環(huán)境下生存的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[1]，可以分泌多種抗菌活性的環(huán)狀脂肽。它們通過(guò)非核糖體基因編碼多酶復(fù)合催化合成，包括表面活性素[2]、伊枯草菌素（Iturin）[3]、芬芥素[4]和庫(kù)斯塔克素[5]4 大類。其中伊枯草菌素家族成員包括伊枯草菌素A、B、C、D、E，芽孢菌素D、F、L以及抗霉枯草菌素等，它們都是由7 個(gè)氨基酸殘基組成的一個(gè)肽環(huán)和連接一個(gè)C14～C17的β-氨基脂肪酸組成，其主要通過(guò)離子空隙進(jìn)行滲透干擾。抑菌方面，對(duì)病原真菌的作用較強(qiáng)，對(duì)病原細(xì)菌及病毒的作用強(qiáng)度較弱[6]。抗菌脂肽具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒、抗支原體[7-8]等功能，并且抗菌譜廣、安全無(wú)毒、不易產(chǎn)生耐藥性、易被生物降解等特點(diǎn)，其在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化妝品、環(huán)保、畜牧業(yè)等領(lǐng)域備受關(guān)注[9]。目前，關(guān)于芽孢桿菌分泌的抗菌脂肽理論和應(yīng)用研究主要集中在植物病害的防治方面[10]，而有關(guān)抗菌脂肽用于食品防腐的報(bào)道較少，而且來(lái)源不同的菌株所分泌的抗菌脂肽也有較大差異[11]。

本實(shí)驗(yàn)從傳統(tǒng)臘肉中分離產(chǎn)生廣譜抗菌物質(zhì)的芽孢桿菌。通過(guò)酸沉淀、硅膠柱層析和反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）等方法從發(fā)酵液分離純化抗菌物質(zhì)，進(jìn)一步通過(guò)傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）對(duì)分離得到的抗菌組分及成分進(jìn)行分析鑒定，旨在為開(kāi)發(fā)新型、安全、高效的食品防腐劑或抗菌藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與樣品

用于檢測(cè)抑菌活性的參考菌株部分購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，部分由徐州工程學(xué)院江蘇省重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室保存。

產(chǎn)脂肽菌株分離自江蘇省徐州傳統(tǒng)農(nóng)家自制臘肉樣品。取回的樣品臨時(shí)4 ℃冰箱保存后及時(shí)處理。

1.1.2 試劑

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 日本TaKaRa公司；PCR引物 南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司；蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品Iturin A美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌株初篩培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂（nutrient broth medium，NB）培養(yǎng)基；抗菌譜檢測(cè)培養(yǎng)基：NB培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）；種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母粉10 g/L，NaCl 5 g/L，NH4NO32 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.2～7.5。以上培養(yǎng)基均經(jīng)過(guò)121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

3k15型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；GeneAmp 9700型PCR儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；JS-680D型凝膠成像系統(tǒng) 上海培清科技有限公司；1260半制備HPLC儀、Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）HPLC半制備柱 美國(guó)安捷倫公司；Qexactive Orbitrap型高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；CascadaTMAN型超純水系統(tǒng) 美國(guó)PALL公司；UV-2450紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)脂肽菌株的分離篩選與抑菌活性測(cè)定

采用抑菌圈法初篩產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的細(xì)菌菌株，以金黃色葡萄球菌為指示菌株。產(chǎn)生抑菌圈的菌株進(jìn)一步以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉為指示菌株進(jìn)一步初篩。對(duì)以上3 種指示菌均有抑制作用的菌株挑選出液態(tài)發(fā)酵復(fù)篩。按照8%的接種量接種種子液至發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃條件下180 r/min振蕩培養(yǎng)60 h。發(fā)酵液4 ℃、10 000 r/min離心10 min，獲得發(fā)酵上清液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，得到除菌后的發(fā)酵上清液。

