基于高通量測序的陶融型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析

陳蒙恩，趙 聰，韓素娜，周丹鳳，李建民，張 勁，黃潤娜，王曉毅，鄧 杰，胡曉龍

（1.河南仰韶酒業(yè)有限公司，河南 三門峽 472400；2.三門峽市科學(xué)技術(shù)情報研究所，河南 三門峽 472400；3.三門峽市第二中學(xué)，河南 三門峽 472400；4.四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000；5.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450000）

大曲是一種富含微生物菌群、菌系及復(fù)合曲香的微生態(tài)制品，具有糖化、發(fā)酵、生香等功能[1]，其質(zhì)量優(yōu)劣直接影響到白酒的品質(zhì)和風(fēng)味特征[2-4]。由于大曲制作為開放式，其微生物類群十分豐富，包括霉菌、細(xì)菌及酵母菌等，這些微生物能夠產(chǎn)生各種酶和風(fēng)味物質(zhì)，因此，微生物群落是決定大曲品質(zhì)的核心因素之一[5-8]。

以往對大曲微生物的研究多采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，但該方法分離到的微生物在種類和數(shù)量上有限[9]，通常會遺漏很多微生物種類，其中甚至可能有關(guān)鍵性功能微生物[10-11]。相比之下，高通量測序技術(shù)作為新一代測序方法，具有數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高、分析全面、靈敏、快速等特點，可方便快捷地對樣品中復(fù)雜的微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[9,12]，且高通量測序檢測到的是樣品中所有的DNA序列，包括微生物死亡后存留的DNA片段[13]，能夠更加客觀地反映樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的真實性。

目前，利用高通量技術(shù)對大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究已有相關(guān)報道[14-15]，但對陶融型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的研究尚鮮見報道。陶融型大曲是指在仰韶地域自然環(huán)境、生產(chǎn)原料、釀造工藝等因素的前提下，制造的陶融型白酒專用大曲[16-17]。陶融型大曲以小麥、大麥、豌豆為原料，經(jīng)自然接種、陶屋培養(yǎng)發(fā)酵而成。本研究利用高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)方法，對陶融型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性進(jìn)行研究，得出陶融型大曲中主要微生物構(gòu)成，同時與大曲相關(guān)的理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在為解析陶融型大曲的糖化生香機(jī)理及篩選優(yōu)良釀造功能微生物提供堅實的理論依據(jù)；同時，為進(jìn)一步改良陶融型大曲的制作工藝及明晰大曲與優(yōu)質(zhì)陶融型白酒之間的關(guān)系提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 大曲樣品

選取河南某公司定期跟蹤的5 房成品陶融型大曲（5 房陶融型大曲為同一時間入房，入房時間為5月份，所取樣的大曲在安曲培養(yǎng)階段事先用紅布條進(jìn)行標(biāo)記，在翻曲、并房、打攏、貯存階段扔將其放置至指定位置，以便其能夠代表整房陶融型大曲），大曲的貯存時間為120 d，每房曲均采用四點中心法進(jìn)行取樣，樣品粉碎后過40 目篩，四分法濃縮至150 g，裝于無菌袋內(nèi)，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

DNA Ladder 2000、DL 2000TMDNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；Soil DNA Kit提取試劑盒 美國Omega公司；蛋白酶K、溶菌酶 美國Sigma公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-VS2型超凈工作臺 無錫易純凈化設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；NanoDrop2000微量分光光度計 美國賽默飛公司；C1000 Touch聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Mini-subcell水平電泳儀、Chemi DocXRS＋凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；MX-S型可調(diào)式混勻儀 美國SCILOGEX公司；QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲相關(guān)理化指標(biāo)檢測

對貯存120 d的5 房大曲理化指標(biāo)進(jìn)行檢測[1]，檢測指標(biāo)包括水分、酸度、淀粉、還原糖、銨態(tài)氮、糖化力、發(fā)酵力、液化力、酯化力、蛋白酶活力，最終結(jié)果取5 房平均值。

