明膠與海藻酸鈉的靜電復(fù)合機制及熱動力學(xué)分析

陳海華，于 芮，王雨生,2,*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報編輯部，山東 青島 266109）

蛋白質(zhì)與多糖是生物體系的主要組成成分，也是食品中的主要營養(yǎng)成分，2 種大分子常同時存在于食品體系中，是食品品質(zhì)特性的主要貢獻(xiàn)者，其相互作用可以影響食品的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)、流變性質(zhì)及結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性等[1]。近年來，生物大分子間復(fù)合凝聚過程的研究逐漸成為熱點，利用大分子間的相互作用可以制備新型生物材料，用于食品智能包裝、界面穩(wěn)定、脂肪替代等[2-3]，或者制備納米顆粒、微膠囊等[4]。因此，闡明蛋白和多糖之間的相互作用機制、影響因素，研究并掌控兩者的反應(yīng)條件、進(jìn)程，對改善食品品質(zhì)及微觀結(jié)構(gòu)、開發(fā)新食品原料和加工方法都有非常重要的意義。

明膠（gelatin，GEL）是從動物皮膚、骨、肌膜等組織中提取的，具有與蛋白質(zhì)大分子相類似的特性，常溫下呈三股螺旋結(jié)構(gòu)，被公認(rèn)為一種營養(yǎng)價值較高的親水膠體[5]，已有較多研究將GEL與多糖如阿拉伯膠[3]、殼聚糖[6]等相互作用制備微膠囊、膜等新材料，可被廣泛用作乳制品、糖果、冷凍食品等的添加劑。海藻酸鈉（sodium alginate，AG）是一種安全的天然陰離子線性多糖，1938年已被收入美國藥典，被廣泛應(yīng)用于食品、制藥和化妝品行業(yè)[7]。AG與多糖間存在廣泛的相互作用，劉歡等[8]利用羧甲基殼聚糖與AG制備了微球以包埋檸檬醛精油；杜雨等[4]則利用大分子多糖的相互作用制備了一種高分子材料——AG/魔芋葡甘聚糖-菊糖纖維膜；研究發(fā)現(xiàn)，AG與淀粉間也存在相互作用，可以抑制玉米淀粉的長期老化[9-11]。越來越多的學(xué)者已關(guān)注到AG與蛋白之間的相互作用，趙磊等[12]利用大豆分離蛋白與AG制備了可包埋番茄紅素的新型壁材；董宇豪等[2]利用AG與魚GEL制備了一種復(fù)合可食膜；Razzak等[7]則研究了魚GEL與AG的相互作用機制。有學(xué)者利用GEL與AG制備了一種穩(wěn)定的pH值敏感型水凝膠，說明GEL與AG具有良好的相容性[5]，具有較好的應(yīng)用前景，但目前研究中，GEL與AG的大分子復(fù)合過程較多地進(jìn)行了加熱處理，常溫下兩者在水溶液中的相互作用研究較少，其復(fù)合機制、影響因素及產(chǎn)物需要進(jìn)一步明確。

因此，本研究配制不同質(zhì)量濃度和質(zhì)量比、不同pH值的GEL與AG溶液，在室溫下通過濁度滴定、Zeta電位測定、亞甲基藍(lán)（methylene blue，MB）光譜等手段，闡明GEL與AG相互作用基本特征，通過鹽離子、尿素的添加進(jìn)一步研究其作用機制影響因素，并利用等溫滴定微量熱儀（isothermal titration calorimetry，ITC）對兩者結(jié)合過程進(jìn)行熱動力學(xué)分析，以期揭示常溫下水溶液中GEL與AG的相互作用規(guī)律，為GEL-AG基生物材料的開發(fā)，及其在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的拓展應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GEL（相對分子質(zhì)量20 000） 天津市北辰方正試劑廠；AG（相對分子質(zhì)量82 500） 青島明月海藻有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MicroCal PEAQ-ITC等溫滴定微量熱儀（isothermal titration calorimetry，ITC） 英國馬爾文儀器有限公司；UV2000紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；ZEN 3690動態(tài)光散射儀 英國馬爾文儀器有限公司；HJ-6多頭磁力加熱攪拌器 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GEL-AG體系制備