通過(guò)瓊脂孔擴(kuò)散法[12]測(cè)定抑菌活性，制備對(duì)應(yīng)不同指示菌的瓊脂培養(yǎng)基平板，將活化好的各指示菌活菌數(shù)（霉菌為孢子）調(diào)整到2.0×106CFU/mL并在平板上涂布150 μL，表面晾干后在培養(yǎng)基上打孔。將100 μL過(guò)濾除菌后的發(fā)酵液上清注入到不同指示菌對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基平板孔中，指示菌在最適作用溫度下培養(yǎng)1～5 d，檢查平板抑菌圈情況，測(cè)定抑菌圈直徑大小，并以直徑大小表示抗菌活性高低。

1.3.2 拮抗菌株分類鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：復(fù)篩獲得的優(yōu)質(zhì)菌株在NB固態(tài)培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)并革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形狀、排列方式等形態(tài)特征。

16S rDNA的擴(kuò)增與序列分析：提取分離菌株總DNA，16S rDNA序列PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物[12]如下：上游引物（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），下游引物（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30 次循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增序列測(cè)序結(jié)果運(yùn)用BLAST軟件進(jìn)行序列比對(duì)，選擇相似度較高的菌株序列，用ClustalX1.83與MEGA5.1軟件，采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[13]。

1.3.3 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及脂肽合成

將活化過(guò)的分離篩選到的菌株按照1%（V/V）接種量接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)72 h，每隔6 h取樣測(cè)定其600 nm波長(zhǎng)處吸光度及抑菌圈直徑，以金黃色葡萄球菌為指示菌株[14]。

1.3.4 脂肽分離與鑒定

1.3.4.1 脂肽酸沉淀分離

鹽酸沉淀法提取抗菌活性物質(zhì)[15]。發(fā)酵60 h后的發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，收集上清液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。用6 mol/L鹽酸調(diào)pH值至2.0，4 ℃靜置過(guò)夜后10 000 r/min、4 ℃離心15 min。沉淀部分甲醇抽提5 次，合并抽提液，凍干后用0.02 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液溶解，得脂肽粗提物。

1.3.4.2 脂肽硅膠柱純化

粗提物用硅膠柱層析分段分離[16]，色譜柱為77 mm×93 mm硅膠柱，上樣后依次用二氯甲烷-甲醇體積比100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和0∶100梯度洗脫，每個(gè)梯度沖3～4 個(gè)柱體積。減壓快速洗脫后，收集各洗脫液于40～45 ℃減壓旋蒸去除溶劑，并對(duì)各組分抑菌活性檢測(cè)。

1.3.4.3 RP-HPLC純化

采用RP-HPLC分離經(jīng)硅膠柱純化的抗菌活性強(qiáng)的組分[17]。流動(dòng)相A為含0.1%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；流速為1 mL/min。上樣前用流動(dòng)相A平衡3 個(gè)柱體積，上樣，再用流動(dòng)相B線性梯度洗脫，45 min內(nèi)從0%增加到90%，214 nm波長(zhǎng)吸光度檢測(cè)，柱溫25 ℃。收集抗菌活性峰，合并后凍干備用。

1.3.5 FTIR掃描

把經(jīng)過(guò)純化的脂肽用KBr壓片法測(cè)紅外吸收光譜[15]。光譜范圍4 000～350 cm-1；分辨率4 cm-1，掃描累加次數(shù)16 次。

1.3.6 脂肽質(zhì)譜分析鑒定

采用MALDI-TOF-MS對(duì)純化的活性組分進(jìn)行脂肽類型初步確定[18]。應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)及Data Explorer軟件準(zhǔn)確分析其分子質(zhì)量。分析條件為：基質(zhì)DHB，激光束強(qiáng)度5 500，電壓1 560 kV，檢測(cè)范圍700～1 600 Da。

1.3.7 脂肽抑菌穩(wěn)定性測(cè)定

脂肽酸堿穩(wěn)定性[19]：部分純化的脂肽用HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)其pH值為2、4、6、8、10和12，以蒸餾水為對(duì)照，于37 ℃作用12 h，然后將pH值調(diào)至7.0，金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)試不同pH值下抗菌脂肽的抑菌活性。

脂肽熱穩(wěn)定性[19]：部分純化的脂肽溶液分別在25、40、60、80、100 ℃處理30 min，121 ℃處理20 min，以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂孔擴(kuò)散法測(cè)試處理后的脂肽殘留抗菌活性。