1.3.2 大曲微生物總DNA提取及PCR擴(kuò)增回收

采用Soil DNA Kit對大曲微生物總基因組DNA進(jìn)行提取，提取方法按照試劑公司提供的實驗操作指南進(jìn)行。利用NanoDrop2000微量分光光度計對提取的微生物DNA濃度及純度進(jìn)行檢測，將檢測合格的DNA提取物置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR采用TransGen AP221-02、TransStart FastPfuDNA Polymerase，20 μL反應(yīng)體系：5×FastPfuBuffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL；Forward Primer（5 μmol/L）0.8 μL；Reverse Primer（5 μmol/L）0.8 μL；FastPfuPolymerase 0.4 μL；BSA 0.2 μL；Template DNA 10 ng；補ddH2O至20 μL。PCR參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，28 個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，10 ℃保持至停止。全部樣品按照正式實驗條件進(jìn)行，每個樣品3 個重復(fù)，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。

1.3.3 PCR產(chǎn)物熒光定量

參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量，之后按照每個樣品的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.3.4 高通量測序與數(shù)據(jù)分析

建庫與測序在上海凌恩生物科技有限公司完成。高通量測序針對細(xì)菌16S rRNA基因515F_907R區(qū)域、真菌ITS1F_ITS2R區(qū)序列，設(shè)計帶barcode[18]的特異引物，測序平臺為Illumina MiSeq。通過雙末端測序（PE sequencing）[19]，將基因序列進(jìn)行初級篩選，剔除測序質(zhì)量較差的數(shù)據(jù)。通過barcode找對應(yīng)編號樣品，去掉引物，再把質(zhì)量差的序列剔除。通過提取優(yōu)化序列中的非重復(fù)序列，降低分析中間過程冗余計算量（http://drive5.com/usearch/manual/dereplication.html）；去除沒有重復(fù)的單序列（http://drive5.com/usearch/manual/singletons.html）；按照97%相似性對非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。

1.4 數(shù)據(jù)處理[20]

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件和Origin 9.0進(jìn)行統(tǒng)計分析、繪圖和相關(guān)性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲理化指標(biāo)分析

表1 貯存120 d大曲理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of Daqu stored for 120 days

對貯存120 d大曲的理化指標(biāo)進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。糖化力保持在700 U/g以上，液化力在0.8 U/g左右，發(fā)酵力（CO2質(zhì)量計）在0.8 g/（100 g·48 h）左右，蛋白酶活力在40 U/g以上，酯化力在20 mg/（g·100 h）以上，各理化指標(biāo)均滿足輕工行業(yè)對優(yōu)質(zhì)大曲質(zhì)量要求的標(biāo)準(zhǔn)（QB/T 4259—2011《濃香大曲》）。

2.2 大曲樣品PCR產(chǎn)物定量

對5 房陶融型大曲中微生物的總DNA進(jìn)行提取，用凝膠電泳和微量分光光度計對基因組的質(zhì)量進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2、圖1。

表2 不同DNA純度檢測結(jié)果Table 2 Purity of total DNA extracted from five Daqu samples

圖1 5 房大曲凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis profiles of total DNA extracted from five Daqu samples

由表2可知，5 個樣品DNA的OD260nm/OD230nm都在2.0左右，說明純度較高。Illumina PE250測序?qū)NA質(zhì)量要求：樣品量≥500 ng，DNA質(zhì)量濃度≥5 ng/μL。以上DNA樣品均符合上機(jī)要求，可以用來做后續(xù)PCR擴(kuò)增以及高通量測序。

2.3 高通量原始數(shù)據(jù)獲取及統(tǒng)計學(xué)分析[21-22]

通過Illumina PE250高通量測序篩選獲取有效基因組序列信息，測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計見表3。經(jīng)過分析統(tǒng)計，5 房大曲樣品共獲得細(xì)菌有效序列182 662 條，平均長度在380 bp左右，測序長度主要分布在351～400 bp（97.92%）之間，與設(shè)計引物擴(kuò)增長度接近，由此判斷測序結(jié)果較好。共獲得真菌有效序列192 686 條，平均長度為280 bp，測序長度集中分布在251～300 bp，與設(shè)計引物擴(kuò)增序列長度為300 bp左右較接近，說明本次測序結(jié)果較合理，保證了足夠的測序數(shù)量，可以滿足后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