用分析天平準(zhǔn)確稱取適量GEL粉末溶于去離子水中，配制1 g/L的GEL溶液，55 ℃、1 000 r/min磁力攪拌5 h后，置于4 ℃冰箱中過夜，使蛋白質(zhì)分子完全水化，待用。準(zhǔn)確稱取適量AG粉末溶于去離子水，配制1 g/L的AG溶液，1 000 r/min室溫磁力攪拌過夜，待用。分別向GEL和AG溶液中加入0.2 g/L的疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長。根據(jù)目標(biāo)濃度分別量取一定體積GEL溶液和AG溶液并混合，室溫、1 000 r/min磁力攪拌1 h，得到宏觀均勻溶液。

固定體系總質(zhì)量濃度CT=1 g/L，改變GEL與AG的質(zhì)量比r（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10），探究r對GEL和AG分子相互作用的影響。

固定體系r=7∶3，分別改變CT（0.25、0.5、1、2 g/L）、添加適量NaCl（0、0.02、0.05、0.10、0.20 mol/L）、添加適量尿素（200 mol/L），依次探究CT、離子強度、非靜電相互作用對GEL和AG分子結(jié)合過程的影響。

1.3.2 濁度滴定

參考Razzak等[13]的方法并稍作修改。使用紫外-可見分光光度計測定體系濁度，測定波長為600 nm，比色皿厚度為1 cm，同時使用pH計對體系的pH值進(jìn)行跟蹤。用去離子水將分光光度計的透光率（T）校準(zhǔn)為100%，樣品的濁度（%）表示為1-T。先用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.0±0.2，然后用HCl溶液對體系由中性向酸性進(jìn)行滴定。體系pH值每變化0.1～0.2，取樣測定其濁度，同時記錄對應(yīng)的pH值。為保證整個體系混合均勻，滴定過程在磁力攪拌器上進(jìn)行。測定濁度前，所取樣品進(jìn)行5 s的渦旋處理。

1.3.3 Zeta電位的測定

使用動態(tài)光散射儀測定體系的Zeta電位，測定溫度為25 ℃。Zeta電位由儀器自帶軟件通過Helmholtz-Smoluchowski方程計算，重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.4 MB法測定可溶性GEL-AG復(fù)合物

陽離子染料MB與多糖存在靜電相互作用，其水溶液在664 nm和615 nm波長處分別有最大吸收峰和肩峰，MB與多糖的靜電相互作用會降低最大峰強度而升高肩峰強度。根據(jù)峰強度之比R664/615的變化，可以確定溶液中游離和復(fù)合MB濃度的變化[7]。

根據(jù)Rousi等[3]的方法并稍作修改。首先，用紫外-可見分光光度計全程掃描5 mg/L的MB溶液，測得MB在664 nm和615 nm波長處峰強度。然后于25 ℃制備MB-AG體系，含MB 5 mg/L，但含AG質(zhì)量濃度不同（0.1～6.0 g/L），分別測定不同AG質(zhì)量濃度MB-AG體系的R664/615，以確定R664/615最小時（此時MB-AG復(fù)合物含量最高）的AG濃度。配制該質(zhì)量濃度的AG溶液，添加MB質(zhì)量濃度為5 mg/L，并添加不同質(zhì)量濃度（0～3.0 g/L）GEL溶液，制備一系列MB-GEL-AG混合液，調(diào)整混合液pH值分別為6.0和8.0，測量混合液R664/615。

1.3.5 等溫滴定微量熱分析

根據(jù)Lan等[14]的方法并稍作修改。首先按照1.3.1節(jié)方法分別制備GEL（10.0 g/L）與AG（0.33 g/L）溶液，AG溶液中同時添加NaCl濃度分別為0、0.02、0.05、0.10、0.20 mol/L。GEL和AG溶液分別置于ITC的40 μL注射針和200 μL反應(yīng)池內(nèi)，設(shè)置溫度為25 ℃，連續(xù)向AG溶液中注射19 次GEL溶液，其中第1次注射0.5 μL，并將其從最終結(jié)果中扣除，之后每次注射1 μL，每次注射持續(xù)2 s，間隔100 s，攪拌速率為500 r/min。采用“單點結(jié)合”模型對數(shù)據(jù)擬合，計算物質(zhì)的量比N、結(jié)合常數(shù)K、反應(yīng)過程的焓變ΔH和熵變ΔS，采用方程ΔG=ΔH-TΔS計算吉布斯自由能的變化ΔG。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境pH值及GEL與AG質(zhì)量比r對其相互作用的影響