蛋白酶敏感性[19]：部分純化的脂肽溶液分別添加終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶，緩沖溶液調(diào)節(jié)各酶反應(yīng)體系至各酶最適作用pH值，于37 ℃孵育2 h，然后80 ℃處理15 min滅活各酶活性。瓊脂孔擴(kuò)散法測(cè)定對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性。以去離子水代替蛋白酶作為空白對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肽菌株分離篩選與鑒定

傳統(tǒng)臘肉切碎后，經(jīng)生理鹽水浸泡，富集培養(yǎng)后，梯度稀釋涂布于初篩平板上，共分離得到具有抗菌活性的菌株12 株。通過(guò)菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)分析，初步確定從培養(yǎng)基上分離到的微生物主要是細(xì)菌、酵母菌和放線菌。瓊脂孔擴(kuò)散法檢測(cè)初步篩選出的菌株發(fā)酵液對(duì)不同細(xì)菌和真菌的抑菌效果，其中一株細(xì)菌XLP27對(duì)多種指示菌有廣譜抑菌活性，結(jié)果如圖1所示，其發(fā)酵液對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌）、革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）及酵母菌（釀酒酵母）均有顯著抑菌活性，檢測(cè)平板上顯示清晰透明的抑菌圈。霉菌檢測(cè)顯示，對(duì)米曲霉、尖孢鐮刀菌、黑曲霉及短密青霉亦有明顯抑制作用，靠近1號(hào)樣品孔一側(cè)菌絲生長(zhǎng)受到明顯抑制，而空白對(duì)照一側(cè)菌絲生長(zhǎng)完全無(wú)影響。表明菌株XLP27發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)對(duì)細(xì)菌和真菌均有顯著抑制作用，故將其作為深入研究出發(fā)菌株。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上37 ℃劃線培養(yǎng)24 h，菌株菌落呈圓形，表面光滑濕潤(rùn)，乳白色，不透明，邊緣整齊，質(zhì)地中等。革蘭氏染色鏡檢，菌體桿狀呈紫紅色，為革蘭氏陽(yáng)性菌。菌株XLP27生理生化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)形態(tài)學(xué)及生理生化特性比較，參考文獻(xiàn)[21]，菌株初步鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

圖1 菌株XLP27無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌作用Fig. 1 Antifungal and antibacterial activities of lipopeptide from strain XLP27

表1 菌株XLP27形態(tài)及生理生化特征Table 1 Morphological and biochemical characteristics of strain XLP27

將菌株XLP27的16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的B. pumilus不同菌株16S rDNA序列的相似度高達(dá)99%，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果見(jiàn)圖2，分離菌株XLP27與短小芽孢桿菌（登錄號(hào)：NR074977.1）親緣關(guān)系最近，結(jié)合菌株XLP27的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性，可再次確定菌株XLP27為B. pumilus。芽孢桿菌屬菌株因其可產(chǎn)生廣泛的有益代謝產(chǎn)物如抗菌物質(zhì)和酶，如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶，如今已經(jīng)成為發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域最為常用的菌株之一，特別是已經(jīng)證明芽孢桿菌屬[22]中的很多不同種株可以產(chǎn)生對(duì)食源性腐敗菌及致病菌等細(xì)菌和真菌有抑制作用的抗菌物質(zhì)，如B. amyloliquefaciensPPCB004[23]和B. velenzensisS3-1[24]可產(chǎn)生伊枯菌素；B. licheniformisstrain P40[25]和B. subtilisSN7[26]可產(chǎn)生細(xì)菌素類抗菌物質(zhì)；B.amyloliquefaciensfiply 3A[27]可產(chǎn)生抗癌細(xì)胞的脂肽類桿菌霉素D。目前為止，以往B. pumilus脂肽文獻(xiàn)的報(bào)道主要涉及脂肽的表面活性功能，而對(duì)其抗菌特性并未見(jiàn)細(xì)致研究，如Fooladi等[28]分離了一株來(lái)自伊朗油田的B. pumilus2IR菌株，并對(duì)該菌株產(chǎn)生的表面活性特性脂肽做了發(fā)酵條件優(yōu)化和表面活性特性研究；Slivinski等[29]報(bào)道了B. pumilusUFPEDA 448固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)表面活性素脂肽。本研究是首次從臘肉中分離到產(chǎn)脂肽的B. pumilus菌株。