表3 文庫測序情況數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 3 Statistics of bacterial and fungal genomic sequences

2.4 大曲微生物OTU分類

圖2 大曲文庫內(nèi)OTU的Venn圖Fig. 2 Venn diagrams showing unique and shared bacterial and fungal OTUs between clone libraries for five Daqu samples

稀釋曲線可以比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣品中物種的豐富度，當(dāng)曲線趨向平緩時，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU[15]。Venn圖可用于統(tǒng)計多個樣品中共有和獨有的OTU數(shù)，可以比較直觀地表現(xiàn)樣品OTU數(shù)組成相似性及重疊情況，對不同樣品之間共有及獨有的OTU數(shù)進(jìn)行疊加，得出OTU分布的Venn圖[23-25]，見圖2。結(jié)果表明：5 房陶融型大曲中共獲得細(xì)菌OTU數(shù)為83 個，其中共同擁有的OTU數(shù)為45 個，占OTU總數(shù)的54%；共獲得真菌OTU數(shù)為34 個，其中共同擁有的OTU數(shù)為19 個，占OTU總數(shù)的56%。圖2中，ZG5號樣品獨有的OTU占細(xì)菌物種總數(shù)的7%，占真菌物種總數(shù)的6%，其他4 個樣品結(jié)果基本一致，說明制曲工藝相對穩(wěn)定；ZG5號樣品可能是在培養(yǎng)過程中由于某種原因所造成，需要進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究。

2.5 Shannon指數(shù)和Rank指數(shù)分析

為研究取樣量能否代表原樣品物種豐富度，對樣品個數(shù)和物種種類作稀釋分布曲線[26-27]，從而評估所構(gòu)建文庫的覆蓋率是否達(dá)到飽和（圖3）。以97%的序列相似度水平作為OTU的界定，通過分析樣品的OTU數(shù)及分布情況，反映樣品中所含種群的多樣性及豐富度；通過Shannon指數(shù)[28]反映樣品中微生物多樣性；Rank-Abundance[29]解釋樣品物種豐度和物種均勻度（圖4、5）；物種累計曲線見圖6。

圖3 樣品稀釋性曲線Fig. 3 Rarefaction curves

圖4 樣品Shannon曲線Fig. 4 Shannon Wiener curves

根據(jù)圖3、4結(jié)果可得，各曲樣的稀釋性曲線和Shannon曲線都隨測序深度的增加呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢，這表明測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度能夠反映出樣品中絕大多數(shù)微生物的物種信息。圖3中細(xì)菌文庫內(nèi)OTU數(shù)表現(xiàn)為ZG5＞ZG1＞ZG4＞ZG2＞ZG3；真菌文庫的OTU數(shù)表現(xiàn)為ZG1＞ZG4＞ZG2＞ZG3＞ZG5，除第5房外，其他4 房與細(xì)菌文庫基本一致。圖4使用97%相似度的OTU，且曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，完全可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。從Rank-Abundance曲線（圖5）可以看出，細(xì)菌微生物多樣性豐度及均勻度均高于真菌。

圖5 OTU等級豐度曲線Fig. 5 OTU Rank-abundance curves

圖6 物種累計曲線Fig. 6 Species accumulation curves

從圖6可知，在一定范圍內(nèi)，隨著樣品量的加大，細(xì)菌曲線表現(xiàn)為急劇上升，表示群落中有大量物種被發(fā)現(xiàn)，之后趨于平緩，說明在之后的OTU抽樣中物種并沒有隨樣品量的增加而顯著增多；真菌曲線一直處于平緩上升趨勢，說明隨著OTU抽樣的進(jìn)行，雖然不斷有物種被發(fā)現(xiàn)，但物質(zhì)種類不多。從兩組曲線的總體變化趨勢可知，在抽樣過程中，樣品總量滿足實驗所需，抽樣充分，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.6 陶融型大曲群落結(jié)構(gòu)組成

圖7 樣品聚類樹與柱狀圖組合分析Fig. 7 Similarity in bacterial and fungal community compositions at phylum level between five Daqu samples