如圖1a所示，溶液pH值從6.0降至3.5過程中，純GEL溶液或純AG溶液均保持澄清，濁度接近于0；當(dāng)pH值低于3.5時，濁度略有升高。這可能是由于酸誘導(dǎo)GEL蛋白質(zhì)產(chǎn)生聚沉，以及低pH值條件下AG分子被質(zhì)子化或電荷中和而發(fā)生聚集[15]。

蛋白質(zhì)與多糖體系的濁度受pH值及r值影響很大。圖1a中，GEL和AG按不同質(zhì)量比混合后，pH值從6.0降至5.0過程中，體系均保持澄清，濁度接近于0；當(dāng)pH值降至pHc時，濁度開始升高，說明帶正電的GEL分子與帶負(fù)電的AG分子開始相互結(jié)合，形成不溶性復(fù)合物[7,16]；繼續(xù)降低pH值至pHopt時，體系中出現(xiàn)大量肉眼可見聚集體顆粒，此時體系濁度最大，說明GEL與AG在pHopt條件下發(fā)生了強烈的相互作用，形成了GEL-AG靜電復(fù)合物[14]；溶液pH值低于pHopt后，聚集體快速沉淀，繼續(xù)降低pH值，體系變得澄清，濁度迅速降低。比較圖1a中不同r的濁度曲線可以看出，r=7∶3的體系pHopt較高，在pH 4.5時濁度開始升高，pH值在2.5～3.5范圍內(nèi)，體系均保持較高的濁度，此時pH值的改變對GEL-AG復(fù)合物沉降的影響相對較小，利于形成穩(wěn)定的懸濁液而進(jìn)行Zeta電位測試等實驗，是最合適的配比。對于r=8∶2或r=9∶1的體系，雖然在pHopt時濁度很高，但繼續(xù)降低pH值后，濁度下降過快，在pH值低于3.0時溶液已澄清；而r=3∶7的體系，pH值降低過程中，體系濁度逐漸增大，但沒有快速沉淀過程，無對應(yīng)的pHopt。

圖1 GEL-AG體系的濁度（a）、Zeta電位（b）及狀態(tài)圖（c）Fig. 1 Turbidity (a), zeta potential (b), and phase diagram (c) of GEL-AG system

Zeta電位可反映粒子表面電荷量，電荷量較大（Zeta電位絕對值較大）時，溶液中同種粒子間表現(xiàn)為較強的靜電斥力，形成均勻溶液而不聚沉；電荷量較小，Zeta電位趨向于等電點時，粒子容易聚集。由圖1b可知，隨著pH值的降低，純GEL溶液的Zeta電位從-1.08 mV增加到8.44 mV，GEL分子上的羧基逐漸被質(zhì)子化而帶正電荷。當(dāng)pH 4.92時，純GEL溶液的Zeta電位為0（GEL的等電點），pH值低于4.92時，GEL帶正電荷，這與Yang Yadong等[16]報道的結(jié)果一致。隨著pH值的降低，純AG溶液的Zeta電位從-43.06 mV增加到-1.51 mV，說明AG分子在pH值變化過程中始終具有很強的電負(fù)性，這一趨勢與Razzak等[7]的研究結(jié)果一致，甘露糖殘基和古洛糖酸殘基的存在使AG呈現(xiàn)較強的電負(fù)性。

對于GEL和AG按照不同質(zhì)量比配制的體系，在相同pH值條件下，其Zeta電位介于純GEL溶液與純AG溶液之間，且隨著r的升高而升高（圖1b），這可能是GEL與AG分子間的電荷補償效應(yīng)所致，說明GEL與AG在水溶液中的結(jié)合與靜電吸引有關(guān)。此外，對于r＞7∶3的GEL-AG體系，在低pH值條件下，其Zeta電位為正，說明體系中存在過量的帶正電荷的GEL分子，未能與AG分子結(jié)合。GEL-AG體系濁度和Zeta電位隨pH值的變化趨勢與相反電荷離子的靜電相互作用規(guī)律相似，因此GEL與AG分子間以靜電相互作用為主[17]。