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株XLP27的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of strain XLP27 based on 16S rDNA gene sequence

2.2 B. pumilus XLP27生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及脂肽合成

圖3 B. pumilus XLP27生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及脂肽合成Fig. 3 Growth kinetic curve of B. pumilus strain XLP27 and lipopeptide production as a function of culture time

如圖3所示，0～2 h處于生長(zhǎng)延遲期；2～8 h時(shí)，吸光度快速升高，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；8～26 h吸光度繼續(xù)增加但是緩慢，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期；26～60 h吸光度基本恒定，菌體處于穩(wěn)定期；60 h后吸光度出現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明菌體開(kāi)始進(jìn)入衰亡區(qū)。14 h開(kāi)始出現(xiàn)抑菌圈，直徑為6 mm，表明脂肽從對(duì)數(shù)期的后期開(kāi)始合成；14～48 h內(nèi)，抑菌圈直徑不斷變大，此時(shí)脂肽抗菌活性不斷提高；60 h后抑菌圈直徑大小基本不變，表明脂肽抗菌活性達(dá)到最大穩(wěn)定值，且最大直徑為26 mm。對(duì)照菌體濃度增長(zhǎng)曲線，脂肽合成在指數(shù)期的末期開(kāi)始，主要合成在穩(wěn)定期，由此判斷該菌株合成的抗菌脂肽屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，且最佳培養(yǎng)時(shí)間為60 h。這與Fannei等[14]報(bào)道莫海威芽孢桿菌曲線基本一致，10 h即開(kāi)始合成脂肽，20 h后產(chǎn)量不斷增加；馮濤等[30]報(bào)道的納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線呈“S”形，在11 h開(kāi)始合成脂肽，50 h后基本保持穩(wěn)定；Lee等[19]報(bào)道的芽孢桿菌LM7穩(wěn)定期開(kāi)始合成脂肽，主要在發(fā)酵34～50 h合成，以后發(fā)酵產(chǎn)量基本恒定；黃翔峰等[31]研究發(fā)現(xiàn)不同的發(fā)酵條件也會(huì)引起合成脂肽時(shí)間變化。

2.3 B. pumilus XLP27脂肽純化

菌株XLP27發(fā)酵液經(jīng)酸沉淀和快速硅膠柱層析后得到5 個(gè)組分，分別對(duì)每個(gè)組分檢測(cè)抗菌活性，顯示一個(gè)組分對(duì)尖孢鐮刀菌有顯著抑制作用，該組分進(jìn)一步通過(guò)RPHPLC分離，色譜層析如圖4所示。在保留時(shí)間0～45 min內(nèi)洗脫得到多個(gè)大的洗脫峰和很多小峰，說(shuō)明HPLC柱效優(yōu)良，分離效果顯著，可將不同成分分開(kāi)。洗脫40 min后，沒(méi)有出現(xiàn)額外的峰，表明所有化合物都被從柱中洗脫出。對(duì)每個(gè)主洗脫峰檢測(cè)抗菌活性，在出峰時(shí)間19.2 min的洗脫峰即P3峰具有明顯的抑菌活性，靠近樣品孔一側(cè)的菌絲受到抑制不能延伸生長(zhǎng)，而其他收集峰樣品對(duì)菌絲生長(zhǎng)無(wú)影響（圖5）。將P3出峰保留時(shí)間同標(biāo)準(zhǔn)樣品Ituri（19.76 min）對(duì)比，顯示兩者保留時(shí)間相接近，推測(cè)P3抗菌物質(zhì)為Ituri類脂肽。RP-HPLC能夠有效將雜質(zhì)同脂肽分離，進(jìn)一步說(shuō)明前期脂肽酸沉淀、硅膠柱分段分離雖不能分離出單一成分的脂肽，但能去除影響RP-HPLC分離的大量雜質(zhì)，為RP-HPLC發(fā)揮良好的分離效果奠定基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了不同來(lái)源脂肽的分離純化，Nanjundan等[12]通過(guò)微型切勢(shì)流過(guò)濾、酸沉淀、RP-HPLC實(shí)現(xiàn)了表面活性素類脂肽的純化；Arroyave-Toro等[32]通過(guò)樹(shù)脂球吸附、C18固相萃取和RPHPLC純化了對(duì)采收后果蔬致病真菌有抑制作用的脂肽；Lee等[19]用硫酸銨鹽析和熱處理方法對(duì)從韓國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵豆中分離的Bacillussp. LM7脂肽進(jìn)行純化。與報(bào)道相比，本研究的脂肽純化方法步驟簡(jiǎn)單、分離效果好，可作為脂肽純化的借鑒。