運用統(tǒng)計學(xué)的分析方法進(jìn)行分類[28,30]，圖7結(jié)果顯示，從獲得的182 662 條大曲細(xì)菌優(yōu)質(zhì)序列中可以歸類到9 個門，分別為：厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、未歸類的細(xì)菌（Bacteria_unclassified）、unclassified、梭桿菌門（Fusobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、棲熱鏈球菌門（Deinococcus-Thermus）。其中厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和藍(lán)藻門占比較大，分別為79.15%、15.30%、4.05%和1.42%，厚壁菌門為大曲中絕對的優(yōu)勢微生物，這是由于厚壁菌門主要由芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia）等微生物組成[31]，具有很強的環(huán)境適應(yīng)性，能夠在相對極端的條件保持生長代謝；放線菌廣泛分布于土壤環(huán)境、海洋環(huán)境、植物體及其他極端自然生態(tài)環(huán)境中，同時和厚壁菌門相似，也具有極強的耐受性[32]。從獲得的192 686 條大曲真菌優(yōu)質(zhì)序列中可以歸類到3 個門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。其中子囊菌門真菌占比最大，達(dá)99.19%，接合菌門和擔(dān)子菌門分別為0.80%和0.01%。

圖8 屬水平群落結(jié)構(gòu)組分圖Fig. 8 Bacterial and fungal community compositions at genus level in five Daqu samples

在屬水平上細(xì)菌共得到54 個屬，將相對豐度低于1%的合并為一類（others），由圖8所示，5 個曲樣中相對豐度較高的為厚壁菌門下的乳桿菌屬（Lactobacillus，46.25%）、魏斯氏菌屬（Weissella，13.21%）、泛菌屬（Pantoea，8.02%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，7.92%）、Kroppenstedtia（5.21%）、片球菌屬（Pediococcus，2.93%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，2.48%）、Enterobacteriaceae_unclassified（2.45%），放線菌門下的糖多孢菌屬（Saccharopolyspora，3.23%），變形菌門下的Mitochondria_norank（1.96%）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia，1.39%），藍(lán)藻門下的Cyanobacteria_norank（1.43%）。5 個曲樣的優(yōu)勢菌屬主要分布在乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、泛菌屬、明串珠菌屬、Kroppenstedtia、糖多孢菌屬、片球菌屬和芽孢桿菌屬。

在屬水平上5 個曲樣中真菌的OTU可歸為18 個屬。真菌群落豐度不如細(xì)菌群落，是因為大曲在培養(yǎng)過程中頂火溫度超過50 ℃，致使大部分真菌死亡，只有少部分耐熱和嗜熱真菌得以存活[33-34]。5 個曲樣中的優(yōu)勢菌屬為unidentified（43.06%）、嗜熱真菌屬（Thermomyces，27.27%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus，26.41%）、曲霉屬（Aspergillus，1.98%）、根毛霉屬（Rhizomucor，0.65%）；酵母在5 個曲樣中相對豐度均不高，如威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）、哈薩克斯坦酵母（Kazachstania）等雖有鑒定出但其相對豐度均小于1%。通過高通量測序?qū)μ杖谛痛笄恼婢郝涠鄻有赃M(jìn)行分析，結(jié)果表明，制曲溫度對真菌群落結(jié)構(gòu)的組成具有重要影響，后期可通過調(diào)節(jié)制曲溫度對陶融型大曲的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控。

2.7 微生物與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

通過對5 房大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)解析可知，在5 房大曲中細(xì)菌和真菌的優(yōu)勢菌屬基本相同，但是各類優(yōu)勢均屬的相對豐度又存在一定差異性，通過冗余分析（redundancy analysis，RDA）確定樣品中群落結(jié)構(gòu)與理化指標(biāo)的關(guān)系。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和理化指標(biāo)進(jìn)行RDA（圖9A），PC1為83.3%，PC2為10.9%，貢獻(xiàn)值最大的理化指標(biāo)是還原糖，其次是銨態(tài)氮，再次是蛋白酶活力和液化力；真菌群落結(jié)構(gòu)和理化指標(biāo)進(jìn)行RDA（圖9B），PC1為77.3%，PC2為22.4%，貢獻(xiàn)值最大的理化指標(biāo)是液化力，其次是糖化力，再次是發(fā)酵力和還原糖。