根據(jù)圖1a中GEL與AG質(zhì)量比r及體系pHc、pHopt繪制了體系狀態(tài)圖1c。由圖1a、c可知，對于r＜4∶6的體系，降低pH值，濁度沒有明顯變化，濁度曲線均未出現(xiàn)明顯拐點，即始終不能生成大量GEL-AG靜電復(fù)合物。隨著r的升高，體系的pHc和pHopt均顯著升高，r=9∶1時，pHopt升高至4.42。這表明，提高體系中GEL的比例，便可以在較高pH值條件下獲得GEL-AG靜電復(fù)合物[13]。這主要是由于r的升高提供了更多的可與AG作用的電正性GEL分子，促進(jìn)了GEL-AG不溶性復(fù)合物的形成，從而在較高pH值下形成濁度曲線的拐點[7]。

根據(jù)體系狀態(tài)，圖1c可分為3 個區(qū)域，分別為單相區(qū)、不溶性復(fù)合物區(qū)和可見聚集體沉淀區(qū)。在單相區(qū)，溶液的pH值位于pHc和5.5之間，體系透明，主要由單分子GEL、AG和可溶性GEL-AG復(fù)合物組成。在該pH值條件下，GEL的去質(zhì)子化作用較弱[14,18]，難以與AG通過靜電引力形成不溶性復(fù)合物。溶液的pH值在pHopt和pHc之間時，GEL因pH值的降低而帶有更多正電荷，GEL與AG的靜電相互作用強烈，迅速形成大量不溶性復(fù)合物。根據(jù)圖1b，此時GEL-AG復(fù)合物間存在較強的電荷排斥作用，電荷斥力使GEL-AG能穩(wěn)定于溶液中，渾濁而不沉淀，因此濁度迅速升高。對于溶液pH低于pHopt的區(qū)域，根據(jù)圖1b，GEL-AG復(fù)合物Zeta電位絕對值接近于0，互相排斥作用大幅降低[14]，不溶性復(fù)合物快速聚集產(chǎn)生大量沉淀，體系迅速澄清，濁度降低。這可能是由于陰離子多糖AG骨架堅硬，電荷密度高，與帶正電荷的GEL相互作用強烈，產(chǎn)生大量抗衡離子，導(dǎo)致GEL-AG復(fù)合物去溶劑化，形成宏觀相分離并沉淀。據(jù)報道，GEL與阿拉伯膠[3]、豌豆蛋白與甜菜果膠[14]、牛奶蛋白與黃芪膠/波斯膠[19]等蛋白質(zhì)-多糖體系在低于pHopt時也會產(chǎn)生大量沉淀。

2.2 GEL和AG總質(zhì)量濃度CT對其相互作用的影響

蛋白質(zhì)-多糖體系中，2 種大分子因靜電而相互作用，但只有當(dāng)CT達(dá)到一定程度時，兩者才可能通過靜電引力形成復(fù)合物[13]。圖2為不同CT的GEL-AG體系（r=7∶3）在酸滴定過程中的濁度，體系的pHc、pHopt見表1。由圖2可知，在相同pH值條件下，CT越高，體系濁度越大，這可能是因為提高CT后，GEL和AG分子質(zhì)量濃度升高，大分子間相互作用機會增多，生成更多的GEL-AG不溶性靜電復(fù)合物[7]。由表1可知，提高CT，體系的pHc和pHopt均升高，CT從0.25 g/L提高至2.00 g/L時，pHc從3.5上升到5.2，pHopt從2.4上升到3.3。這表明提高CT，體系可以在較高的pH值條件下生成不溶性靜電復(fù)合物。Razzak等[7]也有相似的報道。而CT較低時，GEL需要依靠低pH值環(huán)境產(chǎn)生更多正電荷以增強GEL與AG分子間相互作用，才能形成復(fù)合物或沉淀。Sarika等[20]在研究GEL與阿拉伯膠靜電復(fù)合時發(fā)現(xiàn)，提高CT可以提高體系的pHc。