圖4 B. pumilusXLP27脂肽RP-HPLC分離Fig. 4 RP-HPLC profile of antibiotics produced by B. pumilus XLP27 detected at 220 nm

圖5 RP-HPLC分離各洗脫峰對(duì)尖孢鐮刀菌抑菌作用Fig.5 Antifungal activity of elution peaks of lipopeptide from RP-HPLC against Fusarium oxysporum

2.4 純化脂肽FTIR分析

圖6 B. pumilus XLP27脂肽FTIR分析Fig. 6 FTIR spectrum of lipopeptide from B. pumilus XLP27

經(jīng)RP-HPLC純化的樣品FTIR分析結(jié)果見(jiàn)圖6，3 292.36 cm-1是由分子間氫鍵引起的NH收縮振動(dòng)譜帶；3 081.09 cm-1是由NH基團(tuán)的分子內(nèi)部氫鍵引起的NH收縮振動(dòng)譜帶；1 661.77、1 542.67 cm-1分別為酰胺譜帶I和II，上述的吸收特征表明，該表面活性劑分子的親水基為一肽鏈。2 954.90～2 852.81 cm-1和1 461.85～1 719.91 cm-1的2 處吸收為脂肪族碳鏈的CH伸縮振動(dòng)，1 719.91、1 217.97 cm-1為2 處內(nèi)酯鏈的特征吸收，表明樣品含有脂肪酸分子。綜合以上特征，并參照文獻(xiàn)報(bào)道的脂肽類抗菌物質(zhì)FTIR數(shù)據(jù)[15,33]，推測(cè)純化的抗菌物質(zhì)為環(huán)脂肽類。

2.5 抗菌脂肽MALDI-TOF-MS分析

經(jīng)過(guò)RP-HPLC分離的活性組分MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，圖7顯示，有1 個(gè)m/z離子簇出現(xiàn)，該離子簇色譜峰包含5 個(gè)分子離子峰，其分子質(zhì)量分別為1 046.182、1 060.213、1 074.198、1 088.201、1 102.175，推測(cè)由5 種不同脂肪酸鏈的同系物組成，并且分子質(zhì)量依次相差14 Da，恰好與脂肪酸鏈長(zhǎng)度C14～C18的Iturin A分子質(zhì)量相對(duì)應(yīng)，推測(cè)為Iturin A，這與文獻(xiàn)報(bào)道的Iturin A質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)基本一致，Rodríguez-Chávez等[15]報(bào)道的B. subtilisQ11脂肽MALDI-TOF-MS檢測(cè)到m/z分別為1 046.48、1 060.558、1 074.58和1 088.51四個(gè)離子峰，對(duì)應(yīng)脂肪鏈長(zhǎng)度為14、15、16、17 個(gè)—CH2—長(zhǎng)度的Iturn A同系物；El Arbi等[34]研究的抗真菌脂肽混合物中Iturin MALDI-TOF-MS檢測(cè)到m/z為1 106.7、1 122.7、1 134.8和1 150.8的4 個(gè)離子峰。

圖7 B. pumilusXLP27脂肽類物質(zhì)MALDI-TOF-MS分析Fig. 7 MALDI-TOF mass spectrum of lipopeptide from B. pumilus XLP27

2.6 B. pumilusXLP27脂肽抗菌譜

表2 B. pumilus XLP27脂肽對(duì)不同指示菌的拮抗作用Table 2 Antifungal and antibacterial activities of lipopeptide from B. pumilus strain XLP27