圖9 結(jié)果顯示，液化力、還原糖和酯化力與Kroppenstedtia和Enterobacteriaceae_unclassified有較強的正相關(guān)，與乳桿菌屬負(fù)相關(guān)較強；銨態(tài)氮與魏斯氏菌屬和明串珠菌屬正相關(guān)，而蛋白酶活力與這2 個菌負(fù)相關(guān)；蛋白酶活力與泛菌屬、伯克霍爾德菌屬、Cyanobacteria_norank等正相關(guān)，而銨態(tài)氮與這些菌負(fù)相關(guān)；發(fā)酵力、糖化力和液化力與根毛霉屬和根霉屬（Rhizopus）正相關(guān)，與嗜熱子囊菌屬負(fù)相關(guān)；還原糖與曲霉屬和嗜熱真菌屬正相關(guān)，與威克漢姆酵母負(fù)相關(guān)。

表4 微生物因子與理化因子相關(guān)性Table 4 Correlations between microbes in Daqu and its physicochemical parameters

從微生物和理化的相關(guān)性分析可以看出（表4），乳桿菌屬含量與酸度呈正比，與液化力、糖化力和酯化力等呈反比，這說明大曲中的乳桿菌屬含量過高會導(dǎo)致大曲的酸度增加，而發(fā)酵性能下降，大曲的香味有酸臭，導(dǎo)致大曲的質(zhì)量下降；Kroppenstedtia的菌落呈現(xiàn)白色，其含量與液化力和酯化力呈正比，與酸度呈反比，先前的研究報道該類對大曲生香有一定作用，能夠提升曲的性能；根毛霉屬能夠提升大曲的糖化能力，嗜熱真菌屬能提升大曲的液化能力，這些菌株均有利于提升曲的發(fā)酵性能。通過對大曲中的微生物和理化進(jìn)行相關(guān)性分析，可以找到大曲中優(yōu)勢微生物和理化的關(guān)系，結(jié)合傳統(tǒng)感官對大曲的認(rèn)識，能夠找到感官指標(biāo)與微生物形態(tài)呈現(xiàn)的關(guān)系，如果通過進(jìn)一步研究，將個別優(yōu)勢微生物作為大曲評判的指標(biāo)，結(jié)合原有評價體系，能夠形成一套對大曲更加合理的評價標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié) 論

本研究利用高通量測序技術(shù)，從分類學(xué)角度系統(tǒng)研究了陶融型大曲中細(xì)菌和真菌的多樣性，確定了陶融型大曲中主要微生物的菌落構(gòu)成。結(jié)果表明，大曲中共檢測到細(xì)菌OTU數(shù)為83，真菌OTU數(shù)為34，細(xì)菌的物種多樣性遠(yuǎn)高于真菌。大曲微生物相對豐度統(tǒng)計表明，在細(xì)菌多樣性中，大曲的優(yōu)勢菌屬主要為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、泛菌屬、明串珠菌屬四大類，4 種菌屬共占大曲細(xì)菌多樣性的75.40%，同時還檢測到了Kroppenstedtia、糖多孢菌屬、片球菌屬、芽孢桿菌屬等優(yōu)勢菌屬；在真菌多樣性中，大曲的優(yōu)勢菌屬主要為unidentified、嗜熱真菌屬、嗜熱子囊菌屬三大類，3 種菌屬共占大曲真菌多樣性的96.74%，同時還檢測到了曲霉屬、根霉屬、威克漢姆酵母屬、哈薩克斯坦酵母屬等。

大曲生產(chǎn)過程復(fù)雜，在開放的制曲環(huán)境中，原料、器具、空氣、水等均是大曲微生物的主要來源。陶融型大曲以陶屋為發(fā)酵容器，獨特的制曲工藝及獨有的地域菌群環(huán)境形成了陶融型大曲特有的菌落構(gòu)成。因此，對陶融型大曲進(jìn)行系統(tǒng)研究，將有助于解析出陶融型白酒“甜醹柔潤”的原因，同時也為今后制定陶融型大曲的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)及優(yōu)化制曲工藝等提供了理論依據(jù)。