圖2 酸滴定過程中不同CT的 GEL-AG體系溶液的濁度（r=7∶3）Fig. 2 Turbidity of GEL-AG system at different CT during acid titration (GEL-to-AG ratio = 7:3)

表1 不同CT的GEL-AG體系溶液的pHc和pHoptTable 1 pHc and pHoptof GEL-AG system at different CT

2.3 鹽離子和尿素對GEL與AG相互作用的影響

根據(jù)圖3和表2，NaCl濃度對GEL-AG體系的濁度有明顯的影響。未添加NaCl時，體系的最大濁度為69.3%，添加0.02 mol/L的NaCl并沒有明顯改變體系的最大濁度，但體系的pHc和pHopt明顯升高。NaCl濃度大于0.02 mol/L時，隨著NaCl濃度的升高，體系的最大濁度顯著降低，pHc和pHopt也隨之降低。NaCl濃度達(dá)到0.20 mol/L時，體系濁度很低，降低pH值對GEL-AG體系濁度影響并不顯著，不能形成對應(yīng)的pHc和pHopt。NaCl對蛋白-多糖體系的影響趨勢與已有研究結(jié)果一致[21]。這說明適當(dāng)濃度的NaCl（＜0.02 mol/L）可以促進(jìn)GEL與AG作用，有利于在較高pH值環(huán)境下形成GEL-AG靜電復(fù)合物，而過高濃度的NaCl（＞0.02 mol/L）則抑制GEL-AG靜電復(fù)合物的形成。這可能是由于GEL大分子同時含有正電基團(tuán)和負(fù)電基團(tuán)，加入的鹽離子較少時，GEL大分子的部分負(fù)電基團(tuán)被Na＋屏蔽，德拜長度減小，導(dǎo)致GEL負(fù)電基團(tuán)與AG分子間的長程排斥力減弱[22]，表現(xiàn)為GEL正電基團(tuán)與AG的相互吸引作用加強，有助于不溶性復(fù)合物的形成。然而，隨著NaCl濃度的繼續(xù)升高，鹽離子對GEL正負(fù)基團(tuán)均產(chǎn)生屏蔽作用，生物大分子德拜長度進(jìn)一步減小，導(dǎo)致GEL與AG分子間的短程吸引也被屏蔽[20,23]，難以通過靜電吸引形成不溶性復(fù)合物。此外，高濃度的鹽離子還會引起GEL溶解度降低，也不利于不溶性復(fù)合物的形成和聚集。

圖3 酸滴定過程中不同NaCl濃度下GEL-AG體系的濁度Fig. 3 Turbidity of GEL-AG system at different NaCl concentrations during acid titration

表2 不同NaCl濃度GEL-AG體系的pHc和pHoptTable 2 pHc and pHoptof GEL-AG system at different NaCl concentrations

尿素作為一種具有競爭性的氫鍵形成劑，能夠破壞分子間的氫鍵和疏水相互作用[13]。本實驗參考Razzak等[7]的方法，在體系中添加尿素，考察r=7∶3的GEL-AG體系在酸滴定過程中的濁度變化，以研究氫鍵、疏水等非靜電相互作用對GEL和AG相互作用的影響。如圖4所示，添加尿素前后，體系的最大濁度分別為69.3%和71.5%，并未發(fā)生明顯變化，即尿素對GEL-AG不溶性復(fù)合物的形成沒有明顯影響。這說明GEL和AG分子間的作用力與氫鍵、疏水等非靜電相互作用無關(guān)。但添加尿素后，體系濁度曲線向高pH值方向偏移，pHopt從2.6上升到3.2，這可能是因為尿素改變了蛋白質(zhì)及多糖分子周圍的水相結(jié)構(gòu)，增加了疏水性氨基酸的溶解度[24]，從而促進(jìn)了靜電作用較早（較高pH值）的發(fā)生。

圖4 酸滴定過程中尿素對混合溶液濁度的影響Fig. 4 Effect of urea on the turbidity of GEL-AG system during acid titration

2.4 可溶性GEL-AG復(fù)合物的測定結(jié)果

圖5 混合溶液在664 nm和615 nm波長處吸光度比Fig. 5 Ratio of absorbance at 664 nm to that at 615 nm of the mixture solutions