部分純化的脂肽抑菌譜如表2所示，脂肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌、單核細(xì)胞性李斯特菌都有較強(qiáng)的抑菌活性；對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌、福氏志賀氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌也有較好的抑菌作用，對(duì)銅綠假單胞菌抑菌作用稍弱。脂肽對(duì)酵母菌如釀酒酵母和白色念珠菌有稍弱的抑菌活性，但對(duì)霉菌黑曲霉、米曲霉、尖孢鐮刀菌和短密青霉抑菌作用較強(qiáng)。整體看出，脂肽有廣譜抑菌活性，特備是對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和霉菌有強(qiáng)烈的抑菌作用。近年有很多芽孢桿菌脂肽的報(bào)道，但不同菌株脂肽特性往往不同，Cao Yun等[20]分離出的枯草桿菌SQR抗菌脂肽、Arroyave-Toro等[32]發(fā)現(xiàn)的B. subtilisEA-CB0015脂肽以及Nanjundan等[12]從濕地土壤中分離出的B. amyloliquefaciensSR1抗菌脂肽均對(duì)多種植物病源具有良好的抑制作用，但均未見(jiàn)其對(duì)細(xì)菌的抑菌報(bào)道；Zheng Dehong等[17]發(fā)現(xiàn)的B. thuringiensisBMB171除了能產(chǎn)生對(duì)致病菌有良好的抑制作用的脂肽外，還可以產(chǎn)生拮抗線蟲(chóng)的抗菌物質(zhì)；Balan等[18]分離的Aneurinibacillus aneurinilyticusSBP-11對(duì)多種病源細(xì)菌有良好的抑菌作用，而未見(jiàn)對(duì)真菌的抑菌性能報(bào)道。本研究的B. pumilusXLP27脂肽不僅對(duì)細(xì)菌表現(xiàn)良好的抑菌特性，對(duì)所試的多種絲狀真菌也有顯著的抑菌效果。針對(duì)脂肽Iturin對(duì)真菌的抑菌作用機(jī)理，據(jù)研究，Iturin與真菌細(xì)胞膜的主要成分麥角甾醇相互作用，產(chǎn)生Iturin-磷脂或Iturin-磷脂-甾醇聚集復(fù)合物，從而使細(xì)胞膜的形狀改變，導(dǎo)致在脂質(zhì)雙層膜中形成大的離子通道，使K＋被釋放出來(lái)[15]。脂肽對(duì)細(xì)菌的抑菌作用機(jī)理，研究認(rèn)為脂肽錨定到細(xì)胞表面，導(dǎo)致細(xì)胞膜形成孔洞；由此電子傳遞鏈超活化、氧化磷酸化解偶聯(lián)，致使形成大量超氧陰離子自由基，這些自由基使細(xì)胞膜中的脂類過(guò)氧化，由此增加了細(xì)胞膜的滲透性，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白滲漏，最終細(xì)胞死亡[18]。接下來(lái)將通過(guò)掃描電鏡觀察細(xì)胞表面情況，探索脂肽對(duì)真菌和細(xì)菌的抑菌機(jī)理。

2.7 B. pumilus XLP27脂肽穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)脂肽能否應(yīng)用生產(chǎn)的一個(gè)重要指標(biāo)，在食品、飼料加工工藝中，都會(huì)涉及加熱處理。如圖8所示，脂肽經(jīng)25～80 ℃處理后其抑菌活性基本無(wú)變化，穩(wěn)定性保持在95%以上；在100 ℃下加熱后，其抑菌活性也保持在80%左右；當(dāng)在121 ℃條件下加熱20 min（高溫高壓滅菌)，抑菌活性顯著降低，但沒(méi)有完全喪失抑菌活性，扔具有43%的抑菌活力。整體說(shuō)明脂肽熱穩(wěn)定性好。Lee等[19]報(bào)道的Bacillussp. LM7脂肽Anti-LM7也具有相似的耐高溫特性。在食品工業(yè)中，使用單一的抗菌物質(zhì)很難確保食品不會(huì)腐敗變質(zhì)，通常將單一的抗菌物質(zhì)和其他類型的抗菌劑或者除菌技術(shù)如加熱、輻射、脈沖電場(chǎng)等聯(lián)合使用，以確保食品在保藏期內(nèi)不會(huì)腐敗變質(zhì)[19]。本研究的脂肽高溫耐受性好，能夠承受食品加工工藝中的高溫處理，故有潛力作為天然食品防腐劑在食品中使用。