由圖5a可知，pH值為6.0時，在不同質(zhì)量濃度的AG溶液中添加5 mg/L的MB溶液，R664/615隨著AG質(zhì)量濃度的升高呈先降低后升高的趨勢。R664/615的降低說明MB單體減少[7]，這很可能是帶正電的MB分子與帶負(fù)電的AG分子發(fā)生了靜電相互作用，減少了游離狀態(tài)的MB。當(dāng)AG質(zhì)量濃度為1.4 g/L時，R664/615最小，表明此時MB單體濃度最低，形成的MB-AG靜電復(fù)合物最多。AG質(zhì)量濃度超過1.4 g/L時，R664/615上升，這可能是由于過量的AG分子間形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致吸光度變化[16]。

圖5b中，固定AG質(zhì)量濃度為1.4 g/L，MB質(zhì)量濃度為5 mg/L，GEL質(zhì)量濃度從0 g/L逐漸增加至3.0 g/L。在pH 6.0或pH 8.0的條件下，體系的R664/615均隨著GEL質(zhì)量濃度的增加而迅速升高，當(dāng)GEL質(zhì)量濃度超過2.0 g/L時保持穩(wěn)定。R664/615增加表明體系中游離的MB質(zhì)量濃度升高，這可能是由于GEL和MB分子存在競爭關(guān)系，兩者均可與AG分子發(fā)生靜電相互作用，這種競爭作用迫使MB-AG靜電復(fù)合物解離為MB分子和AG分子[13]，AG與GEL形成GEL-AG靜電復(fù)合物，導(dǎo)致體系中游離MB濃度升高，吸光度升高。但根據(jù)圖1a，當(dāng)pH＞5.0時，GEL-AG體系濁度很低，并未生成GEL-AG不溶性復(fù)合物，說明該條件下形成了GEL-AG可溶性復(fù)合物。根據(jù)Zeta電位測定結(jié)果（圖1b），pH＞5.0時，GEL和AG兩種大分子均帶負(fù)電荷，之所以能夠形成GEL-AG可溶性復(fù)合物，可能是由于GEL分子中帶正電基團(tuán)對AG存在靜電吸引作用，將AG分子定位于GEL分子上而形成復(fù)合物[19]。Dong Die等[25]也據(jù)此解釋了pH 5.6時，均呈電負(fù)性的大豆蛋白和阿拉伯膠之間存在靜電相互作用的現(xiàn)象。Razzak[13]和Yang Yadong[16]等也證實，在高于GEL等電點時，呈電負(fù)性的魚皮GEL可以分別與透明質(zhì)酸、阿拉伯膠形成可溶性靜電復(fù)合物。以上分析說明，在高于GEL等電點時，無論在酸性條件（pH 6.0）還是堿性條件（pH 8.0）下，均可形成GEL-AG可溶性復(fù)合物。

2.5 等溫滴定曲線及熱動力學(xué)分析

利用等溫滴定微量熱技術(shù)可以直接測定復(fù)合物形成過程中的熱量變化[14]。將一定質(zhì)量濃度的GEL溶液每隔一定時間逐滴注射入AG溶液中，通過測定滴定過程中熱量的變化探究帶相反電荷的GEL與AG分子的相互作用（圖6）。圖6a中每個峰代表注射1 次后體系的熱量變化，帶正電荷的GEL分子滴入帶負(fù)電的AG溶液中，通過靜電作用迅速與AG分子結(jié)合，能量為負(fù)表示結(jié)合過程放出一定熱量。因此GEL與AG分子的結(jié)合是一個放熱過程，這有利于體系能量的降低，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。蛋白質(zhì)與多糖的結(jié)合過程較多的表現(xiàn)為放熱過程[25]。隨著注射的進(jìn)行，GEL分子含量升高，峰面積逐漸減小，在第11次滴定后變化不再明顯，這表明GEL與AG結(jié)合反應(yīng)過程逐漸結(jié)束，之后的小穩(wěn)態(tài)峰為注射過程的稀釋熱引起。

圖6 GEL等溫滴定AG的ITC熱譜線（a）和等溫結(jié)合曲線（b）Fig. 6 Thermogram (a) and binding isotherm (b) during the titration of AG with GEL