圖8 溫度對(duì)B. pumilus XLP27脂肽抑菌活性的影響Fig. 8 Effect of temperature on the antibacterial activity of lipopeptide from B. pumilus XLP27

圖9 pH值對(duì)B. pumilus XLP27脂肽抑菌活性的影響Fig. 9 Effect of pH on the antibacterial activity of lipopeptide from B. pumilus XLP27

由圖9可知，在pH 4.0～10之間脂肽穩(wěn)定性最佳，抑菌活性均保持90%以上，在pH 2.0及pH 12時(shí)其抑菌活性略低，但抑菌活性仍然保持65%及52%。由此看出，本研究脂肽在弱酸、弱堿及中性條件下均具有良好的穩(wěn)定性，這與多黏類芽孢桿菌脂肽[35]穩(wěn)定性相似，其在中性條件下比較穩(wěn)定，強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性條件下不穩(wěn)定；Lee等[19]報(bào)道的Bacillussp. LM7脂肽Anti-LM7在pH 4～9范圍內(nèi)穩(wěn)定，pH 3.0或11.0時(shí)約損失50%的抑菌活性。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道具有酸堿穩(wěn)定性的抗菌脂肽大多為表面活素類脂肽，雖然也有良好的酸堿穩(wěn)定性，但以脂肽表面延展性為指標(biāo)，以抗菌性能為指標(biāo)的鮮見(jiàn)報(bào)道。脂肽良好的酸堿穩(wěn)定性使其可以在不同類型的食品中作為天然防腐劑廣泛應(yīng)用。

圖10 不同蛋白酶對(duì)B. pumilus XLP27脂肽的作用Fig. 10 Resistance to different proteases of lipopeptide from B. pumilus XLP27

如圖10所示，與空白對(duì)照相比，蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶幾乎對(duì)脂肽活性無(wú)任何影響，進(jìn)一步證明本研究分離純化到的抗菌物質(zhì)為脂肽類，而不是容易受到蛋白酶降解而完全失活的細(xì)菌素類。胰凝乳蛋白酶有輕微的抑制作用，推測(cè)構(gòu)成脂肽的環(huán)狀多肽鏈中含有胰凝乳蛋白酶所識(shí)別的氨基酸基團(tuán)。據(jù)研究，胰凝乳蛋白酶可以水解酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸的羧基側(cè)肽酰胺鍵，脂肽中可能存在這幾種氨基酸中的一種或幾種[19]。脂肽對(duì)蛋白酶的低敏感性與報(bào)道的多數(shù)脂肽一致[36]，研究認(rèn)為脂肽之所以對(duì)各種蛋白酶不敏感主要是因?yàn)樵谥沫h(huán)狀肽鏈中廣泛存在非正常的氨基酸如D型氨基酸，由此導(dǎo)致脂肽對(duì)肽鏈內(nèi)切蛋白酶有強(qiáng)的抵抗性[37]。由此說(shuō)明本研究脂肽可以不受消化道中蛋白酶的影響而穩(wěn)定存在，可以作為飼料添加劑使用。

3 結(jié) 論

從傳統(tǒng)臘肉中分離篩選得到1 株產(chǎn)脂肽的B. pumilusXLP27。該菌株脂肽目前研究主要涉及表面活性劑特性，針對(duì)B. pumilus脂肽抗菌特性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。B. pumilusXLP27脂肽主要在穩(wěn)定期合成。通過(guò)酸沉淀、硅膠柱層析及RP-HPLC純化得到單一組分抗菌物質(zhì)。FTIR及MALDI-TOF-MS鑒定抗菌物質(zhì)為環(huán)狀脂肽Iturin A。該脂肽具有廣譜抗菌特性，對(duì)G＋、G-細(xì)菌有良好的抑菌作用，對(duì)絲狀真菌及酵母菌也顯示優(yōu)良的抑制特性。脂肽在100 ℃的高溫及廣泛的pH值范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好。鑒于以上特性，B. pumilusXLP27所產(chǎn)脂肽有潛力在植物病源真菌生物防治、飼料添加劑，特別是在新型天然食品防腐劑方面開(kāi)發(fā)應(yīng)用。