由表3可知，在沒有添加NaCl時，GEL與AG物質(zhì)的量比N=1.22，即每1 mol AG分子結(jié)合1.22 mol GEL分子，GEL與AG有很高的結(jié)合常數(shù)（K=2.39×106L/mol），說明GEL與AG的結(jié)合反應(yīng)強烈，吉布斯自由能減少表明反應(yīng)可自發(fā)進(jìn)行，焓變ΔH為-18.8 kcal/mol，進(jìn)一步說明該過程為焓驅(qū)動下的放熱反應(yīng)。而熵的減少可能是由于GEL分子的側(cè)鏈阻礙了GEL與AG的靜電作用[26]。

表3 不同離子強度下GEL-AG結(jié)合熱動力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of interactions between GEL and AG at different ionic strengths

由表3可知，加入不同濃度的NaCl，體系吉布斯自由能均減少，說明GEL與AG的結(jié)合反應(yīng)始終可以自發(fā)進(jìn)行。與未添加NaCl的過程相比，NaCl濃度為0.02 mol/L時，N升高至1.63，結(jié)合常數(shù)K升高至3.03×106L/mol，焓變ΔH由-18.80 kcal/mol變?yōu)?21.30 kcal/mol，說明0.02 mol/L的NaCl促進(jìn)了GEL與AG的結(jié)合，結(jié)合過程釋放了更多的熱量。這可能是由于較低的鹽離子濃度篩選出更多的結(jié)合位點，提高了物質(zhì)的量比N，從而促進(jìn)GEL和AG結(jié)合[27]。但隨著NaCl濃度由0.02 mol/L逐漸升高至0.20 mol/L，N從1.63顯著降低至0.24，每1 mol AG分子僅僅結(jié)合了0.24 mol GEL分子，結(jié)合常數(shù)K也顯著降低，說明較高的鹽離子濃度顯著降低了GEL與AG的結(jié)合能力。這與濁度滴定實驗結(jié)果一致。隨著NaCl濃度的提高，焓變ΔH和熵變ΔS逐漸由負(fù)轉(zhuǎn)正，說明結(jié)合過程由放熱逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槲鼰?，體系的熵逐漸升高，即結(jié)合過程逐漸由焓驅(qū)動轉(zhuǎn)變?yōu)殪仳?qū)動[28]。較高鹽離子濃度抑制GEL與AG的結(jié)合可能與鹽離子的靜電屏蔽效應(yīng)有關(guān)，靜電屏蔽減少了GEL和AG的結(jié)合位點[29]，限制了GEL與AG的靜電作用。Xiong Wenfei等[27]報道，0.4 mol/L的鹽離子可以抑制卵白蛋白和羧甲基纖維素間的靜電引力和反向離子釋放。另外，較高的NaCl濃度會引起蛋白質(zhì)構(gòu)象自由度的變化，促進(jìn)了氫鍵的作用，從而引起熵增加[30]，導(dǎo)致結(jié)合過程逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殪仳?qū)動。

3 結(jié) 論

通過濁度滴定、ITC滴定、Zeta電位測定等實驗，研究了常溫下GEL與AG的相互作用影響因素及作用機制，探明了如下幾條作用規(guī)律：1）GEL與AG的結(jié)合以靜電相互作用為主，氫鍵和疏水相互作用較弱。結(jié)合過程是焓驅(qū)動自發(fā)進(jìn)行的放熱過程，結(jié)合常數(shù)很大，結(jié)合能力很強。2）NaCl的加入對兩者的相互作用影響明顯，NaCl濃度低于0.02 mol/L時，促進(jìn)靜電復(fù)合物的形成；NaCl濃度高于0.02 mol/L時，限制了GEL與AG的靜電作用；繼續(xù)提高NaCl濃度，結(jié)合過程逐漸由放熱轉(zhuǎn)變?yōu)槲鼰帷?）提高GEL和AG質(zhì)量比r或總質(zhì)量濃度CT，或者降低環(huán)境pH值，均可顯著促進(jìn)兩者的相互作用，形成不溶性復(fù)合物，但較高pH值下易形成可溶性復(fù)合物。r=7∶3的體系具有較高的pHopt，可形成較為穩(wěn)定的復(fù)合物懸濁液。本研究所得規(guī)律可為新型GEL-AG基生物材料的開發(fā)及其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用提供理論依據(jù)。